一种阿巴帕肽的固相合成方法
阅读说明：本技术 一种阿巴帕肽的固相合成方法 (Solid-phase synthesis method of abamectin ) 是由 刘志国 章砚东 潘海良 吴潇钿 汪岳斌 于 2021-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种阿巴帕肽的固相合成方法,属于药物化学领域,包括按照阿巴帕肽的肽链C端至N端的氨基酸顺序,合成1-9片段、10-20片段、21-34片段,然后以二甲基甲酰胺和乙二醇二缩水甘油醚为溶剂,以HBTU/HOBT/DIPEA三试剂为偶联体系将3个片段进行偶联,得到阿巴帕肽。本发明提供的一种阿巴帕肽的固相合成方法具有成本较低、操作简单、产率高、纯度高的优点。(The invention provides a solid-phase synthesis method of abamectin, belonging to the field of pharmaceutical chemistry, which comprises the steps of synthesizing 1-9 fragments, 10-20 fragments and 21-34 fragments according to the amino acid sequence from the C end to the N end of a peptide chain of the abamectin, and then coupling 3 fragments by using dimethylformamide and ethylene glycol diglycidyl ether as solvents and using HBTU/HOBT/DIPEA three reagents as a coupling system to obtain the abamectin. The solid-phase synthesis method of the abamectin has the advantages of low cost, simplicity in operation, high yield and high purity.)
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种阿巴帕肽的固相合成方法。
背景技术
阿巴帕肽(Abaloparatide)是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽，用于伴有骨折高风险的绝经后女性骨质疏松症的治疗。2017年4月28日在美国上市，商品名为TYMLOS。特立帕肽与阿巴帕肽都是甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，但阿巴帕肽能够更好的降低骨折率和高钙血症发生率。
阿巴帕肽由34个氨基酸组成，分子式为C174H300N56O49，分子量为3960.59。
现有技术如公开号为CN 111944040 B的中国发明专利，公开了一种固相树脂结构如式I所示；RinkAmide Linker-AAn-AM树脂I其中的AA为下述相同或不相同的带侧链保护的氨基酸：Lys、Arg；n为2-6的整数。所述固相树脂可用于阿巴帕肽的固相合成。该方法的亮点以及优势是使用了带有疏水性的Rink Amide Linker-AAn-AM树脂替代传统的固相偶联起始树脂，有效避免了在合成阿巴帕肽肽序过程中由于肽序的β折叠导致产生大量的缺失杂质。同时选用Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH作为连续Arg-Arg-Arg的保护型氨基酸，有效避免了连续精氨酸困难序列偶联导致产生大量的缺失Arg的杂质。该发明工艺操作简单，粗品纯度高，产率高，具备良好的工业化生产前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿巴帕肽的固相合成方法，该方法能够促进合成过程较长的肽链的快速溶解，提高大位阻氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率，提高阿巴帕肽的产率和纯度。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种阿巴帕肽的固相合成方法，具体步骤包括：
A、按照Fmoc保护策略依序偶联合成Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-氨基树脂，脱除Fmoc保护基后，得到肽树脂片段1；
按照Fmoc保护策略依序偶联合成Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂后，得到肽片段2；
按照Fmoc保护策略依序偶联合成Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-2CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂后，得到肽片段3；
B、将肽片段2的C端与肽树脂片段1的N端进行偶联反应得到肽树脂Ⅰ；
C、脱去肽树脂Ⅰ的N端保护基，与肽片段3的C端进行偶联反应得到肽树脂Ⅱ；
D、加入裂解液去除肽树脂Ⅱ的树脂和所有保护基，得到阿巴帕肽；
任选地，步骤E、反相色谱制备纯化，获得阿巴帕肽纯品；
上述Fmoc为氨基酸N端保护基，tBu、Trt、Boc、OtBu、Pbf为氨基酸侧链保护基。
上述步骤A中Fmoc保护策略为：在固相合成树脂或者多肽-固相合成树脂上偶联Fmoc保护的氨基酸；脱除末端的Fmoc保护基，然后再偶联下一位Fmoc保护的氨基酸，直至完成。
