固液相结合制备特立帕肽的方法
阅读说明：本技术 固液相结合制备特立帕肽的方法 (Method for preparing teriparatide by solid-liquid combination ) 是由 王浩 朱明磊 周建华 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发提供了本发明公开了固液相结合制备特立帕肽的方法,本发明所述方法包括如下步骤：以2-Cl-CTC Resin为固相载体合成特立帕肽1-15个氨基酸的全保护肽作为第一片段；以PS-Wang Resin为固相载体合成特立帕肽16-34个氨基酸的全保护肽作为第二片段；在液相里将第一片段和第二片段偶联,得到特立帕肽全保护肽,经裂解、纯化、冻干得特立帕肽成品。该方法可以有效的缩短50％的合成周期、降低缺失肽、消旋肽的生成,提高了总收率、降低物料成本,适合于工业化生产。(The invention provides a method for preparing teriparatide by solid-liquid phase combination, which comprises the following steps: synthesizing a whole protective peptide of 1-15 amino acids of teriparatide as a first segment by taking 2-Cl-CTC Resin as a solid phase carrier; synthesizing a total protective peptide of 16-34 amino acids of teriparatide as a second segment by taking PS-Wang Resin as a solid phase carrier; and coupling the first fragment and the second fragment in a liquid phase to obtain teriparatide full-protection peptide, and cracking, purifying and freeze-drying to obtain a teriparatide finished product. The method can effectively shorten the synthesis period by 50 percent, reduce the generation of deletion peptide and racemic peptide, improve the total yield, reduce the material cost and is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及多肽药物固相合成领域，特别涉及一种固液相结合制备特立帕肽的方法。
背景技术
中文名称：特立帕肽
英文名称：Teriparatide：
肽序结构：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH
结构式：
Cas号：52232-67-4
分子量：4117.77
分子式：C181H291N55O51S2
特立帕肽是内源性甲状旁腺激素具有生物活性的N-末端区域1-34氨基酸片段，由礼来公司研发，2002年12月首次在美国上市，用于原发性骨质疏松及性腺功能减退性骨质疏松、绝经后骨质疏松的治疗，特立帕肽的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素PTH以及完全相同，能够增加成骨细胞数目，增强其活性及阻止成骨细胞凋亡，并且，毒副作用小，且很少引发蓄积中毒，具有很广阔的市场前景。
目前，关于特立帕肽的制备方法，国内外已广为报道。原研厂家礼来采用基因表达的方式获得特立帕肽，除此之外，尚有多种基因表达方面的专利，例如CZ20100374A3中描述了一种用基因重组技术在大肠杆菌中表达，然后通过分离纯化技术得到成品的方法。US2017129935A1中介绍一种基于离子交换层析纯化特立帕的方法，该方法也是基于基因工程技术生产的特立帕肽。然而，基因表达法有着技术门槛高，工序复杂，三废严重等明显的缺陷。
另一种较为常见的特立帕肽制备方法是固相化学合成法，CN104017064A中描述了一种在肽链的16～17位采用假脯氨酸二肽的方式投料的方法，避免了特殊工艺杂质的产生，但无法避免因肽链过长所产生的多种缺失肽；CN104530218A中描述了一种采取传统的固相合成方法，由肽链C端向N端逐步合成特立帕肽的方法，虽然操作简便，但无法解决长肽后期偶联困难的问题，且最终目标肽纯度不高，纯化困难；CN105384809A中描述了一种，先通过液相合成二肽或是三肽，然后在固相合成的方法，该方法虽然一定程度上降低了缺失肽的产生，但增加了大量的液相二肽合成工作，工序繁琐；CN104910269中描述了一种使用HMP Linker作为固相载体，逐个偶联完成肽序合成的方法，该方法不能有效避免因逐个偶联而产生的缺失、消旋肽。
发明内容
为解决特立帕肽合成中存在的以上缺陷，本发明提供了片段法固液结合制备特立帕肽的新方法。
根据本发明技术方案的一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，该方法如下：
(1)固相合成特立帕肽1-15个氨基酸的全保护肽作为第一片段；
(2)以PS-Wang Resin为固相载体合成特立帕肽16-34个氨基酸的全保护作为第二片段；
(3)第一片段与第二片段在液相里偶联，合成特立帕肽全保护肽；
(4)经裂解、纯化、冻干得特立帕肽成品。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(1)中所使用的树脂为2-Cl-CTC Resin，取代度为0.1～1.2mmol/g。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(1)与/或步骤(2)中所使用的缩合剂为A+B或A+C+D，其中A为HoBt、HoAt、Cl-HOBt或HOOBt中的任一种，B为DIC、DCC、EDC.HCl中的任一种，C为HATU、HBTU、HCTU、TATU、TBTU、PyBOP或PyAOP中的任一种，D为DIEA、NMM、TMP或TEA中的任一种；使用A+B缩合体系时，树脂、氨基酸、A、B的摩尔质量比为1∶1.5～3∶1.8～3.6∶1.8～3.6，使用A+C+D时，树脂、氨基酸、A、C、D的摩尔质量比为1∶1.5～3∶1.8～3.6∶1.35～2.7∶4.5～9；所使用的反应溶剂为DMF、DCM、DMSO、DMA、NMP中的一种或几种组合；所使用脱Fmoc的试剂为10％～30％V/V的哌啶/DMF溶液或1％～5％V/V的DBU/DMF溶液，脱除两次，每次5min～20min。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(1)中全保护片段的裂解试剂为15％～30％V/V TFE/DCM或0.5％～3％V/V TFA/DCM。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(1)中使用Fmoc-Val-Ser[Psi(Me，Me)Pro]-OH代替Fmoc-Val2-OH、Fmoc-Ser3(tBu)-OH来合成第一片段全保护。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述Fmoc-Val-Ser[Psi(Me，Me)Pro]-OH偶联时采用的缩合体系为A+C+D中的任意一种。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种特立帕肽合成方法，上述步骤(2)中使用是固相载体PS-Wang Resin结构为：
