阅读说明：本技术 一种yap抑制剂及其筛选方法与应用 (YAP inhibitor and screening method and application thereof ) 是由 张还添 查振刚 桂涛 黎贞燕 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种YAP抑制剂的筛选方法,该方法利用各带一半荧光基团的TAZ与YAP重组质粒转染细胞,构建得到异源二聚体为筛选剂从而可以通过荧光强度来筛选YAP的抑制剂。筛选得到的YAP抑制剂将有助于推动相关抗肿瘤药物的制备,提高骨及软骨肉瘤相关药物的疗效,并为新药物研发提供线索。(The invention discloses a screening method of a YAP inhibitor, which utilizes TAZ and YAP recombinant plasmids with half of fluorescent groups to transfect cells, constructs heterodimers as a screening agent and screens the YAP inhibitor through fluorescence intensity. The screened YAP inhibitor is helpful to promote the preparation of related antitumor drugs, improve the curative effect of bone and chondrosarcoma related drugs, and provide clues for the research and development of new drugs.)

一种YAP抑制剂及其筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及YAP抑制剂的筛选方法及应用。

背景技术

骨肉瘤是一种儿童及青少年常见的原发性恶性肿瘤，其临床预后极差，严重威胁着患者的生命，给家庭及社会带来沉重的经济和精神负担。

目前，骨肉瘤发病的分子机制仍不清楚，主要包括：

1)成骨细胞发育相关信号通路如Hedghog，RUNX2，Hippo/YAP，BMP,Wnt/β-catenin，PKC等的异常；

2)转移相关信号通路如Notch、Fas/FasL、Ezrin、CXCR4、VEGF、MMP-2和MMP-9等的异常。

3)关键基因的突变或失活。针对当前骨肉瘤的发病机制，目前主要采取早期手术切除联合新辅助化疗等综合治疗。

然而，按照当前的治疗方案，复发性骨肉瘤及转移性骨肉瘤患者5年的生存率并没有得到明显提高，且临床高剂量化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素及顺铂等药物的使用具有较大的副作用。

软骨肉瘤(Chondrosarcoma)起源于软骨***或软骨，发病率在恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤，约占骨恶性肿瘤10～20％。软骨肉瘤对传统的化疗和放疗极不敏感，手术切除仍是当前治疗的主要方法。然而，由于缺乏有效的辅助治疗，部分患者在手术切除后仍会复发。另外，软骨肉瘤的临床预后极差，严重威胁着患者的生命，给家庭及社会带来沉重的经济和精神负担。

Hippo-YAP通路是近年来发现的具有调节器官体积、维持细胞增殖凋亡平衡的信号通路，与肿瘤细胞的失控性增殖密切相关。哺乳动物中Hippo-YAP通路的主要功能是抑制转录调节因子YAP和TAZ的活性而负调控肿瘤的进程，因而Hippo通路也被认为是抑癌通路。具体来说，该通路的核心成员包括丝氨酸/苏氨酸激酶MST1、MST2、LATS1及LATS2，支架蛋白SAV1(与MST1和MST2结合)、MOB1(与LATS1和LATS2结合)，转录共激活子YAP，及包含TEA结合域的转录因子TEAD。简而言之，当Hippo通路激活时，MST1/2激酶磷酸化激活LATS1/2，激活的LATS1/2进而磷酸化YAP，磷酸化的YAP失活并随后出核，而细胞质内的YAP被蛋白酶体降解。

研究证实，Hippo通路参与多种肿瘤如肺癌、结肠癌、卵巢癌、***癌、肝癌等的进展。然而，在人类肿瘤中，Hippo通路的基因突变较少发生。基于此，得出人类肿瘤中Hippo通路的失调除了源自Hippo通路本身关键蛋白的突变之外，更多的是由于肿瘤细胞内其它异常表达的蛋白或信号通路与Hippo通路之间交叉对话。另外，Hippo信号通路在肿瘤中的作用与YAP/TAZ的核转位密切相关。最近，在多种肿瘤中发现YAP呈高表达，这与高的病理分级，晚期TNM阶段，***转移等相关，且存在细胞核定位的现象。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于荧光检测的YAP抑制剂的筛选方法。该方法通过利用各带一半荧光基团的表达YAP基因的重组质粒和表达TAZ基因的重组质粒所诱导表达的异源二聚体，能通过荧光信号的强弱变化而快速、有效地筛选出YAP抑制剂。