在某些实施方案中，上述步骤B和步骤C中偶联反应以HBTU（O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯）/HOBT（1-羟基苯并三唑）/DIPEA（N,N-二异丙基乙胺）三试剂偶联体系进行偶联。进一步地，上述偶联体系各偶联试剂之间的摩尔比为：HBTU:HOBT:DIPEA=1-2:1-2:2-4。
在某些实施方案中，上述步骤B和步骤C偶联反应以DMF（二甲基甲酰胺）和乙二醇二缩水甘油醚为溶剂。进一步地，DMF和乙二醇二缩水甘油醚的体积比为2-4:1-2。以体积比为2-4:1-2的DMF和乙二醇二缩水甘油醚为溶剂能够增加阿巴帕肽的肽链的溶解度，作为偶联反应溶剂时，有利于合成过程中较长的肽链的快速溶解，有利于缩合反应的进行，能够减少反应时间，提高反应效率，进而能够提高产品产率和产物纯度、降低生产成本、简化操作步骤。
在某些实施方案中，上述步骤D中的裂解液包括TFA（三氟乙酸）、苯甲硫醚、TIS（三异丙基硅烷）和水，对应的体积比为80-90:3-8:3-8:3-8。
在某些实施方案中，上述步骤A中肽树脂片段1的合成方法具体包含：
a1、Fmoc-Ala-OH在偶联体系作用下与氨基树脂进行偶联反应，得到Fmoc-Ala-氨基树脂；
a2、Fmoc-Ala-氨基树脂进行Fmoc保护基的脱保护后，在偶联体系作用下与Fmoc-Thr(tBu)-OH进行偶联反应，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ala-氨基树脂；
a3、依次逐个将Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH按照步骤a2的偶联方式进行氨基酸延伸偶联，脱除N端Fmoc保护基得到H-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-氨基树脂，即肽树脂片段1。
优选地，上述氨基树脂包括但不限于Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂。进一步地，上述树脂的取代度为0.5-1.0mmol/g。
优选地，上述肽树脂片段1的合成中的偶联体系为HOBT/DIC（N,N-二异丙基碳二亚胺）。进一步地，上述偶联体系中HOBT和DIC的摩尔比为1:1-1.5。
优选地，上述肽树脂片段1的合成中偶联反应以DMF为溶剂。
在某些实施方案中，上述步骤A中肽片段2的合成方法具体包含：
b1、Fmoc-Glu(OtBu)-OH在偶联体系作用下与2-CTC树脂进行偶联反应，得到Fmoc-Glu(OtBu)-2CTC树脂；
b2、Fmoc-Glu(OtBu)-2CTC树脂进行Fmoc保护基的脱保护后，在偶联体系作用下与Fmoc-Leu-OH进行偶联反应，得到Fmoc-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；
b3、依次逐个将Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH按照步骤b2的偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂，得到Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-OH，即肽片段2。
优选地，上述肽片段2的合成中的偶联体系为HOBT/DIC。进一步地，上述偶联体系中HOBT和DIC的摩尔比为1:1-1.5。
优选地，上述肽片段2的合成中偶联反应以体积比为1:1-3的DCM和DMF的混合溶剂为溶剂。
更为优选地，上述肽片段2的合成中延伸偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联体系中还包括2,5-二氯苯并恶唑和二硫化四乙基秋兰姆。进一步地，2,5-二氯苯并恶唑和二硫化四乙基秋兰姆的摩尔比为1:0.08-0.35。更进一步地，上述固相合成肽片段2延伸偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH的反应中2,5-二氯苯并恶唑与HOBT的摩尔比为1:4-5。在合成阿巴帕肽过程中，延伸偶联大位阻氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，偶联体系中加入2,5-二氯苯并恶唑和二硫化四乙基秋兰姆，能够提高Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率，进而提高阿巴帕肽的产量和纯度。
优选地，上述肽片段2的合成中的裂解液包括TFE（三氟乙醇）和DCM（二氯甲烷），对应的体积比为1-2:7-8。
在某些实施方案中，上述步骤A中肽片段3的合成方法具体包含：
c1、Fmoc-Ser(tBu)-OH在偶联体系作用下与2-CTC树脂进行偶联反应，得到Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂；
c2、Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂进行Fmoc保护基的脱保护后，在偶联体系作用下与Fmoc-Lys(Boc)-OH进行偶联反应，得到Fmoc-Lys-Ser(tBu)-2CTC树脂；
c3、依次逐个将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH按照步骤c2的偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-2CTC树脂，加入裂解液去除2-CTC树脂，得到Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH，即肽片段3。
优选地，上述肽片段3的合成中的偶联体系为HOBT/DIC。进一步地，上述偶联体系中HOBT和DIC的摩尔比为1:1-1.5。
优选地，上述肽片段3的合成中偶联反应以DMF为溶剂。
