阅读说明：本技术 环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法 (Preparation method of circular RNA hsa _ circ _0008602 dual-luciferase reporter gene vector ) 是由 张梦娇 袁奕 唐林香 李昂 何胜祥 于 2020-04-10 设计创作，主要内容包括：一种环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法,步骤(1),通过cirbase数据库获取hsa_circ_0008602的全长序列,全基因合成构建入pUC57-Amp载体；步骤(2),设计一对同源重组引物,将目的序列从pUC57-Amp载体上扩增出来；同时,对psiCHECK2骨架载体进行XhoI和NotI酶切线性化,通过琼脂糖凝胶对扩增产物和酶切产物进行纯化回收,再将扩增产物和酶切产物进行同源重组反应,得到重组产物；步骤(3),将重组产物转入感受态细胞中,挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定,得到载体psiCHECK2-8602。(A preparation method of a circular RNA hsa _ circ _0008602 dual-luciferase reporter gene vector comprises the steps of (1) obtaining a full-length sequence of hsa _ circ _0008602 through a circase database, and constructing a pUC57-Amp vector through whole gene synthesis; step (2), designing a pair of homologous recombination primers, and amplifying a target sequence from a pUC57-Amp vector; meanwhile, XhoI and NotI enzyme digestion linearization is carried out on the psiCHECK2 skeleton vector, an amplification product and an enzyme digestion product are purified and recovered through agarose gel, and then homologous recombination reaction is carried out on the amplification product and the enzyme digestion product to obtain a recombinant product; and (3) transferring the recombinant product into a competent cell, and selecting a single clone for electrophoretic verification and sequencing identification to obtain a vector psiCHECK 2-8602.)

环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备 方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子(少量被证实亦可编码蛋白)，不受RNA外切酶的影响，表达稳定，不易降解，进化保守。CircRNA是一种内源性非编码 RNA，它没有5’端帽或3’端聚(A)尾，作为前体mRNA通过剪接体机械后剪接形成的共价闭环。其环化方式分为内含子环化、外显子环化、基因间环化等，目前主流的成环机制可归类成三种：依赖于剪切体的索尾插接环化；顺式作用元件促进circRNA形成；RNA结合蛋白 (RBPs)调控circRNA形成。

在功能上，近年的研究表明，circRNA可通过调控基因表达与功能等途径，广泛参与细胞生命活动的众多过程，如细胞分化、增殖、凋亡、染色体修饰与失活等。相对于编码基因与miRNA表达的广谱性，circRNA的表达往往更具有细胞与组织特异性、分化发育的时空差异性等特点。近年来随着新一代测序转录谱分析等技术的发展，circRNA在癌症中的角色也正逐渐被研究者发掘与重视，越来越多的数据显示，在多种肿瘤中存在circRNA的异常表达和/突变，且与肿瘤的发生发展密切关联。

有研究发现，circRNA富含miRNA结合位点，在细胞中起竞争结合miRNA的作用，是一类高效的ceRNA。也有研究报道，circLARP4主要定位于细胞质中，通过作为miR-424的海绵吸附体抑制胃癌细胞的生物学功能，而miR-424的异位表达是通过靶向LATS1基因促进胃癌细胞的增殖和侵袭，表明circLARP4可能是胃癌中一种新的肿瘤抑制因子和潜在的生物标志物。CircRNA-miRNA网络可能通过竞争性内源性RNA(ceRNA)调控肿瘤抑制因子。建立了编码RNA和非编码RNA相互作用的一个新的基因表达调控模型和一个涉及ceRNA的复杂网络系统。

截至目前为止，针对宫颈癌的研究发现，一些circRNAs的表达变化与宫颈癌发生发展相关。但总体而言，当前我们对circRNAs在宫颈癌中的研究仍不够全面与深入，在前期探索中，我们通过高通量测序与生物信息学分析，环状RNA hsa_circ_0008602在宫颈癌组织中显著下调并证实该分子与宫颈癌进程密切相关。hsa_circ_0008602定位于 chr11：106849344-106856857，起源于亲本基因GUCY1A2的第6号外显子和第7号外显子。目前尚无该分子在肿瘤进程中的研究报道。为进一步探究hsa_circ_0008602在以宫颈癌为代表的肿瘤中功能及相应机制，拟通过构建荧光素酶报告基因载体，进一步筛选其结合的 miRNAs，探究环状RNA hsa_circ_0008602是否可通过miRNA海绵(miRNA sponge)发挥作用，并验证由hsa_circ_0008602驱动的ceRNA调控网络。

在目前报道中，双荧光素酶报告基因系统相对于其他报告基因检测系统更加快捷敏感，可以在96孔板中进行，便于大量检测，荧光素酶的检测量能低至10^-20mol，具有极高的敏感性，并且安全，无放射性。目前利用双荧光素酶报告基因系统识别靶基因检测方法已得到广泛的应用，例如在受体活性，细胞内信号转导、mRNA加工、蛋白质折叠机蛋白与蛋白相互作用等。