PS-Wang Resin
根据本发明技术方案的其中一方面提供了固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(2)中R1、R2、R3、R4可以是含有1-3个碳的烷基、含有1-3个碳的烷氧基、氢、氯等卤素原子中的一种或是几种，可以相同或是不同；R1、R2、R3、R4优先选择CH3、H、Cl中的一种或是几种；R1、R2、R3、R4更优先的选择H。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(2)中n可以为0、1、2、3、4；n优先选择0、1、2；更优先的选择0。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(2)中全保护片段的裂解试剂为1％～4％V/V TFA/DCM，优选的裂解试剂比例为3％V/VTFA/DCM。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(3)中，第一片段、第二片段在液相里偶联的缩合剂为PyBop、PyAop、HCTU、HBTU、TBTU、TCTU中的一种或是几种；使用的溶剂为DMF、DMA、NMP、DCM中第一种或是几种；使用的碱为DIEA、NMM、TMP或TEA中的任一种。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(4)中使用的切割试剂TFA/TIS/间甲酚，使用分别为，TFA：80～95；TIS：3～10；问甲酚：2-10。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，上述步骤(4)使用的切割试剂更优选的比例为TFA/TIS/间甲酚＝90/5/5。
根据本发明技术方案的其中一方面提供了一种固液相结合制备特立帕肽的方法，其中本发明特立帕肽的合成方法中，其进一步优选的技术方案，其步骤具体如下：
(1)Fmoc-Leu-CTC Resin的制备：
取2-Cl-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Leu-OH的DMF溶液、DIEA搅拌反应，抽干溶剂，加入DIEA/甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Leu-CTC Resin；
(2)第一片段的制备：
取Fmoc-Leu-CTC Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-His(trt)-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-Ser[Psi(Me，Me)Pro]-OH、BOC-Ser(tBu)-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥，得特立帕肽第一片段肽树脂，将肽树脂加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得特立帕肽第一片段；
(3)Fmoc-Phe-PS-Wang Resin制备：
取2-Cl-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入对羟基苯甲醇的DMF溶液，搅拌均匀后，加入DIEA，30℃反应2h，再在反应液中加入MeOH来封闭未完全反应掉的Cl，完成后用DMF洗涤树脂。加入Fmoc-Phe-OH的DMF溶液、DIEA搅拌反应，抽干溶剂，加入DIEA/甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Phe-PS-Wang Resin；
(4)第二片段的制备：
取Fmoc-Phe-PS-Wang Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Asn(trt)-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥，得特立帕肽第二片段肽树脂，将肽树脂加入到3％的TFA/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得特立帕肽第二片段；
(5)特立帕肽全保护肽制备：
将第一片段、第二片段、PyBoP溶解在DMF/DCM的混合溶液中，使用DIEA调节pH至8左右反应3h，完成后旋蒸至油状，乙酸乙酯溶解，加入5％NaHCO3、5％柠檬酸水溶液交替洗涤有机相，纯水洗涤有机相，旋蒸干燥得特立帕肽全保护肽。
(6)特立帕肽制备
配制裂解液TFA/TIS/间甲酚＝90/5/5，加入肽树脂反应，完成后抽滤，取滤液，将滤液加入到异丙醚中沉降，离心干燥得特立帕肽粗品，经纯化制备，得成品特立帕肽。
附图说明
图1：实施例5中特立帕肽成品HPLC图谱。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明所使用缩写的含义列于下表：
实施例1：
特立帕肽第一片段全保护肽的制备，Scheme 1：
1)树脂溶胀：称取60g替代度为1.0mmol/g的2-Cl-CTC Resin，加入600ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入300ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Leu-CTC Resin的制备：按照树脂、Fmoc-Leu-OH、DIEA摩尔质量比为1∶2∶6，称取42.4g Fmoc-Leu-OH溶解于300ml DMF中，加入63ml DIEA，混合均匀后，将溶液加入反应柱反应2h，抽干溶剂；加入300ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照DCM、甲醇、DIEA体积比为17∶2∶1，配制800ml封闭液，封闭树脂两次，每次10min；加入400ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Leu-CTC Resin 80.6g，测得取代度0.65mmol/g。
