一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法
阅读说明：本技术 一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法 (Method for recovering phycocyanin in process of extracting glycerol glucoside ) 是由 吕雪峰 李新 段仰凯 张凯 吴怀之 刘祥 于 2019-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物提取技术领域,特别涉及一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法,取微藻藻泥,经过加水回收、膜过滤等步骤,在提取甘油葡萄糖苷的过程中回收和纯化藻蓝蛋白。本发明能在不影响甘油葡萄糖苷的提取效率下,充分对藻蓝蛋白进行回收,最终获得食品级的藻蓝蛋白产品,应用范围更广。(The invention belongs to the technical field of biological extraction, and particularly relates to a method for recovering phycocyanin in a process of extracting glycerol glucoside. The method can fully recover the phycocyanin without influencing the extraction efficiency of the glycerol glucoside, finally obtains food-grade phycocyanin products, and has wider application range.)
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体地说涉及一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法。
背景技术
甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol，简称GG)是微藻在遇到高盐环境中用以抵抗外界高渗透压对细胞的损害而产生的相容性物质，是一类由甘油与葡萄糖分子以糖苷键结合的物质，具有保湿、抗氧化功能，可应用于食品、农药、医药，能源等多种领域。
而藻蓝蛋白是在微藻中分离出的一种深蓝色组分，是一种极好的天然食用色素，具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效，因此可应用于食品，化妆品，农业等方面。
目前有关于甘油葡萄糖苷的提取工艺已经成熟，但在提取过程中造成了藻蓝蛋白的流失，因此不能充分的利用微藻的应用价值，经济效益不能最大化。
发明内容
针对现有技术的不足，发明人在长期实践中研究设计出一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法，在不影响的甘油葡萄糖苷的提取效率情况下，将其中的藻蓝蛋白的进行回收，回收效率得到大幅度提升，回收后藻蓝蛋白的纯度可达到食品级标准。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：
获得盐胁迫的藻泥；以及包括：
工序一获得低渗萃取液：将藻泥与低渗溶液混合萃取，获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体；
工序二：将工序一所得低渗萃取液经过精细过滤去除杂质，再进行超滤得到含有藻蓝蛋白的萃取液和含有GG的透过液；
工序三：将工序一所得藻泥固体，与浓度为1g/l～10g/lCaCl2溶液混合，藻泥固体与CaCl2溶液按体积比1:10～100的比例混合，置于4℃～40℃环境下进行溶胀破壁，并遮光处理，溶胀时间为6～72小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液；
工序四：将工序三所得混合液在4℃～40℃环境下，通过离心机或过滤装置进行固液分离，得到藻蓝蛋白粗提液；
工序五：将工序四所得藻蓝蛋白粗提液和/或工序二所得含有藻蓝蛋白的萃取液，经过精细过滤去除杂质，再进行超滤得到藻蓝蛋白浓缩液；
工序六干燥：在工序五所得的藻蓝蛋白浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，经过干燥处理，得到藻蓝蛋白干粉；