本发明的目的之二在于提供一种由该筛选方法得到的YAP抑制剂。

本发明的目的之三在于提供该YAP抑制剂在制备骨肿瘤药物中的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种YAP抑制剂的筛选方法，包括：

设计引物：设计扩增YAP基因的引物对和TAZ基因的引物对；

制备重组质粒：构建表达YAP基因的重组质粒，构建表达TAZ基因的重组质粒；其中，表达YAP基因的重组质粒和表达TAZ基因的重组质粒各带一半的荧光基团；

融合：将表达YAP基因的重组质粒和表达TAZ基因的重组质粒通过6μL lipo2000转染入细胞中，诱导表达得到异源二聚体；

构建筛选模型：将待筛选的抑制剂加入已表达荧光的细胞的培养基中，处理24-48h，若荧光强度减弱，则该抑制剂为YAP的有效抑制剂。

具体地，异源二聚体的融合方式是将1μg表达YAP基因的重组质粒和1μg表达TAZ基因的重组质粒通过6μL的lipo2000转染入细胞中，诱导表达得到异源二聚体。

进一步地，设计引物步骤中，所述TAZ的上游引物如SEQ IDNo.1所示，所述TAZ的下游引物如SEQ IDNo.2所示。

进一步地，设计引物步骤中，所述YAP的上游引物如SEQ IDNo.3所示，所述YAP的下游引物如SEQ IDNo.4所示。

进一步地，制备重组质粒步骤中，表达YAP和TAZ基因的载体质粒均为双分子荧光互补载体质粒。

进一步地，制备重组质粒步骤中，表达YAP基因的载体质粒为pCMV-Myc-VN155-Linker-MCS。

进一步地，制备重组质粒步骤中，表达TAZ基因的载体质粒为pCMV-HA-VC155-Linker-MCS。

进一步地，制备重组质粒步骤中，以人293T细胞cDNA为模版扩增人TAZ和YAP基因。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

由上述的筛选方法得到的YAP抑制剂。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

上述的YAP抑制剂在制备骨肿瘤药物中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明利用荧光互补载体构建的TAZ与YAP重组质粒转染细胞，构建得到异源二聚体为筛选剂，通过荧光强度的变化来检测抑制剂对YAP基因的表达的抑制程度以及对诱导细胞周期阻滞；筛选出的YAP抑制剂在制备骨肿瘤药物中具有较大的应用潜力。

附图说明

图1为YAP在不同分化程度的骨肉瘤组织中的荧光定位图；

图2为YAP在不同分化程度的软骨肉瘤组织中的荧光定位图；

图3为YAP在软骨细胞系及软骨肉瘤细胞中的荧光定位图；

图4为siRNA敲低YAP对软骨肉瘤细胞SW 1353的影响图；

图5为shRNA敲低YAP对软骨肉瘤细胞SW 1353的影响图；

图6为敲低YAP抑制裸鼠移植瘤的生长效果图；

图7为表达TAZ基因的重组质粒图谱；

图8为表达YAP基因的重组质粒图谱；

图9为JQ1对YAP在SW 1353和Hs 819.T细胞中表达的影响；

图10为17-AAG对YAP在U2 OS及Saos-2细胞中表达的影响；

图11为17-AGG对U2 OS及Saos-2诱导细胞周期阻滞；

图12为5-AZA对YAP在U2 OS及Saos-2细胞中表达的影响；

图13为5-AZA对U2 OS及Saos-2诱导细胞周期阻滞。

图14为表达TAZ基因的重组质粒与表达YAP基因的重组质粒在SW 1353细胞中相互融合发出荧光的示意图。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

YAP基因由暨南大学附属第一医院中心实验室肿瘤组赠，根据NCBI网站查找人TAZ(NM_000116.5)的CDS区序列，由人cDNA序列经PCR扩增而得；pCMV-HA-VC155-Linker-MCS及pCMV-Myc-VN155-Linker-MCS质粒由美国普渡大学医学化学与分子药理学系终身教授胡长灯教授赠。

