一种阿巴帕肽的纯化方法
阅读说明：本技术 一种阿巴帕肽的纯化方法 (Purification method of abamectin ) 是由 于达 肖英 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种阿巴帕肽的纯化方法,属多肽药物纯化技术领域。其步骤是先取阿巴帕肽粗肽进行预处理使其溶于乙腈水溶液中,获得粗肽溶液。然后取所述粗肽溶液,以A1、A2溶液与B溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱,收集洗脱组分,得第一次纯化物；再取所述第一次纯化物,以A3与B溶液的混合溶液进行转盐等度洗脱,收集洗脱组分,得最终纯化物；最后取最终纯化物经减压旋蒸浓缩、冷冻干燥,得到阿巴帕肽成品；本发明纯化方法制备获得的阿巴帕肽制备方法步骤简单、原料消耗低,并且产品产率高、纯度高,适合规模化工业生产。(The invention discloses a purification method of abamectin, belonging to the technical field of polypeptide drug purification. The method comprises the steps of pretreating the abapa peptide crude peptide to dissolve the abapa peptide crude peptide into acetonitrile aqueous solution to obtain a crude peptide solution. Then taking the crude peptide solution, carrying out isocratic and gradient elution on a mixed solution of the A1 solution, the A2 solution and the B solution, and collecting elution components to obtain a first purified substance; taking the first purified product, carrying out salt conversion isocratic elution on the mixed solution of the A3 and the B solution, and collecting the eluted components to obtain the final purified product; finally, the final purified product is subjected to reduced pressure rotary steaming concentration and freeze drying to obtain an abapatatin finished product; the preparation method of the abapatatin prepared by the purification method has the advantages of simple steps, low raw material consumption, high product yield and high purity, and is suitable for large-scale industrial production.)
技术领域
本发明涉及多肽药物纯化技术领域，特别涉及一种阿巴帕肽的纯化方法。
背景技术
阿巴帕肽，英文名称为Abaloparatide。
阿巴帕肽是由34个氨基酸残基组成的多肽，分子式为C174H300N56O49，分子量为3960.64g/mol，CAS号为247062-33-5，其结构如下：
Ala1-Val2-Ser3-Glu4-His5-Gln6-Leu7-Leu8-His9-Asp10-Lys11-Gly12-Lys13Ser14-Ile15-Gln16-Asp17-Leu18-Arg19-Arg20-Arg21-Glu22-Leu23-Leu24-Glu25Lys26-Leu27-Leu28-Aib29-Lys30-Leu31-His32-Thr33-Ala34-NH2。
甲状旁腺激素(PTH)是一种由甲状旁腺主细胞分泌的，调节体内钙和磷代谢的多肽类激素，其C端肽链与PTH-II受体结合可促进骨细胞凋亡、N端肽链与PTH-I受体结合可促进骨骼重建。
阿巴帕肽(Abaloparatide)，是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，它是PTH-I受体强有力的选择性激活剂，可以增加骨矿物质含量、骨密度以及骨强度，促进骨骼形成，已于2017年4月28日被FDA批准上市，其商品名称为Tymlos。
阿巴帕肽经皮下注射，用于治疗处于骨折风险或对其它治疗药物无效的绝经后妇女的骨质疏松症，可有效降低新发椎体和非椎体骨折率。
固相合成阿巴帕肽会产生大量的杂质，现有的纯化方法收率低且复杂难操作。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术水平的不足，提供了一种新的阿巴帕肽的纯化方法，能有效除去合成产生的各种杂质，得到高纯度的阿巴帕肽。
本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种阿巴帕肽的纯化方法，其具体技术方案包括：
步骤一：取阿巴帕肽粗肽进行预处理使其溶于乙腈水溶液中，获得粗肽溶液。
步骤二：取所述粗肽溶液，以A1、A2溶液与B溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱，收集洗脱组分，得第一次纯化物；
步骤三：取所述第一次纯化物，以A3与B溶液的混合溶液进行脱盐等度洗脱，收集洗脱组分，得最终纯化物；
步骤四：取最终纯化物经减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到阿巴帕肽成品；
所述A1溶液为10％醋酸水溶液；
所述A2溶液为0.1％的TFA的水溶液；
所述A3溶液为纯水；
所述B溶液为100％乙腈。
优选的前述阿巴帕肽的纯化方法，步骤一阿巴帕肽的预处理步骤包括：
将阿巴帕肽溶于乙腈水溶液中得到阿巴帕肽粗肽水溶液；
用滤膜除去阿巴帕肽粗肽水溶液中的不溶性颗粒，收集滤液。
优选的前述阿巴帕肽的纯化方法，步骤二具体步骤包括：
以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以10％的醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，先进行等度洗脱，然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有阿巴帕肽的馏分。
优选的前述阿巴帕肽的纯化方法，步骤三具体步骤包括：
以四烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以纯水为流动相A3，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行等度洗脱，其中纯水与所述乙腈溶液的体积分数比为40％:60％，等度洗脱时间为30min-40min；
优选的前述的阿巴帕肽的纯化方法，步骤四具体步骤包括：
旋转蒸发仪水浴温度为30℃，真空度为-0.008MP，除去乙腈后在真空冷冻干燥机中完成冻干。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种纯化阿巴帕肽的方法，该方法将阿巴帕肽粗肽溶于乙腈水中，经过滤得粗肽溶液，通过一步纯化、一步脱盐获得阿巴帕肽。收率为70％左右，纯度99.0％以上，单杂0.15％以下。本发明能有效解决阿巴帕肽成品纯度不高，收率低的问题。
具体实施方式
本发明公开了一种阿巴帕肽的纯化方法。本领域技术人员可以参考本文内容，实施该方法，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的纯化方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1，一种阿巴帕肽的纯化方法，其具体技术方案包括：
步骤一：取阿巴帕肽粗肽进行预处理使其溶于乙腈水溶液中，获得粗肽溶液；具体步骤包括：