但是现有技术同样存在以下缺点：

(1)当miRNAs被circRNA吸附，理论上细胞内miRNA的总量不会产生变化，因此无法通过qRT-PCR检测来判断miRNA是否吸附。通常只能通过预测可能被吸附的miRNA，过表达circRNA后通过检测miRNA的下游基因表达差异，间接反映circRNA sponge功能。但这种方法，不能有效说明是circRNA-miRNA直接作用的结果。直接的证据在于Sensor reporter的构建与活性检测，对miRNAs与circRNA的关系做出准确判断。

(2)当前很多基于环状RNA荧光素酶报告基因载体的构建，是通过将预测的一小段RNA序列构建到载体中报告基因Luciferase的后面，继而构建荧光素酶质粒，即需针对每个候选miRNA分子进行单独的环状RNA荧光素酶报告基因载体构建与验证。不仅成本高，操作繁琐，而且增加了实验周期。

(3)当前对于环状RNAhsa_circ_0008602的表达及机制研究还尚未报道，无基于hsa_circ_0008602的荧光素酶报告基因检测系统，不利于进一步探讨该分子在肿瘤进程中的作用及机制。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种环状RNAhsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法利用psiCHECK2骨架载体，通过同源重组的方法将环状RNA序列连接到荧光素酶报告基因的载体；包括以下步骤：

步骤(1)，通过cirbase数据库获取hsa_circ_0008602的全长序列，全基因合成构建入 pUC57-Amp载体；

步骤(2)，设计一对同源重组引物，将目的序列从pUC57-Amp载体上扩增出来；同时，对psiCHECK2骨架载体进行XhoI和NotI酶切线性化，通过琼脂糖凝胶对扩增产物和酶切产物进行纯化回收，再将扩增产物和酶切产物进行同源重组反应，得到重组产物；

步骤(3)，将重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定，得到载体psiCHECK2-8602，即环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体。

本发明和现有技术相比，其优点在于：

优点(1)本发明将环状RNAhsa_circ_0008602全长序列构建到psiCHECK2骨架载体上，便于后续多个靶分子的筛选。相较于针对单靶位点构建的载体，本发明不仅节约时间，而且节约成本。

优点(2)本发明可通过将要检测的miRNAs或negative control与环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体共转染至细胞中，检测荧光素酶活性，根据荧光素酶活性差异判断判断miRNA-hsa_circ_0008602的相互作用。

优点(3)本发明可进一步在优点(2)的基础上，将候选miRNA MRE应答原件结合位点随机打乱以获得突变MUT，再同环状RNA hsa_circ_0008602的双荧光素酶报告基因载体共同转入细胞中，检测荧光素酶活性，根据荧光素酶活性差异进一对hsa_circ_0008602与候选miRNAs的关系做出准确判断。

优点(4)本发明可通过计算萤火虫荧光素酶活性与内参海肾荧光素酶性的比值，对各组进行差异性分析，根据荧光素酶活性差异判断miRNA-hsa_circ_0008602的相互作用。

优点(5)当前对于环状RNA hsa_circ_0008602的表达及机制研究还尚未报道，无基于 hsa_circ_0008602的荧光素酶报告基因检测系统，不利于进一步探讨该分子在肿瘤进程中的作用及机制，而本发明有效的填补了此处的相关研究空白。

优点(6)本发明通过构建环状RNA hsa_circ_0008602的双荧光素酶报告基因载体，能够筛选并验证受环状RNA hsa_circ_0008602调控的候选microRNAs，探讨环状RNAhsa_circ_0008602能否作为内源性竞争RNA通过MREs(miRNA response element)竞争miRNAs，以间接调控miRNA下游靶基因的表达，从而为解析环状RNA hsa_circ_0008602 生理/病理学功能及机理提供数据支持。

优点(7)本发明构建了环状RNA hsa_circ_0008602的双荧光素酶载体报告系统，通过全基因合成hsa_circ 0008602的序列，将整段序列构建至psiCHECK2荧光素酶载体中，后续通过将候选miRNAs mimics与报告基因质粒共转染293T细胞或其它相关的细胞系，检测荧光的强度以测定荧光素酶的活性，从而判断miRNA-circRNA的相互作用(若此miRNA 可与hsa_circ_0008602结合，则荧光素酶基因会下调，荧光素酶表达量与 miRNA-hsa_circ_0008602作用强度成反比)。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的环状RNA hsa_circ_0008602位点信息；

图2为本发明的荧光素酶载体信息；

图3为本发明的环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体的结构示意图；

图4为本发明的环状RNA hsa_circ_0008602序列扩增体示意图；

图5为本发明的单克隆验证结果图；

图6为本发明的psiCHECK2-8602载体测序比对结果图；

图7为本发明的环状RNA hsa_circ_0008602测序峰图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明公开的示例性实施例，这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。虽然附图中显示了本发明公开的示例性实施例，然而应当理解，本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。

