一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件

文档序号：1180453 发布日期：2020-09-22 浏览：43次 >En<

阅读说明：本技术 一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件 (Inducible toxin-antitoxin element for genetic manipulation of thermophilic microorganisms ) 是由徐俊宋庆浩于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件；所述元件携带有诱导型启动子、热稳定的毒素基因和抗毒素基因；所述制备方法包括构建正向选择标记和诱导型毒素-抗毒素反向选择标记；该原件可在嗜热微生物中进行遗传操作。本发明提供的热稳定的毒素抗毒素元件可在嗜热微生物中进行遗传操作时作为高效的选择性标记,该元件可应用于嗜热微生物的分子遗传学研究。(The invention discloses an inducible toxin-antitoxin element for genetic manipulation of thermophilic microorganisms; the elements carry inducible promoters, heat-stable toxin genes and antitoxin genes; the preparation method comprises the steps of constructing a forward selection marker and an inducible toxin-antitoxin reverse selection marker; the elements can be genetically manipulated in thermophilic microorganisms. The heat-stable toxin antitoxin element provided by the invention can be used as a high-efficiency selective marker during genetic manipulation in thermophilic microorganisms, and the element can be applied to molecular genetic research of thermophilic microorganisms.)

技术领域

本发明涉及一种利用热稳定的毒素-抗毒素元件构建遗传筛选标记的方法和应用，具体涉及通过高静水压力诱导此类毒素-抗毒素元件在超嗜热微生物中进行遗传操作的方法和应用。

背景技术

超嗜热微生物遗传操作研究已经有超过20年的时间，但是由于高温条件的限制，已开发可用的遗传工具数量非常有限。例如，热球菌Thermococcus kodakaraensis KOD1是第一个发展了基因敲除系统的菌株，其使用pryF基因作为筛选标记，尿嘧啶缺陷菌株作为出发菌株配合合成培养基使用。随后几种氨基酸缺陷标记陆续被开发：像色氨酸缺陷菌株,组氨酸缺陷菌株，但这些标记只能在合成培养基中使用。直到开发了辛伐他丁/HMG-CoA还原酶过表达系统，其真正实现了在富营养培养基中操作。但是目前为止，超嗜热古菌中还没有科学家开发出一套可以直接在原养型菌株中进行无痕敲除的遗传系统。目前超嗜热菌遗传操作的出发菌株皆为氨基酸/核苷缺陷菌株，相比于原养型菌株，缺陷菌株对于代谢网络和适应性研究具有一定的干扰，增加了研究难度。而且在合成培养基中进行遗传操作由于菌株生长较慢需要花费更长的时间。因此亟需开发一种可在原养型菌株中进行遗传操作的遗传系统。

最近，毒素抗毒素(TA)系统已经在中温细菌中实现了遗传操作。特别是II型的TA系统，由于毒素与抗毒素都是蛋白，并且直接相互作用，毒素蛋白通过转录或翻译抑制菌体生长，抗毒素可以中和这种毒性，而且TA系统广泛分布在细菌和古菌中，特别是能耐受更高温度的超嗜微生物中寻找可用的TA系统用于遗传操作是一种可行的方案。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可直接应用于原养型超嗜热微生物的遗传操作的选择性元件，具体是一种用于超嗜热微生物遗传操作的高静水压诱导的毒素-抗毒素元件；本发明还提供了制备上述选择性元件的方法和其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种热稳定的毒素-抗毒素选择性筛选标记HHP-TAC，所述选择性筛选标记HHP-TAC包含来自于超嗜热古菌的高静水压力诱导型启动子、热稳定性毒素基因和抗毒素基因、组成型启动子以及HMG-CoA还原酶基因。

优选地，所述组成型启动子包括组成型启动子P_hmtB和组成型启动子P_gdh。

进一步优选地，所述组成型启动子P_hmtB和P_gdh区域来源于质粒pTS535。

优选地，所述诱导型启动子是来自于超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii的高静水压力诱导型启动子P_hhp；热稳定性毒素和抗毒素的编码基因分别来自于超嗜热古菌P.furiosus的PF0776基因和PF0775基因。

优选地，所述选择性筛选标记HHP-TAC的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明涉及一种选择性筛选标记HHP-TAC的制备方法，包括如下步骤：

