阅读说明：本技术 一种靶向fgfr1的拮抗短肽 (FGFR 1-targeted antagonistic short peptide ) 是由 吴建章 李物兰 陈玲姿 范蕾 蔡跃飘 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明属短肽药物学领域,具体涉及FGFR1拮抗短肽的稳定性研究及其抗肿瘤领域的应用,公开了一种FGFR1拮抗短肽,包括短肽化合物P48,短肽化合物P48通过抑制FGFR1通路,抑制细胞增殖和迁移。上述技术方案,本发明人通过不懈努力,获得了短肽化合物P48,并发现其具有稳定的二级结构及相对较长的半衰期。此外,短肽化合物P48能有效靶向抑制FGFR1,在体内外表现出良好的抗肿瘤活性,有望成为癌症治疗的候选肽类抑制剂药物。(The invention belongs to the field of short peptide pharmacology, particularly relates to stability research of FGFR1 antagonistic short peptide and application of the antagonistic short peptide in the field of anti-tumor, and discloses FGFR1 antagonistic short peptide which comprises a short peptide compound P48, wherein the short peptide compound P48 inhibits cell proliferation and migration by inhibiting an FGFR1 channel. The present inventors have diligently made efforts to obtain the short peptide compound P48, and found that it has a stable secondary structure and a relatively long half-life. In addition, the short peptide compound P48 can effectively inhibit FGFR1 in a targeted mode, shows good antitumor activity in vivo and in vitro, and is expected to become a candidate peptide inhibitor drug for cancer treatment.)

一种靶向FGFR1的拮抗短肽

技术领域

本发明涉及短肽药物学技术领域，具体涉及一种靶向FGFR1的拮抗短肽。

背景技术

成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)参与包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤的发生发展。FGFR1是癌症治疗的有效靶点。目前尚无FGFR1抑制剂批准上市，寻找有效的FGFR1靶向抑制剂具有重要的研究价值。

靶向抑制剂主要分为小分子抑制剂、抗体药物、肽类抑制剂及其衍生物。相对于小分子抑制剂而言，肽类抑制剂具有高亲和力和特异性，其不良反应较低。与抗体药物相比，肽类抑制剂分子量低，对组织的渗透活性更强。鉴于肽类抑制剂的上述优势，受到越来越多学者的青睐。截止至2015年，全球已有超60种肽抑制剂批准上市，140余种肽抑制剂处于临床研究。然而，有关FGFR1拮抗肽的研究仍止步于前临床阶段。

目前也尚无肽抑制剂靶向FGFR1抗肿瘤的相关专利。造成FGFR1拮抗肽研究滞后主要与其易降解、半衰期短相关。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种靶向FGFR1的拮抗短肽。短肽化合物P48能有效靶向抑制FGFR1，在体内外表现出良好的抗肿瘤活性。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种靶向FGFR1的拮抗短肽，包括短肽化合物P48，所述短肽化合物P48可靶向结合FGFR1的膜外免疫球蛋白域，FGFR1拮抗短肽的氨基酸序列为：

Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-NH₂。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽作为活性成分在药物中的应用。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽通过拮抗体内FGFR1信号通路，在治疗与FGFR1异常失调相关疾病方面的应用。

作为优选的，FGFR1异常失调包括FGFR1高表达和突变。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽治疗的疾病为肿瘤。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽P48通过抑制FGFR1通路，抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。

作为优选的，短肽化合物P48具有稳定的二级结构及相对延长的半衰期。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽可制成药用盐、酯或药用辅料。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽药物的制剂形式制成注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释、缓释剂或纳米制剂。

本发明的优点是：与现有技术相比，本发明人通过不懈努力，获得了短肽化合物P48，并发现其具有稳定的二级结构及相对较长的半衰期。此外，短肽化合物P48能有效靶向抑制FGFR1，在体内外表现出良好的抗肿瘤活性，有望成为癌症治疗的候选肽类抑制剂药物。

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明实施例短肽化合物P48的结构、稳定性和对FGFR1的结合能力分析示意图；

