阅读说明：本技术 一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法 (Green fluorescent protein gene labeling method of acinetobacter baumannii ) 是由 余道军 潘平 于 2020-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种绿色荧光蛋白基因标记鲍曼不动杆菌的方法,构建了pET-RA-Y大肠杆菌-鲍曼不动杆菌穿梭质粒(包含启动子序列、GFP序列、鲍曼不动杆菌基因复制起始点序列、利福平抗性筛选标记),并导入到鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978中。在荧光显微镜下观察,菌体呈现绿色荧光。本发明还建立了荧光标记鲍曼不动杆菌感染细胞模型,用于本方法构建的荧光标记鲍曼不动杆菌的稳定性与可靠性,为研究细菌致病因子的生物学作用及细菌与宿主相互作用情况提供技术支撑,绿色荧光蛋白基因的导入为研究鲍曼不动杆菌与宿主的相互关系提供了一种简单而直观的方法。(The invention provides a method for marking acinetobacter baumannii by a green fluorescent protein gene, which constructs pET-RA-Y escherichia coli-acinetobacter baumannii shuttle plasmid (comprising a promoter sequence, a GFP sequence, an acinetobacter baumannii gene replication starting point sequence and a rifampicin resistance screening marker) and introduces the pET-RA-Y escherichia coli-acinetobacter baumannii shuttle plasmid into an acinetobacter baumannii standard strain ATCC 17978. The cells showed green fluorescence when observed under a fluorescence microscope. The invention also establishes a fluorescence labeling acinetobacter baumannii infected cell model, is used for the stability and reliability of the fluorescence labeling acinetobacter baumannii constructed by the method, provides technical support for researching the biological action of bacterial pathogenic factors and the interaction condition of bacteria and hosts, and provides a simple and visual method for researching the mutual relationship between the acinetobacter baumannii and the hosts by introducing the green fluorescent protein gene.)

一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法，使用穿梭质粒得到能稳定表达绿色荧光蛋白的鲍曼不动杆菌荧光标记菌株、及其构建方法与用途。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbanumannii，Ab)为革兰阴性杆菌，在致病性不动杆菌属(Acinetobacterspp.)中位居首位。作为国内院内感染的重要病原菌之一，鲍曼不动杆菌主要在重症监护室和免疫力低下人群中引起上呼吸道感染、尿道炎、导管相关性菌血症、烧伤后伤口感染、脑膜炎等，同时也易在医疗器械等环境表面定植、粘附，从而对患者生命造成严重威胁。尤其近年来，随着多重耐药性和泛耐药性鲍曼不动杆菌菌株数量的逐年上升，以及全耐药菌的不断出现，更是给临床治疗带来严重的挑战。研究表明，生物膜形成、蛋白分泌系统、群体感应系统等可通过影响细菌毒力、降低细菌对抗生素的敏感性，增加细菌对宿主的侵袭、感染等从而提高对鲍曼不动杆菌致病性。因此，目前对鲍曼不动杆菌的研究主要集中在对其致病因子表达调控网络，毒力因子特异抗体的制备，新型药物靶点的寻找等。

在这些研究中，如需明确致病因子的生理、病理学功能，必定涉及鲍曼不动杆菌与宿主之间的关系，因此要探究鲍曼不动杆菌与宿主相互作用过程中致病因子表达网络的调控机制，需要有效的方式以实时观测到细菌在宿主内的行为状态。荧光蛋白标记系统作为一种分子标记技术可直观观测到病原菌与宿主相互作用的过程，因而被广泛应用于细胞生物学。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，即鲍曼不动杆菌(Ab)荧光标记菌株荧光信号弱、表达不稳定、荧光易衰减、构建方法比较繁琐等，提供一种稳定表达绿色荧光蛋白的鲍曼不动杆菌菌株构建方法，包括构建pET-RA-Y大肠杆菌-鲍曼不动杆菌穿梭质粒，并将该穿梭质粒导入鲍曼不动杆菌中，使得鲍曼不动杆菌能够稳定表达绿色荧光蛋白，且整个实验流程较为简单，费用低廉，所构建的荧光标记的鲍曼不动杆菌能够长时间保存而荧光不衰减。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法，所述荧光标记鲍曼不动杆菌是采用基因合成法构建本研究使用的质粒pET-RA-Y。pET-RA-Y包含启动子序列、GFP(绿色荧光蛋白，Green fluorescent protein)序列、鲍曼不动杆菌基因复制起始点、利福平抗性筛选标记等。另外，本发明还建立了荧光标记鲍曼不动杆菌感染细胞模型，以验证鲍曼不动杆菌导入荧光质粒后对其感染细胞力(粘附/侵袭细胞)的影响，用于检验上述方法构建的荧光标记鲍曼不动杆菌的稳定性与可靠性，为研究细菌致病因子的生物学作用及细菌与宿主相互作用情况提供技术支撑。包括以下步骤：