软骨肉瘤组织芯片是通过市售的途径获得。

本发明通过合成YAP与TAZ的异源二聚体，用其作为

实施例1：YAP在骨肉瘤组织及软骨肉瘤中的表达及定位

为了进一步系统探讨YAP在骨肉瘤中的生物学意义，我们采用组织芯片结合免疫组化方法检测YAP在不同分化程度骨肉瘤和软骨肉瘤组织中的表达。

将购买的软骨肉瘤组织芯片(US Biomax，包括不同分化程度骨肉瘤及软骨肉瘤组织)进行标准的免疫组化实验，片子经Aperio Scanscope XT(Leica,Germany)仪器扫描成像，观察分析YAP在不同分化程度骨肉瘤及软骨肉瘤中的定位和表达。免疫组化结果如图1-A和图2-A所示；免疫组化结果(包含临床随访资料)由两位经验丰富的病理科医师阅片评分，统计学方法分析YAP的表达与软骨肉瘤分化程度及患者生存预后的相关性，其中半定量统计学方法分析结果如图1-B和2-B所示，细胞定位统计学分析结果如图1-C和2-C所示。

免疫组化的评分标准：设定染色强度和染色百分比两个参数。染色强度分为0-3四个等级(-，+，++，+++)。将阳性细胞的百分比定义为0-10(例如，1代表10％的细胞被染色，与染色强度无关；10代表100％的细胞被染色)。染色总得分(0-30)＝染色轻度×阳性细胞百分比。分别判定细胞核(0-30)及细胞质(0-30)的评分，则细胞染色的总得分为(0-60)。

由图1-A与1-B的结果可知：YAP的表达水平与骨肉瘤分化程度呈负相关。图1-C结果提示细胞质以及细胞核中的YAP的表达与骨肉瘤的发病密切相关。

由图2-A与2-B的结果可知：YAP的表达水平与软骨肉瘤分化程度呈负相关。这些结果提示YAP的高表达与软骨肉瘤发病相关，且细胞核中的YAP可能起主要作用。

实施例2：YAP的亚细胞定位

软骨细胞系CHON-001及软骨肉瘤细胞系SW 1353购买于ATCC。软骨肉瘤细胞系Hs819.T购买于北纳创联生物技术研究院。

种24孔板，放入多聚赖氨酸包埋的玻片，根据细胞倍增时间设定高、低两个细胞密度。待细胞贴壁后取出盖玻片，PBS漂洗，4％多聚甲醛固定，0.2％Triton X-100打孔处理30min，5％non-fat dry milk室温封闭1h，加入(稀释度1：1000)一抗工作液(YAP)，4℃过夜，PBS洗涤2～3次，再加Alexa Flour 488标记的荧光二抗/DAPI/phalloidin-AlexaFlour 573复合物室温下孵育1h，PBS漂洗后中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，实验对照用未诱导的细胞爬片染色。激光共聚焦显微镜下观察YAP的亚细胞定位。

同样，如图3-A所示，在软骨细胞CHON-001中，YAP主要定位在细胞质。有趣的是，如图3-B所示，在软骨肉瘤SW 1353细胞中，YAP主要定位于细胞核。这些结果提示：细胞质的YAP的确有助于维持软骨表型，而YAP的细胞核转位可能参与了软骨肉瘤的发生。

实施例3：一种敲低YAP的siRNA试剂盒

一种敲低YAP的siRNA试剂盒，含有siY#1、siY#2、siY#3和siY#4中的一种或两种以上，其序列依次如下所示：

siY#1，SEQ ID No.1：GACGACCAAUAGCUCAGAUTT；

siY#2，SEQ ID No.2：GCAUCUUCGACAGUCUUCUTT；

siY#3，SEQ ID No.3：GGUCAGAGAUACUUCUUAATT；

siY#4，SEQ ID No.4：GGUGAUACUAUCAACCAAATT。

Western Blot(WB)检测YAP的表达：取对数生长期的软骨肉瘤细胞系接种于6cm的培养皿，处理后提取细胞总蛋白，加入5×SDS缓冲液(稀释成1×)，95℃煮5min。取20-30μg蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，浓缩胶5％，分离胶8～15％，于100V进行电泳2h。以230mA转膜1h。取出PVDF膜，用封闭液(含5％non-fat dry milk)室温封闭1h，加1：1000稀释的一抗(YAP)，4℃过液，次日洗涤后加1：1000二抗(兔抗)，室温反应1h。洗涤后加1ml的ECL发光液室温下轻摇1min，用凝胶成像系统扫描，保存结果。如图4A-C所示，瞬时敲低YAP明显地抑制软骨肉瘤细胞生长。