图2为本发明实施例在高度转化的人胚肾细胞HEK-293及成纤维细胞MEF-WT、Balb/c 3T3中检测短肽化合物P48对FGFR1信号通路的抑制活性示意图；

图3为本发明实施例短肽化合物P48在多种肿瘤细胞株中对FGFR1信号通路的抑制活性示意图；

图4为本发明实施例短肽化合物P48的体外抗肿瘤活性示意图；

图5为本发明实施例短肽化合物P48的体内抗肿瘤活性示意图。

具体实施方式

本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。

参见图1：短肽化合物P48的结构、稳定性和对FGFR1的结合能力分析

(A)前体肽P9和降解短肽P48的序列。(B)a：P9和P48主链中C原子的RMSD随分子动力学模拟时间而变化。b：P9和P48的初始构象及在4ns、8ns、12ns、16ns和20ns的构象叠合图。(C)P9和P48在人血浆中的半衰期。(D)a：bFGF-FGFR1复合物的分子动力学模拟和自由能计算。b：维持bFGF-FGFR1复合物稳定性的关键残基分析。(E)FGFR1和P48的分子对接。(F)SPR检测FGFR1和P48的相互作用。

图2：在高度转化的人胚肾细胞HEK-293及成纤维细胞MEF-WT、Balb/c 3T3中检测P48对FGFR1信号通路的抑制活性。

(A)短肽化合物P48预处理10分钟或AZD4547/PD173074预处理2小时后，bFGF孵育15分钟，检测药物对HEK-293、MEF-WT、Balb/c3T3细胞中FGFR1及其下游蛋白的抑制情况。(B)P48预处理10分钟或AZD4547/SSR处理2小时后，bFGF刺激15分钟，检测药物对PLCγ的抑制情况。(C)流式细胞术分析P48在MEF-WT和FGFR1-FGFR2-FRS2α敲除的MEF细胞中与FGFR1的结合能力。*，p<0.05；***，p<0.001，vs Control。

图3：短肽化合物P48在多种肿瘤细胞株中对FGFR1信号通路的抑制活性。

(A)短肽化合物P48预处理10分钟后，bFGF孵育15分钟，检测药物对FGFR1及其下游蛋白的抑制情况。(B)P48预处理10分钟或AZD4547/SSR预处理2小时后，bFGF孵育15分钟，检测药物对SGC-7901细胞中磷酸化FGFR1及其下游蛋白的抑制活性。(C)bFGF/aFGF刺激15分钟或KGF刺激20分钟，检测短肽化合物P48对SGC-7901细胞中磷酸化FGFR1及其下游蛋白的抑制活性。(D)EGF刺激10分钟，检测短肽化合物P48对PC-9细胞中磷酸化EGFR和ERK1/2的抑制活性。(E)流式细胞术检测短肽化合物P48在SGC-7901细胞中与FGFR1的结合能力。

图4：短肽化合物P48的体外抗肿瘤活性。

(A)用MTT法检测短肽化合物P48对癌细胞的生长抑制作用。(B)通过细胞侵袭实验检测短肽化合物P48对SGC-7901细胞迁移的抑制活性。(C)流式细胞术分析短肽化合物P48对细胞周期的阻滞作用。***，p<0.001，vs bFGF。

图5：短肽化合物P48的体内抗肿瘤活性。

(A)对照组和给药组的肿瘤体积测量。(B)肿瘤重量称量。(C)短肽化合物P48对裸鼠体内FLG及其下游蛋白的磷酸化水平的抑制作用。(D)免疫组化检测短肽化合物P48对促增殖蛋白Ki67的抑制活性。

本发明公开的一种靶向FGFR1的拮抗短肽，包括短肽化合物P48，所述短肽化合物P48可靶向结合FGFR1的膜外免疫球蛋白域，FGFR1拮抗短肽的氨基酸序列为：

Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-NH₂。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽作为活性成分在药物中的应用。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽通过拮抗体内FGFR1信号通路，在治疗与FGFR1异常失调相关疾病方面的应用。

作为优选的，FGFR1异常失调包括FGFR1高表达和突变。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽治疗的疾病为肿瘤。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽P48通过抑制FGFR1通路，抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。

作为优选的，短肽化合物P48具有稳定的二级结构及相对延长的半衰期。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽可制成药用盐、酯或药用辅料。

作为优选的，FGFR1拮抗短肽药物的制剂形式制成注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释、缓释剂或纳米制剂。