1.构建pET-RA-Y大肠杆菌-鲍曼不动杆菌穿梭质粒以Genebank(NO.HM219006.1)上pET-RA序列为基础序列模板(附图1-A)，采用基因合成法构建本研究使用的质粒pET-RA-Y(附图1-B)。pET-RA-Y序列(SEQ ID NO.1)包含启动子序列(SEQ ID NO.2)、GFP序列(SEQID NO.3)、利福平抗性筛选标记(SEQ ID NO.4)、鲍曼不动杆菌基因复制起始点(SEQ IDNO.5)等。

2.制备鲍曼不动杆菌感受态细胞，将pET-RA-Y大肠杆菌-鲍曼不动杆菌穿梭质粒导入到鲍曼动杆菌标准菌株ATCC17978中，并进行鉴定

取5μLpET-RA-Y加入含100μLE.coliDH5α感受态细胞中，构建pET-RA-Y大肠杆菌，另制备鲍曼动杆菌标准菌株ATCC17978感受态细胞，将pET-RA-Y大肠杆菌与其共培养，用pET-RA-Y-F/pET-RA-Y-R引物进行PCR，同时用菌株直接测序，检验pET-RA-Y是否成功导入鲍曼动杆菌标准菌株ATCC17978中，导入成功的菌株标记为Ab-GFP菌株。

3.荧光菌株观察:

将经过PCR及测序鉴定的Ab-GFP菌株行LB肉汤扩增培养，至肉眼可见明显浑浊时荧光显微镜观察菌株是否携带荧光。

4.荧光标记鲍曼不动杆菌的稳定性与可靠性检测；

(1)选择人肺泡上皮细胞作为宿主细胞,

(2)荧光标记菌株与人肺泡上皮细胞共培养,

(3)采用细胞荧光染色法，利用共聚焦荧光显微镜观察细菌感染细胞的模型，包括荧光标记鲍曼不动杆菌在细胞内外的荧光强度、荧光保持时间，并验证导入荧光质粒后对其感染细胞力(粘附/侵袭细胞)的影响。

本发明所构建的荧光标记的鲍曼不动杆菌是为了更直观研究细菌-宿主细胞相互作用(包括粘附/侵袭细胞等进程)的动态进程，为细菌感染细胞的分子机制研究提供技术基础。通过自建的细菌感染细胞模型，采用普通荧光显微镜就可以直观检测荧光标记的鲍曼不动杆菌感染宿主细胞的感染进程，并在细胞水平验证了所建立的荧光标记鲍曼不动杆菌荧光表达的稳定性、可靠性以及荧光强度，为相关细菌-细胞互作研究提供工具菌株。

本发明通过构建一种稳定表达绿色荧光蛋白标记的鲍曼不动杆菌菌株，实现对细菌的非破坏性标记，结合显微成像技术，为研究鲍曼不动杆菌致病因子网络系统调控机制及其在细菌与宿主相互作用过程中发挥的生物学功能等重要的生物学机制提供技术保障，从而实现实时观测鲍曼不动杆菌侵染宿主细胞的模型，为进一步阐明鲍曼不动杆菌致病机制奠定研究基础。

附图说明

图1是pET-RA序列图谱，其中A:基础序列模板；B：基因合成法构建本研究使用的质粒pET-RA-Y。

图2是经pET-RA质粒转化的24个单菌落PCR结果电泳图。

图3是荧光显微镜观察Ab-GFP菌株。

图4是共聚焦显微镜观察细菌粘附/侵袭细胞。图中DAPI：细胞核酸DAPI染色(白色方框内为显蓝色荧光的细胞核)；GFP：鲍曼不动杆菌荧光标记(白色圆圈内为显绿色荧光的Ab-GFP)：Phalloidin：红色为鬼笔环肽对细胞肌动蛋白进行染色；Merge(合并)：三重荧光合并显色(三角形内白点为侵入细胞内的白点Ab-GFP，作为细菌侵袭细胞的示意图)。400×。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明，以下实施仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。