分别采用siY#1-siY#4转染SW 1353细胞，4天后提取总蛋白，WB检测YAP及内参的表达如图4-A所示；相差显微镜下观察细胞形态学及数量如图4-B；台盼蓝染色并计数如图4-C所示。****p<0.0001,n.s.,p>0.05。

由本实施例可知，siRNA对骨肉瘤具有明显的抵制效果。

实施例4：一种敲低YAP的shRNA试剂盒

一种敲低YAP的shRNA试剂盒，包括siY#1、siY#2、siY#3和siY#4中的一种或两种以上和慢病毒干扰载体，其中，siY#1、siY#2、siY#3和siY#4的序列依次如下所示：

shY#1，SEQ ID No.5：CTTCTTAAATCACATCGATCA；

shY#2，SEQ ID No.6：CATAAGAACAAGACCACCTCT；

shY#3，SEQ ID No.7：CACAGGCAATGCGGAATATCA；

shY#4，SEQ ID No.8：CCTTAACAGTGGCACCTATCA。

慢病毒干扰载体为pGLV3/H1/GFP+Puro Vector，购自GenePharma Co,Ltd.。

采用LipoFECTamine2000将慢病毒载体的shRNA转染至HEK 293T细胞，6h后换液。48h后收集病毒上清，提取并浓缩。然后在10ml的完全培养基中，按照感染指数(MOI)为20的浓度感染SW 1353细胞24h，然后用2mg/mL的嘌呤霉素对其进行2代各3d的筛选而建立稳定细胞系。CCK-8法检测敲低YAP对细胞活力的影响：取对数生长期的SC或shYAP稳转细胞系，胰酶消化并计数，以2×10³/孔的密度接种到96孔板中(3个重复)，37℃培养箱中培养不同时点后，加入10μL CCK-8，将培养板在培养箱内孵育1-4h，测定450nm吸光度，评估细胞的增殖状况。

其中，A(处理)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；

A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；

A(无处理)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

敲低YAP的克隆形成实验：取对数生长期的SC或shYAP稳转细胞系，胰酶消化并计数，按照每孔1000个细胞的密度接种于6孔板。诱导9d后，去除培养基并用PBS洗涤3次。采用结晶紫溶液染色5min。光学显微镜下计数克隆(大于50细胞)数量，行统计学分析。

相似地，在稳定敲低YAP的细胞株(shY#3，shY#4)中得到了同样的抑制软骨肉瘤生长的结果，如图5A和5-B所示。另外，敲低YAP明显抑制了软骨肉瘤细胞克隆形成，如图5-C和5-D。结果说明，YAP表达对软骨肉瘤细胞的增殖至关重要。

实施例5：敲低YAP抑制裸鼠移植瘤的生长

本实施例使用shY#3和shY#4作为敲低试剂，采用裸鼠移植瘤模型探讨敲低YAP对移植瘤生长的影响。

将稳转细胞株(对照、shY#3、shY#4)接种于裸鼠皮下，9天后开始测定肿瘤体积(体积＝(长×宽²)/2)，每3天测定一次，第30天处死裸鼠。

结果如图6。如图6-A所示，随着时间的推移，敲低YAP显著地抑制裸鼠移植瘤的生长(n＝5)。如图6-B和6-C所示，在体及离体形态学计量发现，敲低YAP明显抑制移植瘤体积的增大。这些体内实验结果提示敲低YAP能显著抑制软骨肉瘤细胞增殖。

实施例6：YAP/TAZ异源二聚体筛选体系建立

1)引物设计：

设计TAZ基因的扩增引物对TAZ-SalI-F和TAZ-KpnI-R；TAZ-SalI-F和TAZ-KpnI-R的序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；设计YAP基因的扩增引物YAP-BglII-F和YAP-NotI-R如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

TAZ-SalI-F，SEQ ID No.9：CTGTCGACCATGCCTCTGCACGTGAAGTG；

TAZ-KpnI-R，SEQ ID No.10：CTGGTACCCTATCTCCCAGGCTGGAGGTG；

YAP-BglII-F，SEQ ID No.11:GAAGATCTCTATGGATCCCGGGCAGCAG；

YAP-NotI-R，SEQ ID No.12:

TAAAGCGGCCGCCTATAACCATGTAAGAAAGCTTTC；

2)构建重组质粒；

以人293T细胞cDNA及YAP基因为模板，PCR技术分别扩增人TAZ和YAP基因。TAZ基因及pCMV-HA-VC155-Linker-MCS经限制性内切酶SalI和KpnI双酶切后回收，T4连接酶将人TAZ基因***到线性化的pCMV-HA-VC155-Linker载体，构建pCMV-HA-VC155-Linker-TAZ重组质粒，质粒图谱如图7所示。

YAP基因及pCMV-Myc-VN155-Linker-MCS经限制性内切酶BglII和NotI双酶切后回收，T4连接酶将人YAP基因***到线性化的pCMV-Myc-VN155-Linker载体，构建pCMV-Myc-VN155-Linker-YAP重组质粒，质粒图谱如图8所示。

实施例7：YAP靶向抑制剂的筛选

1)JQ1对YAP在SW 1353及Hs 819.T细胞中表达的抑制作用

采用不同浓度的JQ1处理软骨肉瘤细胞系SW 1353及Hs 819.T细胞24小时，JQ1-2的浓度为2μM，JQ1-20的浓度为20μM；JQ1#1浓度为2μM；JQ1#2浓度为20μM；以DMSO作为对照，收集细胞全蛋白，加入实施例6得到的异源二聚体进行PCR扩增，采用WB检测YAP及内参的表达。

JQ1抑制YAP的表达量如图9所示，JQ1明显地下调YAP的表达。

2)17-AAG对YAP在U-2OS和Saos-2细胞中表达的抑制

用17-AAG和JQ1分别处理人骨肉瘤细胞(U-2OS)和人成骨肉瘤细胞(Saos-2)24h，收集细胞全蛋白，加入实施例6得到的异源二聚体进行PCR扩增，采用WB检测YAP及内参的表达；设置处理24h和48h的对比，用流式-细胞术周期检测诱导细胞周期的阻滞。

17-AAG和JQ1抑制YAP的表达量的结果如图10所示，JQ1几乎完全抑制YAP的表达，而17-AAG也能有效抑制YAP的表达。17-AAG诱导细胞周期的阻滞如图11所示，说明17-AAG不仅可以通过降低YAP的表达而抑制细胞增殖，还可能通过诱导G2/M期阻滞促进细胞的凋亡。

3)梯度浓度5-AZA对YAP在U-2OS和Saos-2中的表达的抑制

使用5-50μm的5-AZA作为抑制剂，处理人骨肉瘤细胞(U-2OS)和人成骨肉瘤细胞(Saos-2)24h，收集细胞全蛋白，以DMSO作为对照，加入实施例6得到的异源二聚体进行PCR扩增，采用WB检测YAP及内参的表达。设置处理24h和48h的对比，用流式-细胞术周期检测诱导细胞周期的阻滞。

5-AZA抑制YAP的表达量如图12所示，说明，5μm的5-AZA未能明显抑制YAP在U-2OS中的表达，但是10μm的明显抑制了YAP的表达，50μm的5-AZA可以有效抑制YAP的表达；但5μm的5-AZA能有效抑制YAP在U-2OS中的表达，50μm的5-AZA时，YAP基本上不表达；

诱导细胞周期的阻滞如图13所示，说明5-AZA可能通过降低YAP的表达，引起U-2OS细胞G1期细胞周期阻滞，抑制细胞增殖。

实施例8：荧光检测

将4000个SW 1353细胞种在3.5cm皿中，24h贴壁后将1μg表达YAP基因的重组质粒和1μg表达TAZ基因的重组质粒通过6μL的lipo2000转染入细胞中，转染4h，诱导表达得到异源二聚体，在共聚焦显微镜下观察。表达TAZ基因的重组质粒与表达YAP基因的重组质粒融合发出荧光示意图如图14所示，共聚焦显微镜下观察到荧光，说明表达YAP基因的重组质粒和表达TAZ基因的重组质粒发生了融合。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一种YAP抑制剂及其筛选方法与应用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacgaccaau agcucagaut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaucuucga cagucuucut t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggucagagau acuucuuaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggugauacua ucaaccaaat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttcttaaat cacatcgatc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cataagaaca agaccacctc t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cacaggcaat gcggaatatc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccttaacagt ggcacctatc a 21

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgtcgacca tgcctctgca cgtgaagtg 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctggtaccct atctcccagg ctggaggtg 29

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaagatctct atggatcccg ggcagcag 28

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taaagcggcc gcctataacc atgtaagaaa gctttc 36