其中，根据获得产物的不同，所述方法依次按照工序一、工序二；或者，依次按照工序一、工序三、工序四；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序三、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序三、工序四、工序五、工序六；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四、工序五、工序六进行操作。
进一步地，工序一中，所述低渗萃取液是通过以下方法制备得到：将藻泥与低渗溶液按体积比1:1比例混合，萃取1～8次，滤出微藻即可获得低渗萃取液。
进一步地，工序一中，所述低渗溶液为比微藻藻细胞内渗透压低的溶液，包括洁净无盐水溶液、无菌去离子水、降低细胞渗透压的钾盐或镁盐水溶液。
进一步地，工序二和工序五中所述精细过滤具体为，将工序二所得低渗萃取液或工序五所得粗提液采用孔径为0.1μm～5μm滤膜进行过滤，去除杂质及大分子物质，得到含有藻蓝蛋白的透过液。
进一步地，所述精细过滤采用的过滤装置包括至少两级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，首级滤膜孔径为0.1μm～5μm，末级的滤膜孔径为1500D～0.1μm。
进一步地，工序二和工序五中所述超滤具体为，采用孔径为1500D～0.1μm的滤膜进行浓缩和脱盐处理，藻蓝蛋白留在料液桶内。
进一步地，在温度为4℃～40℃、压力为50Kpa～2Mpa的环境下进行超滤。
进一步地，工序四中，所述离心机为管式离心机、碟片离心机或三足离心机；所述过滤装置为板框过滤机，板框过滤机的滤布大小为600～2000目。
进一步地，工序六中，所述海藻糖和柠檬酸钠的添加量按照质量比藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％～90％：10％～40％：10％～40％的比例添加，且三者比例总和为1。
进一步地，所述工序六中通过真空冷冻干燥、喷雾干燥或烘干干燥进行干燥处理。
进一步地，所述真空冷冻干燥分为预冷冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液通过三个阶段后得到藻蓝蛋白干粉。
进一步地，所述喷雾干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液，以进风温度110℃～130℃、出风温度70℃～90℃的条件进行喷雾干燥，获取藻蓝蛋白干粉。
进一步地，所述烘干干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后藻蓝蛋白浓缩液放入烘干干燥机中，在温度50℃的条件下进行干燥，得到藻蓝蛋白干粉。
本发明的有益效果是：
(1)通过将含有GG与藻蓝蛋白的溶液进行膜过滤，并且通过溶胀破壁获得提取GG后的藻渣中剩余的藻蓝蛋白，在不影响GG的提取前提下，充分的将藻蓝蛋白进行回收，最终藻蓝蛋白的回收率可以达到85％，纯度满足食品级藻蓝蛋白标准。
(2)通过CaCl2溶胀法，对提取完GG的藻渣进行溶胀破壁，使得微藻细胞壁得以迅速涨破，充分对藻渣中的有效成分进行再利用，避免了资源浪费，有利于工业化大量回收藻蓝蛋白，增加微藻的营养价值和药用价值。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合较佳的实施例对本发明作进一步说明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
术语解释：
微藻：一般是指那些在显微镜下才能辨别形态微小的藻类。
正如背景技术所介绍的，现有技术在提取甘油葡萄糖苷过程中造成了藻蓝蛋白的流失，不能充分的利用微藻的应用价值，经济效益不能最大化。本发明提供一种在提取甘油葡萄糖苷过程中回收藻蓝蛋白的方法，在不影响甘油葡萄糖苷的提取效率下，充分对藻蓝蛋白进行回收，最终生产出食品级的藻蓝蛋白产品进行出售。
该方法包括以下步骤：
获得盐胁迫藻泥；以及包括：
工序一获得低渗萃取液：将藻泥与低渗溶液混合萃取，获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液混合物和藻泥固体。
工序二：将工序一所得的低渗萃取液经过精细过滤去除低渗萃取液中大分子物质及胶体等杂质，再进行超滤将藻蓝蛋白留在料液桶内、GG随透过液流出，得到含有藻蓝蛋白的萃取液和含有GG的透过液，再将透过液进行GG提取。
工序三：将工序一获得藻泥固体，与浓度为1g/l～10g/lCaCl2溶液混合，藻泥固体与CaCl2溶液按体积比1:10～100的比例混合，置于4℃～40℃环境下，溶胀时间为6～72小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液。
此工序是对藻泥中剩余的藻蓝蛋白进行回收，由于加低渗溶液只能提出一小部分的藻蓝蛋白，藻泥中还有大量的藻蓝蛋白还未破壁溶出，因此利用CaCl2溶胀法将残留的藻蓝蛋白进行回收。