优选地，上述肽片段3的合成中的裂解液包括TFE和DCM，对应的体积比为1-2:7-8。
在某些实施方案中，上述2-CTC树脂的取代度为0.3-1.2mmol/g。
在某些实施方案中，上述肽树脂片段1的合成、肽片段2的合成及肽片段3的合成中，延伸偶联的单个保护氨基酸与偶联体系中的HOBT的摩尔比为1:1-2。
在某些实施方案中，上述步骤B中肽树脂片段1、肽片段2、肽片段3的摩尔比为1:1-3:1-3。
在某些实施方案中，上述Fmoc保护基的脱保护所使用的脱保护剂为20v/v%哌啶的二甲基甲酰胺溶液。
本发明还提供一种阿巴帕肽的固相合成方法在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。
本发明由于在合成肽树脂Ⅰ和肽树脂Ⅱ时以体积比为2-4:1-2的DMF和乙二醇二缩水甘油醚为溶剂，因而具有如下有益效果：能够增加阿巴帕肽的肽链的溶解度，作为偶联反应溶剂时，有利于合成过程中较长的肽链的快速溶解，有利于缩合反应的进行，能够减少反应时间，提高反应效率，进而能够提高产品产率和产物纯度、降低生产成本、简化操作步骤。
本发明由于在偶联大位阻氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，偶联体系中加入2,5-二氯苯并恶唑和二硫化四乙基秋兰姆，因而具有如下有益效果：能够提高Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率，进而提高阿巴帕肽的产量和纯度。
因而，本发明是一种成本较低、操作简单、产率高、纯度高的阿巴帕肽的固相合成方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中阿巴帕肽纯品的质谱图；
图2为本发明试验例1中溶解性的测试结果；
图3为本发明试验例1中偶联率R1的测定结果；
图4为本发明试验例1中偶联率R2的测定结果；
图5为本发明试验例1中偶联率R3的测定结果；
图6为本发明试验例1中偶联率S1的测定结果；
图7为本发明试验例1中偶联率S2的测定结果；
图8为本发明试验例1中阿巴帕肽纯度的测定结果；
图9为本发明试验例1中阿巴帕肽产率的测定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1.一种阿巴帕肽的固相合成方法，具体包括：
1.1肽树脂片段1的合成：
1.1.1将15g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度0.8mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）加入固相反应柱中，用300mL DMF溶胀30min后抽干，得到活化的树脂。
1.1.2向活化的树脂中加入350mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到脱Fmoc保护基的树脂；将50mmol Fmoc-Ala-OH和75mmolHOBT加入300mL DMF中溶解，冰水浴条件下，加入90mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h，以茚三酮检测反应终点（如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Ala-RinkAmide AM树脂。
1.1.3向Fmoc-Ala-Rink Amide AM树脂中加入350mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-Rink Amide AM树脂；将50mmolFmoc-Thr(tBu)-OH和75mmol HOBT加入300mL DMF中溶解，冰水浴条件下，加入90mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h，以茚三酮检测反应终点（如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束后用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ala-Rink Amide AM树脂；重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH进行氨基酸延伸偶联，最后用350mL20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，得到H-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Rink Amide AM树脂，即肽树脂片段1。
1.2肽片段2的合成：
1.2.1将50g 2-CTC树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度0.6mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）加入固相反应柱中，用500mL DMF溶胀30min后抽干，得到活化的树脂。
1.2.2向活化的树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到脱Fmoc保护基的树脂；将110mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH和150mmol HOBT加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下N2搅拌反应2h，以茚三酮检测反应终点（如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Glu(OtBu)-2CTC树脂。