具体而言，本发明获得所述FGFR1拮抗短肽，其氨基酸序列如下(实施例1)：

Ser-Pro-Pro-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gly-Gly-Ser-NH₂

实验结果表明，与前体肽P9相比，本发明发现的降解短肽化合物P48具有稳定的二级结构及相对延长的半衰期。此外，经分子对接实验发现短肽化合物P48与FGFR1间能形成稳定的氢键。经SPR实验发现P48能与bFGF竞争性结合FGFR1，浓度越高，结合力越强(实施例1)。

同时，Western blot实验发现，在经高度转化的人胚肾细胞HEK-293及成纤维细胞MEF-WT，Balb/c 3T3中，短肽化合物P48能浓度依赖性的抑制由bFGF诱导的FGFR1激活(实施例2)。此外，短肽化合物P48对FGFR1信号的抑制作用与SSR相仿，其对下游PLCγ无明显抑制作用(实施例2)。选用野生型及FGFR1-FGFR2-FRS2α敲除的MEF细胞，通过流式细胞仪检测发现，短肽化合物P48仅对野生型MEF细胞有结合作用(实施例2)。

接着，选用FGFR1异常失调的多种肿瘤细胞株，经Western blot实验发现，短肽化合物P48能浓度依赖性的抑制包括***、黑色素瘤、肺癌、胃癌在内的FGFR1信号通路(实施例3)。此外，在胃癌细胞株中，短肽化合物P48对FGFR1信号的抑制作用也与SSR相当，其活性弱于AZD4547，这可能与其不同结合类型相关，即短肽化合物P48可能与SSR相似，为膜外抑制剂，而AZD4547为膜内抑制剂。经流式细胞术实验进一步发现，短肽化合物P48对细胞膜表面的FGFR1位点表现出良好的结合作用(实施例3)。进一步地，通过Western blot实验发现，短肽化合物P48仅能抑制由bFGF诱导的FGFR1激活，对aFGF、KGF、EGF刺激无效(实施例3)。

此外，在Hela229、B16-F10、NCI-H460和SGC-7901细胞中，短肽化合物P48能明显抑制癌细胞的活力。另外，在胃癌细胞SGC-7901中，与对照组相比，短肽化合物P48能浓度依赖性的抑制细胞迁移(实施例4)。通过流式周期实验发现，短肽化合物P48还能有效的将细胞周期阻滞在G0/G1期(实施例4)。

最后，在移植瘤小鼠模型中，短肽化合物P48能明显抑制胃癌细胞SGC-7901的生长，对FGFR1信号通路(包括磷酸化FLG、FRS2α、ERK1/2蛋白)表现出良好的抑制作用(实施例5)。另外，通过免疫组化实验发现，与对照组相比，短肽化合物P48能浓度依赖性抑制Ki67的表达(实施例5)。以上结果表明短肽化合物P48在体内也能通过抑制FGFR1通路，抑制细胞增殖起到良好的抗肿瘤活性(实验例5)。

如上所述，我们的研究结果表明，短肽化合物P48具有良好的稳定性，且能通过抑制FGFR1通路发挥抗肿瘤作用，具有开发为抗肿瘤药物的前景。

因此，本发明提供了一种高效稳定的FGFR1拮抗肽P48在制备抗肿瘤药物中的应用，抗肿瘤药物通过选择性抑制FGFR1信号通路抑制细胞增殖和迁移发挥***的作用。

本发明还提供了一种用于***的药物组合物，其含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述活性成分为上述FGFR1拮抗短肽或其可药用盐及其药用辅料。本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、磷酸钙等；润湿剂如蒸馏水、乙醇；粘合剂如淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇、海藻酸钠溶液等；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羌丙基纤维素、泡腾崩解剂等；润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、十二烷基硫酸钠等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

实施例1

短肽化合物P48的空间结构、稳定性及对FGFR1结合活性分析：

应用Amber11程序对P9的降解短肽P48进行氨基酸序列分析，结果见图1A。用Amber11程序Tleap模块中的sequence命令构建P9和P48肽链初始结构。用Amber11程序Tleap模块添加氢原子，在肽链