工序四：将工序三得的混合液在4℃～40℃环境下，通过离心机或过滤装置进行固液分离，得到藻蓝蛋白粗提液和藻渣混合物。
工序五：将工序四得到的藻蓝蛋白粗提液和/或工序二得到的含有藻蓝蛋白的萃取液混合，重复工序二步骤，得到藻蓝蛋白浓缩液。
工序六干燥：在工序五所得的浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，经过干燥处理，获得食品级藻蓝蛋白。
其中，根据获得产物的不同，所述方法依次按照工序一、工序二；或者，依次按照工序一、工序三、工序四；或者，依次按照工序一、工序二、工序六；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四、工序六；或者，依次按照工序一、工序三、工序四、工序五；或者，依次按照工序一、工序三、工序四、工序六；或者，依次按照工序一、工序三、工序四、工序五、工序六；或者，依次按照工序一、工序二、工序三、工序四、工序五、工序六等进行操作。
进一步的，工序一中低渗萃取液是通过以下方法制备得到：将采收的富含GG的微藻与低渗溶液按体积比1:1比例混合，萃取1～8次，滤出微藻即可获得低渗萃取液，且获取的萃取液中GG浓度随着萃取次数的减少而降低。
更进一步的，所述工序一中低渗萃取液是通过以下方法制备得到：将采收的富含GG的微藻藻泥，进行脱水，然后将藻泥与低渗溶液按体积比1:1比例混合，进行萃取，经过藻水分离获得藻泥固体和GG水溶液，如此萃取1～8次，收集每次萃取后的萃取液或合并多次萃取后的萃取液即为低渗萃取液。
在本发明一个具体实施方式中，工序一中，低渗萃取液为富集GG的微藻通过低渗溶液萃取得到的萃取液，该萃取液包含藻蓝蛋白、盐类物质、(少量的)糖类物质和GG。
在本发明一个具体实施方式中，工序一中，低渗溶液为比藻细胞内渗透压低的溶液，包括洁净无盐水溶液、低盐水溶液、降低细胞渗透压的钾盐或镁盐水溶液。上述盐水溶液的浓度可根据需要进行配制，本发明不做限定。
优选的，低渗溶液为洁净的无盐水溶液；进一步优选为无菌去离子水。
如果采用高渗透压的盐溶液、高浓度乙醇溶液作为萃取液，由于这些萃取液具有很好的穿过细胞壁或溶解细胞膜的能力，萃取时将会破坏微藻细胞内部组织结构，导致微藻细胞死亡。
进一步的，工序二中的精细过滤具体为，将得到的低渗萃取液采用膜过滤方法去除杂质，选用的膜孔径为0.1μm～5μm，去除粗提液中大分子物质及胶体等杂质，藻蓝蛋白和GG随透过液流出。
进一步的，工序二中，精细过滤采用的过滤装置包括至少两级不同孔径的滤膜，所述孔径逐级递减，首级滤膜孔径为0.1μm～5μm，末级的滤膜孔径为1500D～0.1μm。
膜元件为该套系统的关键组件，该设备通过膜元件上分布有一定孔径的滤膜来截留相应分子量的物质，起到分离纯化目标物质的作用，该步骤的目的是去除料液之中的胶体等物质，以防止影响后续实验的过滤效率。
进一步的，工序二中，超滤具体为将精细过滤后所得的透过液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为1500D～0.1μm，保证盐离子和GG透过滤膜，料液桶内藻蓝蛋白的浓缩液。
进一步的，工序二中，超滤过程中，料液桶内过高的温度和压力会影响藻蓝蛋白变性，纯度下降。为保证藻蓝蛋白不变性，需将料液桶内温度保持低温低压状态。
本发明的一个实施方式中，在料液桶夹套中持续注入冷凝水，利用冷暖水机使桶内温度保持低温恒定状态(即4℃～40℃)。另外，将压力设定为50Kpa～2Mpa，来充分保证藻蓝蛋白活性。
进一步的，工序二中，将含有GG和小分子物质的透过液进行GG提取，提取方为，将得到的透过液采用纳滤装置进行浓缩去除小分子物质，再将得到的GG浓缩液进行脱水得到纯化后的甘油葡萄糖苷。
所述纳滤装置采用膜过滤设备，膜的孔径为100-250Da，在该范围的孔径下，可以使透过液中的小分子通过，但GG无法通过，该过程中，GG提取率可大于90％，GG的损失率小于10％。
需要说明的是，本发明中不能采用离子交换树脂进行脱盐处理，因为这种脱盐方式会损失掉大于5％的GG，这样会使最终得到的GG的纯度小于90％，无法得到高纯度的GG。
作为一种可选的实施方式，所述脱盐装置为GG吸附树脂柱，包括但不限于苯乙烯型大孔吸附树脂等，如D101树脂、XAD-1树脂等。该树脂对GG具有专一性吸附，不吸附盐、甘油等物质。GG吸附饱和后先使用数倍柱体积的纯水将柱子中参与的杂质洗脱，再用数倍10～60(v/v)％的乙醇将GG洗脱。
所述脱水装置对脱盐后和浓缩的萃取液进一步去除多余水分，最终得到纯度大于90％的GG纯品。
优选的，所述脱水装置包括真空反应釜和旋转蒸发器等。
进一步的，所述工序三中，将藻泥固体与CaCl2溶液的混合液在遮光环境下进行溶胀破壁。
常温下藻蓝蛋白纯度随时间逐渐下降，且处于光照环境下的藻蓝蛋白溶液纯度下降较快。表明光照对藻蓝蛋白的稳定性有影响，因此需要避光保存。