1.2.3向Fmoc-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH和150mmol HOBT加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h，以茚三酮检测反应终点（如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。
1.2.4向Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH、150mmol HOBT、30mmol 2,5-二氯苯并恶唑、6.6mmol二硫化四乙基秋兰姆加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmolDIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h。加入封闭液(吡啶(20mL)和乙酸酐(22mL))，反应2h后抽干，反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复该脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。
1.2.5重复1.2.3脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂，加入800mL裂解液（体积比为1:4的TFE和二氯甲烷），20℃反应3h，反应结束，过滤树脂，收集滤液，将滤液体积旋蒸至400mL左右，滴加至4500mL乙醚中，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到肽片段2。
1.3肽片段3的合成：
1.3.1将50g 2-CTC树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度0.6mmol/g，200目，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）加入固相反应柱中，用500mL DMF溶胀30min后抽干，得到活化的树脂。
1.3.2向活化的树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到脱Fmoc保护基的树脂；将110mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH和150mmol HOBT加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmolDIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h，以茚三酮检测反应终点（如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束后用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂。
1.3.3向Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH和150mmol HOBT加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h，以茚三酮检测反应终点（如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Lys-Ser(tBu)-2CTC树脂树脂；重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-2CTC树脂，加入800mL裂解液（体积比为1:4的TFE和二氯甲烷），20℃下反应3h，反应结束，过滤树脂，收集滤液，将滤液体积旋蒸至400mL左右，滴加至4500mL乙醚中，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到肽片段3。
1.4肽树脂Ⅰ的合成：
1.4.1将1.2制得的肽片段2、40mmol HBTU、40mmol HOBT加入450mLDMF和150mL乙二醇二缩水甘油醚的混合溶剂中溶解，在冰浴条件下加入90mL DIPEA活化8min后，加入1.1制得的肽树脂片段1固相反应柱中，25℃下反应3h，反应结束后用400mL封闭液（体积比为1:2:17的DIPEA、甲醇、DCM）封闭三次，每次3min，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Rink Amide AM树脂，即肽树脂Ⅰ。
1.5肽树脂Ⅱ的合成：
1.5.1向肽树脂Ⅰ中加入700mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Rink Amide AM树脂；
1.5.2将1.3制得的肽片段3、40mmol HBTU、40mmol HOBT加入450mLDMF和150mL乙二醇二缩水甘油醚的混合溶剂中溶解，在冰浴条件下加入90mL DIPEA活化8min后，加入1.4制得的肽树脂Ⅰ固相反应柱中，25℃下反应3h，反应结束后用400mL封闭液（体积比为1:2:17的DIPEA、甲醇、DCM）封闭三次，每次3min，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(tBu)-Ala-RinkAmide AM树脂，即肽树脂Ⅱ。
