阅读说明：本技术 一种特异性分析高尔基体中硫化氢的荧光探针制备与应用 (Preparation and application of fluorescent probe for specifically analyzing hydrogen sulfide in Golgi apparatus ) 是由 祝汉闯 柳彩云 梁长旭 张涵铭 贾盼 李子璐 朱宝存 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种特异性分析高尔基体中硫化氢的荧光探针制备与应用,具体地,本发明的探针是一类萘酰亚胺类化合物的荧光探针,可作为硫化氢荧光探针,尤其是其能够靶向定位高尔基体,用于测量、检测或筛选高尔基体中的硫化氢。这类探针可实现如下技术效果中的至少一个：选择性高,能够测量、检测或筛选高尔基体中的硫化氢；抗干扰能力强,能够防止生命体内的其他物质对应该探针检测的干扰；灵敏度高,适合于生命体内微量硫化氢的检测；合成简单,性质稳定,适用于商业推广使用。(The invention relates to preparation and application of a fluorescent probe for specifically analyzing hydrogen sulfide in a Golgi apparatus, in particular to a fluorescent probe for naphthalimide compounds, which can be used as a hydrogen sulfide fluorescent probe, especially can be used for targeting positioning of the Golgi apparatus and is used for measuring, detecting or screening the hydrogen sulfide in the Golgi apparatus. Such probes can achieve at least one of the following technical effects: the selectivity is high, and hydrogen sulfide in a Golgi apparatus can be measured, detected or screened; the anti-interference capability is strong, and the interference of other substances in the life body corresponding to the detection of the probe can be prevented; the sensitivity is high, and the method is suitable for detecting trace hydrogen sulfide in a living body; simple synthesis and stable property, and is suitable for commercial popularization and use.)

一种特异性分析高尔基体中硫化氢的荧光探针制备与应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种萘酰亚胺类化合物的荧光探针及其在测量、检测或筛选高尔基体中的硫化氢及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。

背景技术

硫化氢是具有刺激性和窒息性的无色气体.低浓度接触仅有呼吸道及眼的局部刺激作用,高浓度时全身作用较明显,表现为中枢神经系统症状和窒息症状.硫化氢具有"臭鸡蛋"气味,但极高浓度的硫化氢会很快引起嗅觉疲劳而不觉其味.硫化氢会对眼和呼吸道粘膜产生强烈的刺激作用.硫化氢吸收后主要影响细胞氧化过程,造成组织缺氧.轻者主要是刺激症状,表现为流泪,眼刺痛,流涕,咽喉部灼热感,或伴有头痛,头晕,乏力,恶心等症状，另外,内源性硫化氢已被证明是一种神经调节剂，同时还提供细胞保护剂、神经保护剂、抗炎剂、抗氧化剂、细胞凋亡剂等。

鉴于此，发展能够有效检测特别是在特定细胞器中对硫化氢的含量波动进行监测的分析方法是极其重要和有意义的。现如今已报导的检测硫化氢的分析方法包括汞量法、检测管法、亚甲基蓝比色法等方法。在这些众多的检测方法中荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。然而，目前报道的荧光探针仍存在一些问题，包括选择性不够好、响应速度不够快、合成复杂、无法检测分析特定细胞器中的硫化氢。由于生命体内的其他成分如丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、硫酸根(SO₄ ^2-)、亚硫酸氢根(HSO₃ ^-)、氯离子(Cl^-)、碳酸根(CO₃ ^2-)、碳酸氢根(HCO₃ ^-)、硝酸根(NO₃ ^-)、亚硫酸根(SO₃ ^2-)、过氧化氢(H₂O₂)、次氯酸根(ClO^-)等存在，对硫化氢的检测构成潜在干扰，因此，发展快速，高选择性、高灵敏度、合成简单、并且能够测量、检测或筛选高尔基体中的硫化氢荧光探针，成为本领域技术人员亟待解决的课题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类高选择性分析高尔基体中硫化氢的荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高、能够测量、检测或筛选高尔基体中的硫化氢的特点。

具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉均为氢原子的式(I)化合物，其结构式如下：

本发明还提供了式(Ⅰ)或式(Ⅱ)化合物的制备方法，包括如下步骤：将式(III)化合物与叠氮化钠溶于二甲基亚砜(DMSO)中，然后加热搅拌至反应结束，将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，分离提纯，得纯净式(I)化合物，其反应式如下：

其中：R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，所述反应时间为6-48小时。

在本发明的一些具体实施方案中，所述式(III)化合物与叠氮化钠的摩尔比为1:1-10:1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述加热反应温度为80-100℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述分离提纯方法为色谱柱分离。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色谱柱分离使用的洗脱剂为二氯甲烷和石油醚的混合溶剂。

在本发明的一些具体实施方案中，将R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉为氢原子的式(Ⅲ)化合物与叠氮化钠溶于二甲基亚砜(DMSO)中，二者的摩尔比为1:1-1:5，然后，加热搅拌10-16小时。将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1-1:3)作为洗脱剂，通过色谱柱提纯分离得到纯净式(I)化合物。

本发明还提供了用于测量、检测或筛选硫化氢的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物具有以下结构：

在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。

本发明还提供了检测样品中硫化氢的存在或测定样品中的硫化氢含量的方法，其包括：

a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；

b)测定所述荧光化合物的荧光性质。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。

本发明还提供了检测样品中硫化氢的存在或测定样品中的硫化氢含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(II)化合物。