使用融合PCR扩增技术，依次将高静水压力诱导型启动子与热稳定性毒素基因融合，组成型启动子与抗毒素基因融合，以及组成型启动子与HMG-CoA还原酶基因融合，获得所述选择性筛选标记HHP-TAC。

优选地，所述高静水压力诱导型启动子为来自于超嗜热古菌Pyrococcusyayanosii的高静水压力诱导型启动子P_hhp。该压力诱导型启动子P_hhp元件序列长度488bp，碱基序列如SEQ ID NO.13所示。

优选地，所述热稳定性毒素基因为来自于超嗜热古菌P.furiosus的PF0776基因；所述抗毒素基因为来自于超嗜热古菌P.furiosus的PF0775基因。所述毒素基因PF0776和抗毒素基因PF0775序列长度分别为327bp和324bp；所述热稳定性毒素基因的碱基序列如SEQID NO.14所示；抗毒素基因的碱基序列如SEQ ID NO.15所示。控制毒素基因的表达可以实现对菌株生长的抑制。

进一步优选地，使用融合PCR扩增技术，依次将高静水压力诱导型启动子P_hhp与热稳定性毒素基因PF0776融合，组成型启动子P_hmtB与抗毒素基因PF0775融合，以及组成型启动子P_gdh与HMG-CoA还原酶基因融合，获得所述选择性筛选标记HHP-TAC。

优选地，所述HMG-CoA还原酶基因来源于超嗜热古菌P.furiosus。过表达该基因可赋予该超嗜热古菌对辛伐他汀的抗性。其碱基序列如SEQ ID NO.16所示。

优选地，所述制备方法还包括对所得选择性元件进行验证的步骤。

优选地，所述验证具体包括将所述选择性元件***无痕敲除质粒pUS776TA1369中在E.coli DH5α中进行质粒扩增并测序验证，然后将其转入超嗜热古菌P.yayanosii A1验证其成功进行敲除实验。

第三方面，本发明提供一种所述选择性筛选标记HHP-TAC在嗜热微生物中的用途，该选择性筛选标记HHP-TAC可在嗜热微生物的原养型中直接进行分子遗传操作。

优选地，所述选择性筛选标记HHP-TAC中的高静水压力诱导型启动子用于控制蛋白的表达。

本发明构建的用于超嗜热微生物遗传操作的高压诱导型毒素-抗毒素元件，可以在原养型的超嗜热微生物中直接进行基因敲除的遗传操作工具并极大的扩大了负筛选标记的选择范围。同时该元件携带有高温可用的辛伐他汀抗性标记基因，使在高温下对其进行抗性筛选成为可能。丰富了超嗜热微生物遗传工具的种类，有助于对该类菌株进行功能基因组学研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明的选择性元件HHP-TAC能够在超嗜热古菌P.yayanosii A1菌株中高效的进行辛伐他丁抗性正向选择和高压诱导方向选择，该元件可作为超嗜热古菌的基因遗传操作应用于基因功能鉴定研究。

(2)本发明的压力诱导型启动子为来自于超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii的高静水压力诱导型启动子P_hhp；该压力诱导型启动子P_hhp元件序列长度488bp。该压力诱导型启动子使用物理(压力)诱导，易于操作，应用成本低。

(3)本发明的选择性元件HHP-TAC具有诸多效果：高压诱导表达，既可以用来表达毒性蛋白也可以用来其他蛋白的控制性表达，可用于蛋白的过表达纯化等；毒素-抗毒素元件广泛分布在超嗜热微生物中，该遗传标记不存在高温失活的问题。而且同一微生物中存在多种毒素抗毒素元件，可以发展为不同的选择性标记。

(4)基于压力诱导的毒素-抗毒素元件可以直接在原养型菌株中进行遗传操作，排除了营养缺陷型基因的干扰。

附图说明

通过阅读参照以下附图对选择性元件实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是选择性元件HHP-TAC构建说明图；

图2是pUS776TA1369无痕敲除质粒示意图；

图3是无痕敲除菌株Δ1369^-基因组水平PCR验证结果图；其中，图A为目的基因PYCH_1369基因上下游区域间PCR片段分析，M为1kb DNA ladder；1,A1；2,Δ1369^-；图B为目的基因PYCH_1369基因内部PCR片段分析，M为1kb DNA ladder；1,A1；2,Δ1369^-；图C为鲁戈氏碘液法残余淀粉量分析，1,TRM含2‰(M/V)可溶性淀粉；2,菌株A1培养在含2‰(M/V)可溶性淀粉TRM培养基中；3,无痕敲除菌株Δ1369^-培养在含2‰(M/V)可溶性淀粉TRM培养基中；4,TRM。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明所涉菌株均为公知菌株，公开情况具体如下：