将阿巴帕肽溶于乙腈水溶液中充分搅拌至完全溶解，得到阿巴帕肽粗肽水溶液；
用滤膜除去阿巴帕肽粗肽水溶液中的不溶性颗粒，收集滤液。
步骤二：取所述粗肽溶液，以A1、A2溶液与B溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱，收集洗脱组分，得第一次纯化物；具体步骤包括：
以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以10％的醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，先进行等度洗脱，然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有阿巴帕肽的馏分。
步骤三：取所述第一次纯化物，以A3与B溶液的混合溶液进行转盐梯度洗脱，收集洗脱组分,得最终纯化物；具体步骤包括：
以四烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以纯水流动相A3，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行等度洗脱，其中纯水与乙腈的体积分数比为40％:60％，等度洗脱时间为30min-40min，完成脱盐处理。
步骤四：取最终纯化物经减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，得到阿巴帕肽成品。具体步骤包括：
旋转蒸发仪水浴温度为30℃，真空度为-0.008MP以下，除去乙腈后在真空冷冻干燥机中完成冻干。
实施例2，阿巴帕肽粗肽纯化实验1：
固相合成阿巴帕肽，粗肽纯度为69％。
样品处理：将3.0g固体粗肽溶于乙腈水中，搅拌使样品完全溶解后用0.45u滤膜过滤，收集滤液备用。
第一步纯化:
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30mm×250mm。以10％的醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，先进行等度洗脱，然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，单针最大上样量0.8g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收取纯度大于99.0％且单杂小于0.15％的阿巴帕肽样品馏分。
第二步脱盐：
以四烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相柱子，直径和长度为：50mm×260mm。以纯水为流动相A3，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行等度洗脱，完成脱盐处理。其中纯水与乙腈体积分数比为40％:60％，等度洗脱时间为30min，单针最大上样量2.0g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收集所有脱盐后的样品。将收集的目的峰馏分于水温30℃的条件下减压(-0.008MP以下)旋蒸浓缩后进行冷冻干燥，得到纯度为99.1％的阿巴帕肽，纯化收率为66.7％。
实施例3：阿巴帕肽粗肽纯化实验2
固相合成阿巴帕肽，粗肽纯度为69％。
样品处理：将14.0g固体粗肽溶于乙腈水中，搅拌使样品完全溶解后用0.45u滤膜过滤，收集滤液备用。
第一步纯化:
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×270mm。以10％的醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，先进行等度洗脱，然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，单针最大上样量2.2g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收取纯度大于99.0％且单杂小于0.15％的阿巴帕肽样品馏分。
第二步脱盐：
以四烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相柱子，直径和长度为：50mm×260mm，以纯水为流动相A3，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行等度洗脱，其中纯水与乙腈的体积分数比为40％:60％，等度洗脱时间为30min，单针最大上样量4.0g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收集所有脱盐后的样品。将收集的目的峰馏分于水温30℃的条件下减压(-0.008MP以下)旋蒸浓缩后进行冷冻干燥，得到纯度为99.0％的阿巴帕肽，纯化收率为70.3％。
实施例4，阿巴帕肽粗肽纯化实验3：
固相合成阿巴帕肽，粗肽纯度为71％。
样品处理：将15.0g固体粗肽溶于乙腈水中，搅拌使样品完全溶解后用0.45u滤膜过滤，收集滤液备用。
第一步纯化:
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×270mm。以10％的醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，先进行等度洗脱，然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，单针最大上样量2.2g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收取纯度大于99.0％且单杂小于0.15％的阿巴帕肽样品馏分。
第二步脱盐：
以四烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相柱子，直径和长度为：50mm×260mm，以纯水为流动相A3，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行等度洗脱，完成脱盐处理。其中纯水与乙腈的体积分数比为40％:60％，等度洗脱时间为30min，单针最大上样量4.0g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收集所有脱盐后的样品。将收集的目的峰馏分于水温30℃的条件下减压(-0.008MP以下)旋蒸浓缩后进行冷冻干燥，得到纯度为99.1％的阿巴帕肽，纯化收率为73.0％。
实施例5：阿巴帕肽粗肽纯化实验4
固相合成阿巴帕肽，粗肽纯度为71％。
样品处理：将35.0g固体粗肽溶于乙腈水中，搅拌使样品完全溶解后用0.45u滤膜过滤，收集滤液备用。
第一步纯化:
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：100mm×260mm。以10％的醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，先进行等度洗脱，然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，单针最大上样量8.8g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收取纯度大于99.0％且单杂小于0.15％的阿巴帕肽样品馏分。
第二步脱盐：
以四烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相柱子，直径和长度为：50mm×260mm，以纯水为流动相A3，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行等度洗脱，完成脱盐处理。其中纯水与乙腈的体积分数比为40％:60％，等度洗脱时间为30min，单针最大上样量4.0g。
具体洗脱梯度如下表所示：
收集所有脱盐后的样品。将收集的目的峰馏分于水温30℃的条件下减压(-0.008MP以下)旋蒸浓缩后进行冷冻干燥，得到纯度为99.0％的阿巴帕肽，纯化收率为73.8％
由4个实验可知，通过本方法纯化阿巴帕肽，都能得到接近70％的收率，且得到的阿巴帕肽纯度大于99.0％，在生产中具有很高的实际意义。
以上仅是本发明的主要特征和优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。