3)特立帕肽第一片段肽树脂制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取76.9g Fmoc-Leu-CTCResin，加入700ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入500ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入500ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为5min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入500ml DMF洗涤树脂，抽干溶解，重复5次，茚检阳性；c)按照树脂、Fmoc-His(trt)-OH、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶2∶2.4∶2.4，称取62.0g Fmoc-His(trt)-OH、16.2g HOB溶解于500ml DMF中，加入19ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，500ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-Ser[Psi(Me，Me)Pro]-OH、BOC-Ser(tBu)-OH进行偶联反应得特立帕肽第一片段肽树脂206.3g。
4)特立帕肽第一片段全保护肽的制备：配制20％TFE/DCM溶液1 600ml，加入特立帕肽第一片段肽树脂，反应2h，收集滤液，滤液进行真空旋干；得特立帕肽第一片段149.9g。
实施例2：
Fmoc-Phe-PS-Wang Resin制备，Scheme 2：
1)树脂溶胀：称取120g替代度为1.0mmol/g的2-Cl-CTC Resin，加入1 200ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入900ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Phe-PS-Wang Resin的制备：1)按照树脂、对羟基苯甲醇、DIEA摩尔质量比为1∶3∶12，称取44.7g对羟基苯甲醇溶解于900ml DMF中，加入251ml DIEA，混合均匀后，将溶液加入反应柱反应3h，加入100ml MeOH到反应液中来封闭未完全反应的Cl，反应20min，抽干溶剂；加入900ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；2)按照树脂、Fmoc-Phe-OH、HoBt、DIC、DMAP摩尔质量比为1∶2∶2.4∶2.4∶0.2，称取93.0g Fmoc-Ala-OH、38.9g HoBt溶解于900ml DMF中，加入44.6ml DIC活化5min，将活化液加入树脂30℃反应10min，称取2.9gDMAP溶解于100ml DMF中，缓慢滴加入反应柱中30℃继续反应1.5h，抽干溶剂；加入900mlDMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照树脂、醋酐、吡啶摩尔比为1∶20∶5，加入封闭液，反应5h；加入900ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Phe-PS-Wang Resin 148.2g，测得取代度0.38mmol/g。
实施例3
特立帕肽第二片段全保护肽的制备：
1)特立帕肽第二片段肽树脂制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取132.0g Fmoc-Phe-PS-Wang Resin，加入1 500ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入1 000ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入1 000ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为5min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入1 000ml DMF洗涤树脂，抽干溶解，重复5次，茚检阳性；c)按照树脂、Fmoc-Asn(trt)-OH、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶2∶2.4∶2.4，称取59.7g Fmoc-Asn(trt)-OH、16.2g HOB溶解于1 000ml DMF中，加入19ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，1000ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH进行偶联反应得特立帕肽第一片段肽树脂321.5g。
4)特立帕肽第二片段全保护肽的制备：配制20％TFE/DCM溶液2 500ml，加入特立帕肽第一片段肽树脂，反应2h，收集滤液，滤液进行真空旋干；得特立帕肽第二片段208.4g。
实施例4
特立帕肽全保护肽制备：
按将第一片段、第二片段、PyBoP摩尔质量比为1∶1∶1.01，称取149.9g第一片段、208.4第二片段、26.2g PyBoP溶解在5000ml 10％DMF/DCM的混合溶液中，使用DIEA调节pH至8左右，40℃反应3h，完成后旋蒸至油状，加入3000ml乙酸乙酯溶解，使用1500ml 5％NaHCO3、5％柠檬酸水溶液交替洗涤有机相五次，1500ml纯水洗涤有机相五次，有机相旋蒸干燥得特立帕肽全保护肽446.2g。
实施例5
特立帕肽制备：
按照裂解液TFA/TIS/间甲酚＝90/5/5，配制3 000ml裂解液，搅拌均匀后缓慢加入特立帕肽全保护肽，溶解后，30℃反应3h，完成后反应液加入到28 000ml异丙醚中沉降，离心干燥得特立帕肽粗品，经C18制备柱纯化，流动相0.1％TFA水溶液，流速50～100ml/min，检测波长230nm，用HPLC跟踪收集所需要的流出液，然后采用常规的方法冻干，获得特立帕肽精肽质量为82.5g，纯度为99.59％，最大单杂0.22％，总杂0.41％，总收率为40.0％；ESI-MS：[M+4H]4+＝1030.5，[M+3H]3+＝1373.9，HPLC结果如图1所示。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。