超嗜热古菌P.yayanosii已在文献：《Pyrococcus yayanosii sp.nov.,anobligate piezophilic hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-seahydrothermal vent》,2011中公开；

超嗜热古菌P.furiosus已在文献：《Pyrococcus furiosus sp.nov.represents anovel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100℃》,1986中公开；

超嗜热古菌P.yayanosii A1已公开于文献：所述P.yayanosii A1菌株已经发表于《Genetic tools for the piezophilic hyperthermophilic archaeon Pyrococcusyayanosii》,2015；

实施例1、构建选择性元件HHP-TAC

选择性元件HHP-TAC构建说明书如图1；PCR扩增超嗜热古菌P.yayanosii A1中压力诱导型启动子P_hhp元件488bp，超嗜热古菌P.furiosus的毒素基因PF0776(327bp)和抗毒素基因PF0775(324bp)；以及质粒pTS535的启动子区P_hmtB和P_gdh(421bp)，以及P.furiosus的HMG-CoA还原酶基因1227bp，并使用融合PCR将其依次融合得到选择性元件HHP-TAC，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2、构建功能验证无痕敲除载体pUS776TA1369

在已获得过选择性元件HHP-TAC的基础上进行进一步修饰，过程如下：

(1)、对质粒pUC18进行PCR线性化改造，所用引物碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示；

(2)、PCR扩增P.yayanosii A1中基因PYCH_01369上游片段PYCH1369-TA-up(890bp)所用引物碱基序列如SEQ ID NO.5-6所示，下游片段PYCH1369-TA-dw(656bp)所用引物碱基序列如SEQ ID NO.7-8所示以及目的片段PYCH1369-TA(820bp)所用引物碱基序列如SEQ ID NO.11-12所示；

(3)、PCR扩增选择性元件HHP-TAC所用引物碱基序列如SEQ ID NO.9-10所示，并使用重组酶按照上游片段PYCH1369-TA-up、下游片段PYCH1369-TA-dw、选择性元件HHP-TAC和目的片段PYCH1369-TA的顺序将其连接到线性化质粒pUC18上，得到功能验证无痕敲除质粒pUS776TA1369，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；pUS776TA1369无痕敲除质粒示意图如图2所示；

(4)、将构建好的pUS776TA1369无痕敲除质粒在E.coli DH5α中进行质粒扩增并测序验证质粒已经构建正确。pUS776TA1369无痕敲除质粒序列如表2所示。将构建好的pUS776TA1369无痕敲除质粒，使用M13-47/48引物PCR扩增得到线性化敲除片段，转化至超嗜热古菌P.yayanosii A1中，通过辛伐他丁抗性正向筛选和高压反向筛选，进行功能的验证，所用引物见表1。

表1 pUS776TA1369无痕敲除质粒构建及鉴定的引物序列

表2 pUS776TA1369无痕敲除质粒序列说明

实施例3、实施效果

pUS776TA1369无痕敲除质粒具有***载体的特性，可以在大肠杆菌E.coli DH5α中复制，获得大量质粒。然后使用引物M13-47/48扩增得到线性化敲除片段，将获得的线性化敲除片段转化至超嗜热古菌P.yayanosii A1中，经过辛伐他汀抗性筛选阳性克隆子，提取总DNA进行PCR验证。然后转接至TRM培养基中高压诱导培养，筛选阳性克隆子无痕敲除菌株Δ1369^-，进行PCR无痕敲除结果验证，验证结果如图3A.B所示。对鉴定为阳性的克隆子在含可溶性淀粉的培养基中进行培养，验证其对淀粉的降解能力，验证结果如图3C所示。

