阅读说明：本技术 一种阿巴帕肽的固相合成方法 (Solid-phase synthesis method of abamectin ) 是由 陶志强 李国弢 姚志军 宓鹏程 陶安进 袁建成 于 2018-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种阿巴帕肽的固相合成方法,具体公开了一种通过使用本发明的Asp上的Fmoc保护基脱除剂脱除Fmoc保护基,所述的脱除剂为AlCl<Sub>3</Sub>的NMP溶液及吲哚；本发明的方法有效地降低杂质含量,提高产率。(The invention relates to a solid-phase synthesis method of abamectin, and particularly discloses a method for removing Fmoc protective groups by using an AlCl removing agent on Asp (Asp) 3 NMP solution and indole; the method of the invention effectively reduces the impurity content and improves the yield.)

一种阿巴帕肽的固相合成方法

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种阿巴帕肽的固相合成方法

背景技术

阿巴帕肽(Abaloparatide)是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽，用于伴有骨折高风险的绝经后女性骨质疏松症的治疗。2017年4月28日在美国上市，商品名为TYMLOS。特立帕肽与阿巴帕肽都是甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，但阿巴帕肽能够更好的降低骨折率和高钙血症发生率。

阿巴帕肽由34个氨基酸组成，分子式为C₁₇₄H₃₀₀N₅₆O₄₉，分子量为3961。其肽序如下所示：

H-Ala¹-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys¹¹-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg²¹-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Aib-Lys-Leu³¹-His-Thr-Ala-NH₂

原研专利US5969095主要采用Boc策略固相逐步偶联法进行合成，需要强酸HF裂解，危险系数高。专利CN201510136475中合成全保护多肽片段需要大量昂贵的2-CTC树脂，生产成本高。CN108047329优先合成Fmoc-Thr(OtBu)-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH、Fmoc-Ala-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH等小片段后进行固相偶联，虽然能减少Gly、Ala增加杂质及Arg缺损杂质的产生，但优先合成小片段杂质增加工艺复杂性。而且，阿巴帕肽序列中第10和17位是两个天冬氨酸，在多肽合成中固相依序偶联完天冬氨酸后，用20％哌啶DMF溶液脱保护时通常易产生天冬酰亚胺杂质及加哌啶杂质，反应式如下所示：

如上所示反应式，哌啶作为一种碱用于脱除N端Fmoc保护基时容易发生天冬酰亚胺副反应。文献报道在20％哌啶DMF溶液中加入1％HOBt虽然能有效的降低该副反应的发生(Org.Lett.,Vol.14,No.20,2012)，但仍然无法避免该杂质的产生。

发明内容

针对现有技术缺陷，为了避免杂质的生成，需要一种新的合成方法。

本发明一个方面提供了一种阿巴帕肽的具体制备方法，其包括如下步骤：

步骤1：按Fmoc保护策略依序偶联合成Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala--固相合成树脂；

步骤2：在惰性气体保护下，加AlCl₃的NMP溶液及吲哚，脱除Asp上的Fmoc保护基；

步骤3：继续按Fmoc保护策略依次偶联合成Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-固相合成树脂；

步骤4：在惰性气体保护下，加AlCl₃的NMP溶液及吲哚，脱除Asp上的Fmoc保护基；

步骤5：继续按Fmoc保护策略依次偶联获得全保护的阿巴帕肽-固相合成树脂；

步骤6：加入裂解剂，裂解固相合成树脂以及侧链保护基，得到阿巴帕肽；

任选地，步骤7：反相色谱制备纯化获得精肽。

步骤1、3、5中Fmoc保护策略为：在固相合成树脂或者多肽-固相合成树脂上偶联Fmoc保护的氨基酸；脱除末端的Fmoc保护基，然后再偶联下一位Fmoc保护的氨基酸，直至完成。

在本发明的技术方案中，在固相合成树脂使用前将固相合成树脂用溶剂进行溶胀，所选溶剂包括DMF、NMP、二氯甲烷等，优选DMF。

在本发明的技术方案中，脱除非Asp氨基酸末端的Fmoc保护基的脱除剂为20％的哌啶/DMF溶液。

在本发明的技术方案中，在固相合成树脂或者多肽-固相合成树脂上偶联Fmoc保护的氨基酸的方法为以偶联剂活化，将待偶联氨基酸与固相合成树脂或者多肽-固相合成树脂进行偶联至反应完成。