1.6向1.5制得的肽树脂Ⅱ中加入800mL裂解液（体积比为85:5:7:3的TFA，苯甲硫醚，TIS，水），25℃下反应3h，反应结束后，过滤树脂，收集滤液，将滤液体积旋蒸至450mL左右，滴加至5000mL乙醚中，离心，无水乙醚洗涤，真空干燥，得到阿巴帕肽粗品。将阿巴帕肽粗品水溶液用0.45um微孔滤膜过滤。经检测，阿巴帕肽粗品的纯度为81.2%。采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对阿巴帕肽粗品进行纯化：色谱柱： 50×250mm反相C18柱，先用流动相A为体积分数0.1v/v%三氟乙酸水溶液，流动相B为体积分数0.1%v/v三氟乙酸乙腈溶液，进行洗脱、纯化，将所要的组分收集浓缩，得到阿巴帕肽精肽；再采用流动相A为体积分数0.1%乙酸水溶液，流动相B为体积分数0.1%乙酸-乙腈溶液，进行洗脱、转盐；两步均为梯度洗脱：流速为80mL/min，洗脱时间为60min，洗脱梯度流动相B相体积百分数为10%-60%，紫外检测波长220nm，将所需要的组分收集浓缩，冻干，得阿巴帕肽纯品，纯度为99.1%，阿巴帕肽纯品的质谱图见图1，其中，h为832.12，i为1069.25，j为1425.69，k为1788.68，l为1979.89，m为3959.64，n为4149.64，o为4273.54。由图1可以看出阿巴帕肽纯品的相对分子量为3959.64，与阿巴帕肽理论相对分子量基本一致，证实确为阿巴帕肽。
实施例2：
1.2.4向Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH、150mmol HOBT、30mmol 2,5-二氯苯并恶唑、3.5mmol二硫化四乙基秋兰姆加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmolDIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h。加入封闭液(吡啶(20mL)和乙酸酐(22mL))，反应2h后抽干，反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复该脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
1.2.4向Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH、150mmol HOBT、30mmol 2,5-二氯苯并恶唑、9.9mmol二硫化四乙基秋兰姆加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmolDIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h。加入封闭液(吡啶(20mL)和乙酸酐(22mL))，反应2h后抽干，反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复该脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
1.2.4向Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH、150mmol HOBT、6.6mmol二硫化四乙基秋兰姆加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h。加入封闭液(吡啶(20mL)和乙酸酐(22mL))，反应2h后抽干，反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复该脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
1.2.4向Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH、150mmol HOBT、30mmol 2,5-二氯苯并恶唑加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h。加入封闭液(吡啶(20mL)和乙酸酐(22mL))，反应2h后抽干，反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复该脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
1.2.4向Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂中加入600mL 20v/v%哌啶的DMF溶液在25℃下振荡反应12min，抽滤后，用DMF洗涤4次，得到H-Ala-氨基树脂；将110mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH、150mmol HOBT加入150mL DCM和350mL DMF的混合溶剂中溶解，冰水浴条件下，加入170mmol DIC活化5min后，加入到固相反应柱中，25℃下反应2h。加入封闭液(吡啶(20mL)和乙酸酐(22mL))，反应2h后抽干，反应结束后，用DMF洗涤4次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂；重复该脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐个将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行氨基酸延伸偶联，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-2CTC树脂。其余部分和实施例1完全一致。
实施例7：
肽树脂Ⅰ合成和肽树脂Ⅱ合成所用反应溶剂均为480mL DMF和120mL乙二醇二缩水甘油醚。其余部分和实施例1完全一致。
实施例8：
肽树脂Ⅰ合成和肽树脂Ⅱ合成所用反应溶剂均为400mL DMF和200mL乙二醇二缩水甘油醚。其余部分和实施例1完全一致。
实施例9：
肽树脂Ⅰ合成和肽树脂Ⅱ合成所用反应溶剂均为500mL DMF和100mL乙二醇二缩水甘油醚。其余部分和实施例1完全一致。
实施例10：
肽树脂Ⅰ合成和肽树脂Ⅱ合成所用反应溶剂均为200mL DMF和400mL乙二醇二缩水甘油醚。其余部分和实施例1完全一致。