距离处添加截断的四面体TIP3P溶剂盒，在两个体系中分别添加抗衡离子以保持体系呈电中性。体系进行20ns的NPT系宗模拟，得到最优空间结构，结果见图1B。图1C表示P9和P48在血浆中的半衰期。实验步骤如下：血浆离心去上清，加60μl肽孵育不同时间(P9孵育5、10、15、20、25、30、45分钟，P48孵育1、2、3、4、5、10、12小时)，用200μl 5％冰醋酸终止，固相萃取：先用1.5ml甲醇活化，再用1.5mlH₂O洗，取400μl样品上样，1mlH₂O洗，2ml 30％乙腈洗脱收集样品，冷冻干燥，进行液相色谱分析。图1D表示FGF2-FGFR1复合物体系的分子动力学模拟，确定维持FGF2-FGFR1结合的关键性氨基酸残基。实验步骤如下：选择FGF2-FGFR1蛋白质晶体结构(PDB ID:1CVS)构建分子动力学模拟的FGF2-FGFR1复合物体系初始结构。用Amber11程序Tleap模块给体系添加氢原子，在复合物

距离处添加截断的四面体TIP3P溶剂盒，体系中添加抗衡离子以保持体系呈电中性。体系采用Amber99SB力场，用Sander模块对体系进行能量最小化。计算结合自由能时，选取体系分子动力学模拟所得轨迹中的最后1ns的轨迹计算，删除其中溶剂水分子和抗衡离子，每10ps取一次构象，共得到101个结构。用分子力学广义波恩/表面积(MM-GBSA)方法计算FGF2和FGFR1之间的结合自由能。结合自由能和氨基酸残基能量分解的计算用均采用Amber11提供的MMPBSA.py脚本进行。上述实验步骤可确定FGFR1结合位点，接着，在Discovery StudioVisualizer 3.5将P48置于FGFR1结合位点处，并保存相应复合物体系文件P48-FGFR1.pdb，作为分子动力学模拟初始结构文件。其中，FGFR1坐标选自FGF2-FGFR1蛋白质晶体结构(PDBID:1CVS)A链中的FGFR1。用Amber11程序Tleap模块给体系添加氢原子，在复合物距离处添加截断的四面体TIP3P溶剂盒，两个体系中分别添加抗衡离子以保持体系呈电中性。体系进行20ns的NPT系宗模拟，实验结果见图1E。图1F表示P48与FGFR1的相互作用。实验步骤如下：用30μl/min PBS洗涤传感器芯片，用40mM EDAC和10mM sNHS的激活型缓冲液进行活化。bFGF、FGFR1流入传感器芯片后，将P48(50μM、100μM、200μM、300μM、400μM)注入到传感器表面，使用BIAevaluation软件分析所得数据。

实施例2

短肽化合物P48对高度转化的人胚肾细胞及成纤维细胞FGFR1信号通路的抑制活性：

将人胚肾细胞HEK-293及成纤维细胞MEF-WT、Balb/c 3T3分别接种于6孔板。细胞过夜贴壁后，用P48预处理10分钟或AZD4547/PD173074/SSR预处理2小时，bFGF孵育15分钟。图2A表示P48/AZD4547/PD173074对HEK-293、MEF-WT、Balb/c3T3细胞中FGFR1及其下游蛋白(FRS2α、ERK1/2、AKT)的抑制情况。图2B表示P48/AZD4547/SSR对MEF-WT细胞中FGFR1下游蛋白PLCγ的抑制情况。图2C表示P48在MEF-WT和FGFR1-FGFR2-FRS2α敲除的MEF细胞中与FGFR1的结合能力。实验步骤如下：将MEF-WT和MEF^{KO(FGFR1-FGFR2-FRS2α)}细胞(1×10⁶个细胞/ml)接种于35mm培养皿中。细胞过夜贴壁后，PBS洗涤细胞，加入与FITC-共轭的P48(1、10、100、1000nM)置于培养箱中孵育30分钟。于暗处用1％多聚甲醛固定细胞并用PBS洗涤。在荧光通道1(FL-1)(530nm)处测定FITC的表达水平，激发波长为488nm。应用CellQuest软件(BectonDickinson)进行数据分析。