在本发明的技术方案中，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOAt或HOBt，化合物B为PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。

在本发明的技术方案中，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。

在本发明的技术方案中，所述的固相合成树脂为氨基固相合成树脂，优选为RinkAmide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin或Rink Amide Resin。

在本发明的技术方案中，所述的固相合成树脂的替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.2-0.4mmol/g。

在本发明的技术方案中，所述步骤2和步骤4中脱除，脱除Asp上的Fmoc保护基的脱除试剂为AlCl₃的有机溶液，且AlCl₃的有机溶液中添加了吲哚，所述AlCl₃用量为反应底物3倍摩尔当量，吲哚的用量为反应底物1倍摩尔当量。所述有机溶液使用的有机溶剂为NMP。

在本发明的技术方案中，所述步骤2和步骤4中脱除，脱除Asp上的Fmoc保护基后以有机溶剂洗涤再用DMF洗涤；溶剂为能够溶解AlCl₃的溶剂，优选甲苯、水、乙醇、***和四氯化碳。脱保护时间通常为2-4小时，优选3小时。温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。

在本发明的技术方案中，步骤6中所用裂解液为TFA、H₂O、EDT、苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚的不同比例混合物，优选R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2)。

在本发明的技术方案中，步骤7所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法。进一步地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。

本发明通过在偶联肽序中两个Fmoc-Asp(OtBu)-OH后，用AlCl₃的NMP溶液替换DBLK溶液脱进行脱保护反应。以AlCl₃替代有机碱哌啶进行脱保护，能很好的降低碱作用下的天冬酰亚胺副反应，从而提高粗肽纯度，降低纯化难度，提高产品收率。加入吲哚可以捕获芴烯，从而促进脱Fmoc保护基完全，减少单独用AlCl₃甲苯溶液脱Fmoc保护基不完全造成的缺损肽杂质。

不希望被理论束缚，但是通过本发明的方案以及对比组的实验可知，本发明的技术方案取得了预料不到技术效果。发明人认为有可能由于AlCl₃的甲苯溶液能有效地脱除N端Fmoc保护基(Eur.J.Org.Chem.2000(4),573-575)，而本发明采用AlCl₃应用于阿巴帕肽序列中Asp的Fmoc保护基脱除，以AlCl₃替代有机碱哌啶进行脱保护，能很好的避免碱作用下的天冬酰亚胺副反应，从而提高粗肽纯度，降低纯化难度，提高产品收率。文献中AlCl₃甲苯溶液在液相反应中的转化率仅为86～95％之间，在固相反应脱除保护基时，由于非均相反应，使得脱保护效果更差，使得该方法无法应用于固相多肽合成。本发明以溶解性更好的氮甲基吡咯烷酮(NMP)作溶剂，加入少量吲哚作捕获剂，吲哚可通过傅克烷基化反应及吲哚环氮上孤对电子双重作用对芴正离子进行捕获，从而提高AlCl₃固相脱保护反应效率，使Fmoc保护基脱除完全，又避免了天冬酰亚胺副反应的发生。

有益效果

本发明的方法杂质含量大幅下降，且收率和纯度显著提高；制备方法简单，原料成本低。

附图说明

图1为精肽质谱图。

图2为天冬酰亚胺杂质质谱图。

具体实施方式

实施例1

称取Rink Amide resin(50g，替代度为0.3mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ala-OH(23.348g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复此常规偶联操作，从C端至N端依序偶联氨基酸，氨基酸用量为5eqv，每次偶联两小时。在肽序第17位偶联完第一个Fmoc-Asp(OtBu)-OH后用DMF洗涤树脂3次，将反应底物3倍摩尔当量的AlCl₃和反应底物1倍摩尔当量的捕获剂吲哚溶于3-5倍树脂体积的NMP溶剂中，搅拌溶清后，加入反应柱内，氮气鼓泡3小时后真空抽除反应液，用NMP洗三次后再用DMF洗三次。然后按常规方法继续偶联至第二个Fmoc-Asp(OtBu)-OH，用DMF洗涤树脂3次，加入反应底物3倍摩尔当量的AlCl₃的NMP溶液及反应底物1倍摩尔当量的捕获剂吲哚，氮气鼓泡3小时后真空抽除反应液，用NMP洗三次后再用DMF洗三次。继续常规偶联完所有氨基酸，用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂146.2g。加入到2L烧瓶内，加入预冻至-15℃的R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2，1L)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰***中沉淀。离心，冰***洗涤5次，氮气吹干得到粗肽66.66克，粗肽纯度80.86％，未检出天冬酰亚胺杂质。粗肽用高效液相纯化，得精肽32.7g，纯度99.73％，收率54.5％，质谱信息为3959(见图1)。