表明选择性元件HHP-TAC可以作为一种超嗜热古菌P.yayanosii A1基因选择元件进行遗传操作应用。

综上所述，本发明的选择性元件HHP-TAC能够在超嗜热古菌P.yayanosii A1菌株中高效的进行辛伐他丁抗性正向选择和高压诱导方向选择，该元件可作为超嗜热古菌的基因遗传操作应用于基因功能鉴定研究。本发明涉及的选择性元件HHP-TAC具有诸多效果：高压诱导表达，既可以用来表达毒性蛋白也可以用来其他蛋白的控制性表达，可用于蛋白的过表达纯化等；毒素-抗毒素元件广泛分布在超嗜热微生物中，该遗传标记不存在高温失活的问题。而且同一微生物中存在多种毒素抗毒素元件，可以发展为不同的选择性标记；基于压力诱导的毒素-抗毒素元件可以直接在原养型菌株中进行遗传操作，排除了营养缺陷型基因的干扰。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件

<130> DAG37633

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2787

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggtcttcc tcatctcggg attctcaagg gggagaatcc gtacttcaca agtatcttca 60

gagattcggg ataggccttc aggagtttgg ccacgttggt ttcctccgtt atctcgtcca 120

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<210> 2

<211> 7797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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cgaagagata atgaaagtaa tagaagaaga attccccgat gtaaaatatt tggctctttc 3780

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gaccattatt gctgaagctg tagttcctag agagattgtt aagaaaaagc taaagaccac 3900

tccagagctt atcgctgaag taaactacct aaagaactta gtgggttcgg cccaagcagg 3960

ttcctacggt tttaacgctc actttgccaa cattgtaggg gcgatattcc tagccacagg 4020

tcaggatgag gctcaaatta cggaaggtgc acatggaata accctcgctg aagtcactga 4080

agatggagat ctatacataa gcataacaat gccgagccta gaaataggga cggttggagg 4140

tgggactaga gtacctcctc aaagagaagc tctagaaatt atgggggttg ctggaggagg 4200

agatcctcca gggatgaatg ctaagaaatt tgcggagata gttgctggtg cggttttggc 4260

tggtgagctc tctcttctgg ccgcaattgc cgccaaacat ttggctaggg ctcataaaat 4320

gcttgggaga tgaatggaga agataaactt catatttggc atacacaatc accagcccct 4380

tgggaacttc ggatgggtct tcgagagcgc ctacgaaagg gcttacagac cttttctcga 4440

ggccctcgag gagtacccga acatgaaggc ggctatccac ataagcggac ccctcgtgga 4500

gtggattgaa gagaacaggc cggaatactt tgacctgctc cgcacactca tcaagagagg 4560

ccaggtcgaa ctcgtagtcg ccggctttta cgagcccgtg ctcgcggcaa tccccaagga 4620

ggaccgcata gagcagataa ggcttatgaa ggagtgggcc aagaagctcg ggtatgatgc 4680

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ggccgggata gagtacgtga tcgtggacga ctaccacttc atgagtgccg gtctgagcaa 4800

ggaggagctc ttctggccct actacacgga agatggtggt gaggtcataa ctgttttccc 4860

catagatgag aagctccgct acctaattcc attcaggcca gttgagaaaa ccattgaata 4920

cctccactcc ctcatagatg atgacgagag caaagttgcg gtcttccacg acgacgggga 4980

gaagttcggc gtctggcccg gcacctatga gtgggtgcac gagaagggat ggctcaggga 5040

gttcttcgag agggtatcca gcgacgagcg gatcaacttg atgctttact ctgagtatct 5100

ggagcgcttc aggcccaaag gattggtata cctgccaata gcctcctact tcgtcgtaat 5160

catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 5220

gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 5280

ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 5340

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 5400

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 5460

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 5520

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 5580

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 5640

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ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 5760

aaagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 5820

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 5880

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 5940

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cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 6540

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gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 6840

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aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 6960

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caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 7080

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 7140

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 7200

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 7260

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tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 7380

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cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 7500

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga 7560

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cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 7740

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggcatgcaag cttggcactg gccg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggccagtgc caagcttgca tgccatccgt aaccttgaga cag 43

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<212> DNA

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taagaaagct tccccacctt atcacttc 28

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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tcatctccca agcattttat gagcc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agggtcttcc tcatctcggg attct 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ataaaatgct tgggagatga atggagaaga taaacttcat attt 44

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagctatgac catgattacg acgaagtagg aggctattgg 40

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<211> 488

<212> DNA

<213> 超嗜热古菌(Pyrococcus yayanosii)

<400> 13