一种环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法，利用psiCHECK2 骨架载体，通过同源重组的方法将环状RNA序列连接到荧光素酶报告基因的载体；包括以下步骤：

步骤(1)，通过cirbase数据库获取hsa_circ_0008602的全长序列，全基因合成构建入 pUC57-Amp载体；

步骤(2)，设计一对同源重组引物，将目的序列从pUC57-Amp载体上扩增出来；同时，对psiCHECK2骨架载体进行XhoI和NotI酶切线性化，通过琼脂糖凝胶对扩增产物和酶切产物进行纯化回收，再将扩增产物和酶切产物进行同源重组反应，得到重组产物；

步骤(3)，将重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定，得到载体psiCHECK2-8602，即环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体。

具体实施时，环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)，根据circ Base查询到环状RNA hsa_circ_0008602的基因序列，全基因合成方式获得hsa_circ_0008602全长序列，并构建入pUC57-Amp载体；

步骤(2-1)，根据环状RNA hsa_circ_0008602序列及荧光素酶载体psiCHECK2的信息，按照结构图所示插入到荧光素酶报告基因载体中，设计同源重组引物；

步骤(2-2)，利用同源重组引物从pUC57-Amp载体上扩增出hsa_circ_0008602目的片段，同时将psiCHECK2骨架载体采用XhoI和NotI酶切线性化，通过琼脂糖凝胶对扩增产物和酶切产物进行纯化回收，再将两种产物进行同源重组反应；

步骤(3)，将重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定，得到载体psiCHECK2-8602，即环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体。

实施例1

环状RNAhsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因的基本原理是：将需要鉴定预测含有 miRNA靶位点的环状RNA构建到荧光素酶载体上，在将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，一般通过将miRNA过表达和抑制两种水平，检测荧光素酶的表达情况，分析环状RNA中是否含有miRNA的靶位点。

通过采用同源重组技术，构建环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶载体，从而筛选与之相结合的miRNA，探究由环状RNA hsa_circ_0008602驱动的ceRNA网络机制，为解析环状RNA hsa_circ_0008602生理/病理学功能及机理提供数据支持。

环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法包括如下步骤：

步骤(1)，根据circ Base查询到环状RNA hsa_circ_0008602的基因序列，全基因合成方式获得hsa_circ_0008602全长序列，并构建入pUC57-Amp载体。

环状RNA hsa_circ_0008602的序列信息为：

步骤(2-1)，根据环状RNA hsa_circ_0008602序列及荧光素酶载体psiCHECK2的信息 (如图2所示)，按照结构图(如图3所示)所示插入到荧光素酶报告基因载体中，设计如下同源重组引物：

8602-CZF：ATTCTAGGCGATCGCAAGCTTGTTTAAACC；

8602-CZR：TTTATTGCGGCCAGCGAATTCTTTATTGCG。

步骤(2-2)，利用同源重组引物从pUC57-Amp载体上扩增出hsa_circ_0008602目的片段(如图4所示)，同时将psiCHECK2骨架载体采用XhoI和NotI酶切线性化，通过琼脂糖凝胶对扩增产物和酶切产物进行纯化回收，再将两种产物进行同源重组反应。

步骤(3)，将重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证(如图5所示)和测序鉴定(如图6所示)，得到载体psiCHECK2-8602，即为环状RNA hsa_circ_0008602的双荧光素酶报告基因载体。

其中，需要说明的是，PCR反应体系中，

pLV-CMV-EGFP-Neo DNA的体积为2μL；

Forward primer(10μM)的体积为1μL；

Reverse primer(10μM)的体积为1μL；

Taq DNA Polymerase的体积为25μL；

ddH₂O的体积为21μL。

其中，需要说明的是，PCR反应体系中，PCR反应条件：

温度95℃，时间2min，循环数1；

温度95℃，时间30s，循环数35x；

温度58℃，时间30s，循环数35x；

温度72℃，时间30s，循环数35x；

温度65℃，时间5min，循环数1。

其中，需要说明的是，酶切线性化的体系中，

Vector的体积为10uL；

XhoI的体积为1uL；

NotI的体积为1uL；

10X NEB Buffer的体积为5uL；

ddH₂O的体积为33uL。

当前无基于hsa_circ_0008602的荧光素酶报告基因检测系统，不利于进一步探讨该分子在肿瘤进程中的作用及机制，本发明提供了一种hsa_circ_0008602的荧光素酶报告基因检测系统，有效填补了相关研究空白。

双荧光素酶报告基因系统相对于其他传统报告基因检测系统(如CAT，β-Gal，GUS)相比，本发明更加灵敏，便于大量检测，具有极高的敏感性，安全无放射性。

本发明将环状RNA hsa_circ_0008602全长构建到psiCHECK2骨架载体上，便于后续多个靶分子筛选。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 申请单位名称

<120> 一种环状RNA hsa_circ_0008602双荧光素酶报告基因载体制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<220>