实施例1Ab-GFP菌株构建

1.实验材料

人肺泡上皮细胞(Human alveolar epithelial cells,HPAEpiC)细胞株购自CELLBIO(编号：CBR130583)，RPMI 1640(吉诺，GNM31800)，RPMI 1640双抗(吉诺，GNM-31800-S),PBS缓冲液1×(吉诺，GNM20012),0.25％胰酶+EDTA(吉诺，GNM-25260)，胎牛血清(CAPRICORNSCIENTIFIC，FBS-11A)，琼脂粉(百思，BS1068)，蛋白胨(百思，BS7006)，酵母粉(百思，BS1069)，氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)，Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚，大连美仑生物技术有限公司，MB2486)，iFluor^TM 647phalloidin(鬼笔环肽-iFluor647偶联物，大连美仑生物技术有限公司，MB5939)，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Thermo，62247)，多聚甲醛(麦克林，P804536-500g)，牛血清白蛋白(上海源叶生物技术有限公司，S25762)，10×多聚赖氨酸(大连美仑生物技术有限公司，MA0174)。本发明所述的菌株、质粒及引物如表1。

表1菌株、质粒及引物

所述的启动子序列、GFP序列、利福平抗性编码基因序列、鲍曼不动杆菌基因复制起始点序列、pET-RA-Y序列见序列表。

2.试剂配制方法

0.1％Triton X-100：取100μL Triton X-100至100mL PBS中溶解，4℃储存备用。

4％多聚甲醛：称取4g多聚甲醛于100mL PBS，充分溶解后4℃保存备用。

0.01％多聚赖氨酸：取10μL 10×多聚赖氨酸原液至100mL灭菌水，配成0.01％多聚赖氨酸溶液，4℃保存备用。

DAPI：取1mL无菌水加至含10mgDAPI粉剂试剂瓶，完全溶解后得10mg/mL储存液，-20℃避光保存；取1mL10mg/mL DAPI储存液至10mL无菌蒸馏水中，配成1μg/mL工作液，分装后-20℃避光保存备用。

iFluor^TM 647phalloidin：加入30μLDMSO溶解染料粉末，制备成1000×phalloidin储存液，于-20℃避光保存；取1μL 1000×phalloidin储存液于1mL含1％BSA的PBS中充分溶解，分装后-20℃避光保存备用。

3.实验方法

3.1pET-RA-Y质粒制备

以Genebank(NO.HM219006.1)上pET-RA序列为基础序列模板(图1-A)，采用基因合成法构建本研究使用的质粒pET-RA-Y(图1-B)。pET-RA-Y包含启动子序列、GFP序列、鲍曼不动杆菌基因复制起始点、利福平抗性筛选标记等。

3.2E.coliDH5α(pET-RA-Y)构建，流程如下：

(1)5μLpET-RA-Y质粒加入含100μLE.coliDH5α感受态细胞中；冰浴20min，42℃热激60s，冰上10min；加入1mLLB液体培养基中，37℃，180rpm/min 60min；取100μL上清转化菌液涂至含100μg/mL Rif LB平板(含利福平的LB平板)，37℃倒置培养过夜；

(2)挑取单个菌落于100μg/mL RifLB肉汤扩增培养，至肉眼可见明显浑浊时，用pET-RA-Y-F/pET-RA-Y-R引物进行PCR，验证是否成功导入载体(反应体系见表2、表3)；

表2E.coliDH5α(pET-RA-Y)阳性克隆筛选PCR体系(50μL)

组成	体积(μL)
		2xPhanata Max Master Mix	25
pET-RA-Y-F	2
		pET-RA-Y-R	2
疑似E.coliDH5α(pET-RA-Y)阳性克隆菌液	2
		ddH<sub>2</sub>O	19

表3E.coliDH5α(pET-RA-Y)阳性克隆筛选PCR扩增程序

(3)PCR产物进行电泳凝胶验证，疑似阳性产物者进行测序验证；阳性菌标记为E.coliDH5α(pET-RA-Y)。

3.3鲍曼不动杆菌(Ab)感受态细胞的制备

(1)以无菌接种环取冻存的鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978菌种于LB平板划线，37℃培养过夜。