实施例3

短肽化合物P48对多种肿瘤细胞FGFR1信号通路的抑制活性：

将***细胞Hela229、黑色素瘤B16-F10、肺癌细胞NCI-H460及胃癌细胞SGC-7901、MGC-803分别接种于6孔板。细胞过夜贴壁后，用P48预处理10分钟或AZD4547/SSR预处理2小时，bFGF/aFGF孵育15分钟或KGF孵育20分钟。图3A表示在bFGF刺激下，P48/AZD4547对Hela229、B16-F10、NCI-H460、MGC-803、SGC-7901细胞中FGFR1及其下游蛋白(FRS2α、ERK1/2、AKT)的抑制情况。图3B表示在bFGF刺激下，P48/AZD4547/SSR对SGC-7901细胞中FGFR1及其下游蛋白(FRS2α、ERK1/2)的抑制情况。图3C表示在bFGF/aFGF/KGF刺激下，P48对SGC-7901细胞中FGFR1及其下游蛋白(FRS2α、ERK1/2)的抑制情况。图3D表示在EGF刺激下，P48对PC-9细胞中EGFR及ERK1/2的抑制情况。图3E表示P48在SGC-7901细胞中与FGFR1的结合，实验步骤同实施例图2C。

实施例4

短肽化合物P48的体外抗肿瘤活性：

将Hela229(1500个细胞/100μl)、B16-F10(1000个细胞/100μl)、NCI-H460(4000个细胞/100μl)及SGC7901(4000个细胞/100μl)细胞接种于96孔板。过夜贴壁后，用含0.1％FBS的DMEM或RPMI-1640培养基替代原培养基继续培养24小时。将P48与bFGF的混合物及单独的bFGF分别加入相对应孔内，孵育48小时后，将磷酸盐缓冲溶液(PBS)制备的MTT溶液(5mg/mL)在37℃下加入各孔中的细胞，再处理4小时。然后吸出MTT，每孔加入150μL DMSO，震动10分钟，最后在490nm纳米波长下用酶标仪定量(SpectraMax M2/M2e，MolecularDevices，Sunnyvale，USA)测定OD值。通过与bFGF组的比较来计算药物生长抑制率的百分比，结果见图4A。图4B结果表示P48能浓度依赖性的抑制胃癌细胞SGC-7901的迁移。实验步骤如下：将含有10％FBS的培养基(500μl)加入到transwell***室的下表面，将细胞连同药物一起接种到上室，用无血清培养基(200μl)进行培养。培养箱内培养24小时后，将下室细胞用预冷的甲醇固定并用结晶紫染色，同时用棉签除去上室细胞。最后，在光学显微镜下捕获迁移细胞。图4C结果表示P48能浓度依赖性的使胃癌细胞SGC-7901阻滞在G0/G1期。实验步骤如下：将SGC-7901细胞(6×10⁵个细胞/孔)接种在直径为60mm的培养皿中。用P48和bFGF的混合物、bFGF和载体(PBS)处理细胞24小时，用PBS洗涤，固定在75％冰冷的乙醇中过夜。然后将细胞用含有核糖核酸酶(550825，BD Biosciences 35Clontech，San Jose，CA，USA)的500μL碘化丙啶(PI)在4℃远离光线染色10分钟，并用200目纱布过滤。在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences，CA)中进行细胞周期分析。

实施例5

短肽化合物P48的体外抗肿瘤活性：

将SGC-7901细胞皮下注射到BALB/c裸鼠背部。10天后，将小鼠随机分为4组，每组12只，进行腹腔给药。给药组设模型组(生理盐水组)、AZD4547组(20mg/kg.d)、P48组(32mg/kg.d,64mg/kg.d)组。使用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。使用V＝0.52×L×W²公式计算肿瘤体积。每隔3天记录小鼠的体重，并在小鼠死亡当天记录肿瘤大小。28天后，处死裸鼠进行解剖，取出组织样品并进一步研究。结果见图5。其中A表示小鼠的体重变化。B表示肿瘤的体积及大小。C表示经P48处理后，磷酸化FLG、FRS2α、ERK1/2在体内的表达情况。D表示经P48处理后，Ki67在体内的表达情况。

综上所述：本发明人通过不懈努力，获得了短肽化合物P48，并发现其具有稳定的二级结构及相对较长的半衰期。此外，短肽化合物P48能有效靶向抑制FGFR1，在体内外表现出良好的抗肿瘤活性，有望成为癌症治疗的候选肽类抑制剂药物。

上述实施例对本发明的具体描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术工程师根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。