实施例2：对比实施例(甲苯作溶剂)

将实施例1中的NMP换成甲苯作溶剂，加入1eqv的吲哚作为捕获剂进行脱保护得到肽树脂136.6g。加入到2L烧瓶内，加入预冻至-15℃的R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2，1L)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰***中沉淀。离心，冰***洗涤5次，氮气吹干得到粗肽59.52克，粗肽纯度68.2％，未检出天冬酰亚胺杂质。经检测，纯度低是由于脱保护不完全导致缺损杂质较多。粗肽用高效液相纯化，得精肽25.2g，纯度98.83％，收率42.0％。

实施例3：对比实施例(NMP作溶剂，不加捕获剂吲哚)

将实施例1中用3eqv AlCl₃的NMP溶液，但不加人吲哚作为捕获剂进行脱保护得到肽树脂106.2g。加入到2L烧瓶内，加入预冻至-15℃的R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2，1L)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰***中沉淀。离心，冰***洗涤5次，氮气吹干得到粗肽47.48克，粗肽纯度41.43％。经检测，纯度低是由于脱保护不完全导致缺损杂质较多。粗肽用高效液相纯化，得精肽10.3g，纯度98.89％，收率17.2％。

实施例4：对比实施例(20％DBLK脱保护)

称取Rink Amide resin(50g，替代度为0.3mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ala-OH(23.348g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复此常规偶联操作，从C端至N端依序偶联氨基酸，氨基酸用量为5eqv，每次偶联两小时。两次偶联完Fmoc-Asp(OtBu)-OH后均用DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次。偶联完所有氨基酸后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂145.8g。得到的肽树脂145.8g加入到2L烧瓶内，加入预冻至-15℃的R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2，1L)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰***中沉淀。离心，冰***洗涤5次，氮气吹干得到粗肽63.49克，粗肽纯度48.79％，天冬酰亚胺杂质纯度为18.70％，杂质质谱信息位3941(参见图2)。粗肽用高效液相纯化，得精肽15.52g，纯度98.27％，收率25.8％。

实施例5：对比实施例(20％DBLK+1％HOBt脱保护)

称取Rink Amide resin(50g，替代度为0.3mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ala-OH(23.348g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复此常规偶联操作，从C端至N端依序偶联氨基酸，氨基酸用量为5eqv，每次偶联两小时。两次偶联完Fmoc-Asp(OtBu)-OH后20％DBLK溶液中加入1％HOBt，加入到固相反应柱中脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次。偶联完所有氨基酸后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂144.9g。得到的肽树脂144.9g加入到2L烧瓶内，加入预冻至-15℃的R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2，1L)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰***中沉淀。离心，冰***洗涤5次，氮气吹干得到粗肽62.69克，粗肽纯度67.24％，天冬酰亚胺杂质纯度为6.70％。粗肽用高效液相纯化，得精肽19.38g，纯度98.70％，收率32.3％。

实施例6：对比实施例(AlCl₃甲苯溶液脱保护)

称取Rink Amide resin(50g，替代度为0.3mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ala-OH(23.348g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复此常规偶联操作，从C端至N端依序偶联氨基酸，氨基酸用量为5eqv，每次偶联两小时。两次偶联完Fmoc-Asp(OtBu)-OH后加入3eqv AlCl₃甲苯溶液脱保护3小时，DMF洗涤树脂6次。偶联完所有氨基酸后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂125.4g。得到的肽树脂125.4g加入到2L烧瓶内，加入预冻至-15℃的R裂解试剂(TFA:苯甲硫醚：苯甲醚：EDT＝90:5:3:2，1L)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰***中沉淀。离心，冰***洗涤5次，氮气吹干得到粗肽42.29克，粗肽纯度27.24％。粗肽用高效液相纯化，得精肽6.71g，纯度98.70％，收率11.2％。