(2)次日挑取生长良好的单菌落于5mLLB液体培养基中37℃振荡培养过夜，按10％比例接种于100mLLB液体培养基中，扩大培养约2～4h，至OD₆₀₀值约为0.8。

(3)将培养物分装到两个50mL离心管中后放置于冰水混合物中10min。

(4)冰浴后，4℃4,000rpm离心5min。

(5)弃上清，每管加10mL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细菌沉淀，再次冰浴30min。

(6)冰浴后，4℃4,000rpm离心5min，用灭菌枪头吸出残留后，每管加冰预冷的0.1mol/L CaCl₂2 mL重新悬浮。

(7)每管分装成10小管后，将鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978感受态细胞4℃放置12h后放置到-70℃保存。

3.4Ab-GFP菌株构建

(1)将E.coliDH5α(pET-RA-Y)(100μg/mL Rif)作为供体菌，鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978感受态细胞(100μg/mL Tic和100μg/mL Amp)作为受体菌，E.coliHB101(pRK2013)(50μg/mL kan)辅助菌，分别培养至相应抗性板，37℃，5％CO₂培养过夜；分别挑取单克隆至含相应抗体的LB肉汤，37℃180rpm/min过夜培养。

(2)分别取1mLE.coliDH5α(pET-RA-Y)、鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978感受态细胞和E.coliHB101(pRK2013)培养物，用无抗LB肉汤洗涤3次，按照2:1:1(供体菌：受体菌：辅助菌)混合，取50μL无抗LB混合后涂布至无抗性LB，28℃过夜。

(3)于LB培养板上刮取适量菌于1mL无抗LB中混匀，取适量分别涂布于相应抗性板ATCC17978于Rif(10μg/mL)，37℃，5％CO₂培养过夜。

(4)挑取单个菌落于相应抗体LB肉汤扩增培养，至肉眼可见明显浑浊时，用pET-RA-Y-F/pET-RA-Y-R引物进行PCR，检验是否成功将pET-RA-Y导入鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中，反应条件及体系见表1、表2。

(5)PCR产物进行电泳凝胶验证(图2)，疑似阳性产物者进行测序验证，阳性菌标记为ATCC17978-GFP(Ab-GFP)。

3.5荧光标记鲍曼不动杆菌菌株(Ab-GFP)观察

取上述经过PCR及测序鉴定确认pET-RA-Y质粒成功导入鲍曼不动杆菌的菌液置荧光显微镜下，观察可见绿色荧光标记的细菌(图3)，表明绿色荧光蛋白标记的鲍曼不动杆菌菌株构建成功。

实施例2

1.荧光标记鲍曼不动杆菌感染细胞模型构建

鲍曼不动杆菌主要侵染呼吸道从而引起相关呼吸系统感染疾病的发生发展，因此在本发明中，将人肺泡上皮细胞(Human alveolar epithelial cells,HPAEpiC，细胞株购自CELLBIO，编号：CBR130583)作为研究细菌-宿主相互作用的细胞模型。结果如图4所示，经荧光显微镜观察，目前可成功构建鲍曼不动杆菌GFP标记菌株感染宿主细胞的模型，且可准确定位细菌与宿主细胞的相对位置，粘附或侵袭。为动态实时观测细菌与细胞相互作用研究，以及鲍曼不动杆菌相关致病因子的生物学功能提供基础实验技术。

相关实验步骤如下：

(1)盖玻片准备：将盖玻片清洗后，泡酸、再洗(自来水冲洗2遍后蒸馏水冲洗3遍)，高压灭菌后烘干，75％乙醇浸泡10min消毒，晾干后浸泡于恢复室温的0.1mg/mL多聚赖氨酸溶液5min，取出后室温干燥待用。

(2)细胞准备：为保证细胞生理学特征，实验所用人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)均在10代以内。细胞于37℃，5％CO₂，培养至60-80％细胞汇合，0.25％胰酶-EDTA消化细胞，并用新鲜的无抗RPMI 1640细胞培养液稀释细胞至相应密度并接种至铺有盖玻片的细胞培养板，用无抗无血清RPMI 1640于37℃，5％CO₂培养24h至约60％细胞汇合。

(3)细菌准备：挑取实施例2构建的荧光标记鲍曼不动杆菌(Ab-GFP)单菌落至5mL相应LB肉汤培养液，37℃，180r/min过夜培养；将菌液调至麦氏1.0浊度后(认为1.0MCF＝2×10⁸CFU/mL)，用无抗无血清RPMI 1640洗涤3次，16,000r/min，5min，重悬于无抗无血清RPMI 1640中备用。