实施例11：
肽树脂Ⅰ合成和肽树脂Ⅱ合成所用反应溶剂均为600mL乙二醇二缩水甘油醚。其余部分和实施例1完全一致。
实施例12：
肽树脂Ⅰ合成和肽树脂Ⅱ合成所用反应溶剂均为600mL DMF。其余部分和实施例1完全一致。
试验例1：
1.1溶解性测试：
有机溶剂1：体积比为3:1的DMF和乙二醇二缩水甘油醚；
有机溶剂2：体积比为4:1的DMF和乙二醇二缩水甘油醚；
有机溶剂3：体积比为2:1的DMF和乙二醇二缩水甘油醚；
有机溶剂4：体积比为5:1的DMF和乙二醇二缩水甘油醚；
有机溶剂5：体积比为1:2的DMF和乙二醇二缩水甘油醚；
有机溶剂6：乙二醇二缩水甘油醚；
有机溶剂7：DMF。
分别向200mL上述有机溶剂中加入2g阿巴帕肽，25℃下搅拌溶解，分别确定阿巴帕肽在溶剂中全部溶解的时间。溶解性的测试结果见图2，其中，a为有机溶剂1，b为有机溶剂2，c为有机溶剂3，d为有机溶剂4，e为有机溶剂5，f为有机溶剂6，g为有机溶剂7。
1.2 缩合率的测定：
首先制作Fmoc浓度的标准曲线：称取Fmoc-Gly-OH 59.3mg，溶于25v/v%哌啶的DMF溶液，混匀振荡10min，过滤，合并滤液定容于10mL容量瓶内，Fmoc保护基的浓度为20mmol/L。取此溶液稀释0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、标准液，使用紫外分光光度计于300nm处测定标准液吸光度并根据数据绘制标准曲线。根据数值得到回归方程。以吸光度为y轴，浓度为x轴，建立的Fmoc标准曲线方程为y=5.57x+0.11，R2=0.996。
准确称取0.005g连接了氨基酸的树脂样品，放入离心管中，加入5ml 25v/v%哌啶的DMF溶液，搅动5min使Fmoc脱落，静置，吸取上层清液加入到比色皿中，在300nm处测定样品和空白的吸光度。按照下列公式计算：
氨基的含量（mmol/g）=（样品吸收值-空白吸收值）×制备体积/树脂样品的重量；
理论含量（mmol/g）=（树脂的替代度树脂重量×树脂重量）/{树脂重量+[（树脂的替代度×树脂重量的分子量）×（Fmoc-AA的分子量-Fmoc基团的分子量-H2O的分子量）/1000]}；
缩合率=（氨基的含量/理论含量）×100%。
按照上述公式分别计算肽片段2合成过程中第一次Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率R1，第二次Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率R2，第三次Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率R3；并计算肽树脂Ⅰ合成过程中，肽片段2的偶联率S1，肽树脂Ⅱ合成过程中，肽片段3的偶联率S2。偶联率R1的测定结果见图3，其中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6。偶联率R2的测定结果见图4，其中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6。偶联率R3的测定结果见图5，其中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6。偶联率S1的测定结果见图6，其中，A为实施例1，G为实施例7，H为实施例8，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12。偶联率S2的测定结果见图7，其中，A为实施例1，G为实施例7，H为实施例8，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12。
1.3 纯度及产率测定：采用RP-HPLC法检测上述实施例得到的阿巴帕肽粗品，计算纯度，对阿巴帕肽粗品进行纯化，转盐，根据树脂的取代度计算理论产量，计算阿巴帕肽的产率。阿巴帕肽纯度的测定结果见图8，其中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6，G为实施例7，H为实施例8，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12。阿巴帕肽产率的测定结果见图9，其中，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为实施例5，F为实施例6，G为实施例7，H为实施例8，I为实施例9，J为实施例10，K为实施例11，L为实施例12。
由图2可以看出，有机溶剂a、b、c对阿巴帕肽的溶解时间明显小于有机溶剂d、e、f、g，由图6、图7、图8、图9可以看出，实施例1、实施例7、实施例8的偶联率S1、偶联率S2、阿巴帕肽纯度和产率明显大于实施例9、实施例10、实施例11、实施例12，这说明，以体积比为2-4:1-2的DMF和乙二醇二缩水甘油醚为溶剂能够增加阿巴帕肽的肽链的溶解度，作为偶联反应溶剂时，有利于合成过程中较长的肽链的快速溶解，有利于缩合反应的进行，能够减少反应时间，提高反应效率，进而能够提高产品产率和产物纯度、降低生产成本、简化操作步骤。
由图3、图4、图5、图8、图9可以看出，实施例1、实施例2、实施例3的偶联率R1、偶联率R2、偶联率R3、阿巴帕肽纯度和产率明显大于实施例4、实施例5、实施例6，这说明，在合成阿巴帕肽过程中，延伸偶联大位阻氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，偶联体系中加入2,5-二氯苯并恶唑和二硫化四乙基秋兰姆，能够提高Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联率，进而提高阿巴帕肽的产量和纯度。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。