本发明还提供了所述式(I)或式(II)化合物在细胞荧光成像中的应用。

本发明还提供了所述式(I)或式(II)化合物在靶向定位高尔基体测量、检测或筛选硫化氢中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：选择性高，能够特异性识别高尔基体中的硫化氢；抗干扰能力强，能够防止生命体内的其他物质对应该探针检测的干扰；灵敏度高，适合于生命体内微量硫化氢的检测；合成简单，性质稳定，适用于商业推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1(a)探针(5μM)加入硫化氢(0-100μM)前后的荧光光谱；

图1(b)探针(5μM)定量分析不同浓度硫化氢(0-30μM)的工作曲线；

图2人体内常见的物质对探针(5μM)的荧光强度的影响。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在550nm处的荧光强度值；

图3探针和不同商用细胞器染料对细胞进行孵育，采用共聚焦显微镜采集成像图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1：式(II)化合物的合成

合成设计路线如下：

实施方案1：将386mg(1mmol)式(Ⅳ)化合物与叠氮化钠65mg(1mmol)溶于DMSO中，90℃加热搅拌10h，将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1)作为洗脱剂，通过色谱柱提纯分离得到纯净式(Ⅱ)化合物。得到暗黄色得到暗黄色式(Ⅱ)化合物235mg，产率为60％。

实施方案2：将386mg(1mmol)式(Ⅳ)化合物与叠氮化钠130mg(2mmol)溶于DMSO中，90℃加热搅拌11h，将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1)作为洗脱剂，通过色谱柱提纯分离得到纯净式(Ⅱ)化合物。得到暗黄色式(Ⅱ)化合物247mg，产率为63％。

实施方案3：将386mg(1mmol)式(Ⅳ)化合物与叠氮化钠195mg(3mmol)溶于DMSO中，90℃加热搅拌12h，将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1)作为洗脱剂，通过色谱柱提纯分离得到纯净式(Ⅱ)化合物。得到暗黄色式(Ⅱ)化合物255mg，产率为65％。

实施方案4：将386mg(1mmol)式(Ⅳ)化合物与叠氮化钠260mg(4mmol)溶于DMSO中，90℃加热搅拌13h，将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1)作为洗脱剂，通过色谱柱提纯分离得到纯净式(Ⅱ)化合物。得到暗黄色式(Ⅱ)化合物267mg，产率为68％。

实施方案5：将386mg(1mmol)式(Ⅳ)化合物与叠氮化钠325mg(5mmol)溶于DMSO中，90℃加热搅拌14h，将反应液进行萃取抽滤得到粗产品，将粗产品用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1)作为洗脱剂，通过色谱柱提纯分离得到纯净式(Ⅱ)化合物。得到暗黄色式(Ⅱ)化合物290mg，产率为74％。

实施例2：测试荧光探针对于硫化氢的浓度梯度

配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的硫化氢(0-100μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后静置30min。上述测定是在纯水体系(0.5mM PBS,pH 7.4)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

用荧光光谱仪测试其荧光强度变化，从图1a可以清晰的看出，随着硫化氢浓度的增加，550nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图1b可以看出荧光探针(5μM)加入硫化氢(0-30μM)之后荧光强度呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对硫化氢进行定量分析。

实施例3：测试荧光探针对于硫化氢的选择性

分析物包括：1空白探针(5μM)、2钾离子(K⁺)、3钙离子(Ca²⁺)、4钠离子(Na⁺)、5氟离子(F^-)、6氯离子(Cl^-)、7溴离子(Br^-)、8苯丙氨酸(Phe)、9蛋氨酸(Met)、10甘氨酸(Gly)、11谷氨酸(Glu)、12精氨酸(Arg)、13赖氨酸(Lys)、14色氨酸(Trp)、15丝氨酸(Ser)、16苏氨酸(Thr)、17天冬氨酸(Asp)、18脯氨酸(Pro)、19亮氨酸(Leu)、20磷酸根(PO₄ ^3-)、21硫酸根(SO₄ ^2-)22半胱氨酸(Cys)、23谷胱甘肽(GSH)、24硫化氢(100μM)，除特殊标注外分析物的浓度均为1mM。所有测试条件是纯水体系(0.5mM PBS,pH 7.4)中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25℃下分析物加入30分钟后测得的。具体地，先加入一部分水然后加入0.5mL PBS7.4(10mM)缓冲溶液，再分别移取100μL上述分析物(2-23)储备液(100mM)加入管内，最后用水定容至10mL。结果如图2所示，图2采集的是发射波长在550nm处的荧光强度。从图2可以看出，探针具有良好的选择性，能够特异性识别硫化氢。

实施例4：利用探针和不同商用细胞器染料对不同细胞进行标记实验

HeLa细胞先用硫化氢(100μM)进行孵育30分钟，然后加入探针(10μM)和商用细胞器染料(线粒体，内质网，溶酶体，高尔基体)共孵育30分钟后用磷酸盐缓冲液进行清洗3次减少背景荧光，采用共聚焦显微镜进行成像，绿色通道激发波长488nm，收集波长510-590nm；红色通道：线粒体激发波长578nm，收集波长590-640nm；内质网激发波长594nm，收集波长600-670nm；溶酶体激发波长559nm，收集波长585-620nm；高尔基体发波长633nm，收集波长634-740nm。从图3可以看出，该探针有较强的组织穿透性能够检测细胞内的硫化氢，通过与高尔基体等染料标记对比，在叠加场以及红绿荧光重叠系数图(A4-D4)可以看出该探针与高尔基体重叠效果最好，重叠系数分别为线粒体(0.26)，内质网(0.18)，溶酶体(0.33)，高尔基体(0.94)，表现出探针优秀的靶向定位高尔基体的能力。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。