(4)细菌-细胞共培养：

1)将平铺的细胞用PBS轻柔地冲洗3次，每次5min；

2)加入1mL无抗无血清RPMI 1640细胞培养液；并按照感染复数(Multiplicity ofInfection,MOI)100:1接种悬浮Ab-GFP菌液，共培养5h后，PBS洗涤细胞3次，每次5min，洗去游离菌；

3)固定：PBS冲洗3遍(预温，洗涤时轻轻晃动即可)，弃PBS，同时立即加入4％多聚甲醛(4℃避光保存)，室温固定20min；

4)用PBS洗三次，每次5min。

(5)荧光染料染色

1)固定后的细胞用0.1％Triton X-100透化处理5min；

2)PBS清洗细胞3次，每次5min；

3)取足够量新鲜配好的1×iFluor^TM 647phalloidin以覆盖住细胞，室温避光染色60min；

4)PBS清洗细胞3次，每次5min；

5)加入足量1μg/mLDAPI溶液对细胞核进行复染，室温避光染色10min；

6)PBS清洗细胞3次，每次5min；无菌蒸馏水清洗1次，5min；

7)用Fluorshield^TM封片剂进行封片，干燥后用共聚焦显微镜进行观察(图4)。

序列表

<110> 杭州市第一人民医院

<120> 一种鲍曼不动杆菌的绿色荧光蛋白基因标记方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6818

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌质粒pET-RA-Y(人工序列Unknown)

<400> 1

aaaaggatcc ggatccaaaa gatcctctag atttaagaag gagatataca tatgagtaaa 60

ggagaagaac ttttcactgg agttgtccca attcttgttg aattagatgg tgatgttaat 120

gggcacaaat tttctgtcag tggagagggt gaaggtgatg caacatacgg aaaacttacc 180

cttaaattta tttgcactac tggaaaacta cctgttccat ggccaacact tgtcactact 240

ttcgcgtatg gtcttcaatg ctttgcgaga tacccagatc atatgaaaca gcatgacttt 300

ttcaagagtg ccatgcccga aggttatgta caggaaagaa ctatattttt caaagatgac 360

gggaactaca agacacgtgc tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc 420

gagttaaaag gtattgattt taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa attggaatac 480

aactataact cacacaatgt atacatcatg gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagtt 540

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tcaaaagcac tactaaacat atgtttttaa ataaaaaata ttgatataga gataatatta 1740

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cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3780

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cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 4560

gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 4620

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 4680

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac 4740

gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 4800

cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 4860

gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca gctgcggtaa agctcatcag 4920

cgtggtcgtg aagcgattca cagatgtctg cctgttcatc cgcgtccagc tcgttgagtt 4980

tctccagaag cgttaatgtc tggcttctga taaagcgggc catgttaagg gcggtttttt 5040

cctgtttggt cacttgatgc ctccgtgtaa gggggaattt ctgttcatgg gggtaatgat 5100

accgatgaaa cgagagagga tgctcacgat acgggttact gatgatgaac atgcccggtt 5160

actggaacgt tgtgagggta aacaactggc ggtatggatg cggcgggacc agagaaaaat 5220

cactcagggt caatgccagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac agggtagcca 5280

gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgctgact tccgcgtttc 5340

cagactttac gaaacacgga aaccgaagac cattcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt 5400

tttgcagcag cagtcgcttc acgttcgctc gcgtatcggt gattcattct gctaaccagt 5460

aaggcaaccc cgccagccta gccgggtcct caacgacagg agcacgatca tgcgcacccg 5520

tggccaggac ccaacgctgc ctcagagtgc tacacacatc gcaggagtgg tcatgactta 5580

ctcatgtact ttggattatt tagtggtata aaatcctgat ttataaattt ttttttgtta 5640

aaaaagataa aagccccttg caattgcttg gggctttacc gtaatttatg gggtacagat 5700

cttcgatact gacatatcgg caatcgaaag cattaaggtt tgacgaccgc taatgatttc 5760

accacaggcc gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg gcggacgcga tggatatgtt 5820

ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacagt tctccgcaag aattgattgg ctccaattct 5880

tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ccggcttcca ttcaggtcga ggtggcccgg 5940

ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc 6000

catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt 6060

ccagtgatcg aagttaggct ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg 6120

tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa 6180

gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg 6240

tagcccagcg cgtcggccgc catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg 6300

gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc 6360

gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc 6420

gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg 6480

atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc 6540

ggtcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 6600

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 6660

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 6720

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 6780

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagag 6818

<210> 2

<211> 589

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌质粒pET-RA-Y中的启动子(人工序列Unknown)

<400> 2

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120

cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589

<210> 3

<211> 714

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌质粒pET-RA-Y质粒中的GFP(人工序列Unknown)

<400> 3

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcgcgtatgg tcttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaa 714

<210> 4

<211> 492

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌质粒pET-RA-Y质粒中的利福平抗性编码基因序列(人工序列Unknown)

<400> 4

gtgttatgca gccaaatccc aacaattaag ggtcttaaaa tggtaaaaga ttggattccc 60

atctctcatg ataattacaa gcaggtgcaa ggaccgttct atcatggaac caaagccaat 120

ttggcgattg gtgacttgct aaccacaggg ttcatctctc atttcgagga cggtcgtatt 180

cttaagcaca tctacttttc agccttgatg gagccagcag tttggggagc tgaacttgct 240

atgtcactgt ctggcctcga gggtcgcggc tacatataca tagttgagcc aacaggaccg 300

ttcgaagacg atccgaatct tacgaacaaa aaatttcccg gtaatccaac acagtcctat 360

agaacctgcg aacccttgag aattgttggc gttgttgaag actgggaggg gcatcctgtt 420

gaattaataa ggggaatgtt ggattcgtta gaggacttaa agcgccgtgg tttacacgtc 480

attgaagact ag 492

<210> 5

<211> 1337

<212> DNA

<213> 鲍曼不动杆菌基因复制起始点序列(人工序列Unknown)

<400> 5

gatcgtagaa atatctatga ttatcttgaa gaacgcaacc ctatagcagc tattgaaatt 60

gatgatttaa ttgaagaaaa gacagattta gttgttgata atcgactgat ggggcgcaca 120

ggcagacaga aagatactag ggagttagtg atacatccgc attatgtggt tgtatatgac 180

atcactgata taatacggat actcagagtg ctacacacat cgcaggagtg gtcatgactt 240

actcatgtac tttggattat ttagtgttat aaaatcctga tttataaatt ttttttgtta 300

aaaaagataa aagccccttg caattgcttg gggctttacc gtaatttatg gggtacagat 360

cttcgatact gacatatcgg caatcgaaag cattaaggtt tgacgaccgc taatgatttc 420

accacagggg cttaatgtac ctgtcttaaa ttctaaggtt ttaactcgct ttgtcaagca 480

tagaccccaa aaatttagcc aatgtctgta actcaatctg tccatgtgtg ggtgatgagg 540

tacagtgacg ctagcacaca tcggaaaaac gctattacta ggggaactga acagagtagc 600

ggacgcaatg agtagtcatt taattggcgg ttatgagcgt gttcaggcgg tgctatcaat 660

cgtaatcata acagtggcag cttgatacag tgatgtcatc cctgatgcga aagcgaccga 720

ccgacggtac atcgaatggg aatactttag ggtgattttt aagaatcgct ctagggtgag 780

tatttcccat tcagctctgc tccctccctc tggtacttta atcaaaagca ctactaaaca 840

tatgttttta aataaaaaat attgatatag agataatatt agtaagaata attaaacaat 900

tgaatataga taaatcattg ttaaataaag attaattatt aaaatgaatg tatacttata 960

tataaatcaa tgatttaaaa tatttgataa agaaaacttt tcaaaaaaaa tataattgag 1020

attgtgtcat ttcggtcaat tcttaatatg ttccacgcaa gttttagcta tggtgctaaa 1080

cagaaatttg ctgaaaaaga acttttcact gaactggtta aaatgtaagc agcctgagag 1140

ccgccaaaaa ttttaaaaac aaaccgcctt aatcatcttc aaaaaatacc tctaaaacct 1200

caccatttgc gttttaagac ccatatttca tcctgccctt atgttcccat gctgatagct 1260

ataaagtgtc tgtaatcgct tcctatgacg ttctaggctg ttgataactt ttggaacaac 1320

gcaaaatgtt aaaatcc 1337

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

gaattagatg gtgatgttaa tggg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

atcactaact ccctagtatc tttc 24