进一步的，所述工序四中，采用管式离心机、碟片离心机或三足离心机进行高速离心使固液分离，或者采用板框过滤机进行膜过滤使固液分离。其中板框过滤机的滤布大小为600～2000目。
进一步的，所述工序六中需要向藻蓝蛋白的浓缩液中添加海藻糖和柠檬酸钠来保证藻蓝蛋白不被氧化，添加比例按照质量比藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％～80％：10％～40％：10％～40％的比例添加，并保证三者比例总和为1，再经过干燥处理，最终得到满足食品级标准的藻蓝蛋白。
进一步的，所述工序六通过真空冷冻干燥、喷雾干燥或烘干干燥进行干燥处理。干燥方式不受限制，进一步优选的为真空干燥。
真空冷冻干燥简称冻干，是将含水物质先冻结成固态，然后再使其中的水从固态升华成气态，从而达到物质干燥的方法。
冻干与烘干、喷雾干燥及真空干燥相比，由于冻干是在低温下进行干燥，所以藻蓝蛋白不会发生变性，同时还可以使微生物失去活力，尤其适合一些热稳定性差的生物活性制品、生物化学制品等的保存。干燥后的藻蓝蛋白其体积、形状都得到很好的保存，无干缩且复水速度快，很快就恢复到物质原有的形状。
低温环境下干燥，极大的抑制了微生物的生长和酶的作用，延长了产品的货架期；同时减小物质中含有的挥发性成分、芳香成分和热敏性营养成分等的损失，因此是一些化学制品、药品和食品的最佳干燥方式。
冻干能使干燥物质的水分控制在0.5％～5％之间，极大的控制了成品的水分含量，冻干是在真空条件下进行的，由于氧气极少，所以在一定程度上很好的保护了一些容易被氧化的物质。
冻干后的产品质量变轻，运输费用随之减低，可以长期储存，又可以降低产品因变质带来的经济损失。所以，和其他干燥方式相比，冻干自身独特的优势是加工干燥产品的最佳选择。
所述真空冷冻干燥分为3个阶段，为预冷冻阶段、升华干燥阶段和解析干燥阶段。具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液放入真空泵预冷冻5～6小时达到-50℃后，打开真空泵进入升华干燥阶段，此阶段耗时较长，当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下直至干燥完成。
所述喷雾干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液，以进风温度110℃～130℃、出风温度70℃～90℃的条件进行喷雾干燥，最终在主收料中获取藻蓝蛋白干粉。
所述烘干干燥具体为，将添加海藻糖和柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液放入烘干干燥机中，在温度50℃的条件进行干燥，得到藻蓝蛋白干粉。
在本发明一个具体实施方式中，所述盐胁迫藻泥的藻泥种类为多管藻、念珠藻、聚球藻、隐藻或螺旋藻等，种类不受限制，进一步优选的为螺旋藻。
目前，盐胁迫藻泥可通过多种培养方法获得，并不需要特别的限定。但为了能够快速有效的制造大量的藻细胞，本发明提出一种优选的藻种养殖方法，本专利申请人已经作为其他专利申请进行保护，该方法包括：将藻细胞接种于低盐的淡水培养基中进行培养，其中盐浓度小于100mmol/L。
优选的，该阶段的培养时间为3-20天。
优选的，该阶段的培养温度为：15-40℃，进一步优选的，该阶段的培养温度为20-40℃。
优选的，所述低盐的淡水培养基中含有氮、磷、铁、镁、钠、钾以及微藻成长所需要的微量元素。
优选的，所述低盐的淡水培养基的配方为Zarrouk培养基，详细成分见表1和表2。该低盐的淡水培养基能够使得藻细胞大量的繁殖，为大量合成和积累GG作基础。
表1Z氏培养基配方
表2母液配方
该阶段中选取了适宜波长的光照和碳源，以供光合作用。
对于碳源，在自养条件下选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐；在异养条件下，在低盐的淡水培养基中额外加入葡萄糖、麦芽糖、甘油、醋酸等。
在GG生成阶段中：
藻细胞选用上述获得培养后的藻细胞阶段培养后成长起来的细胞，在正常的情况下，在接入GG生成阶段的培养基之前细胞内部是不含有GG组分，或者即使含有也是很少的。
作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG，除了获得培养后的藻细胞阶段中所述微藻成长所需的营养元素以外，还需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，通常是选用能够改变细胞渗透压的物质，比如加入100～300mmol/L浓度的能够改变细胞渗透压的物质，该物质可以是氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
基于此，对该阶段的培养条件进行优化，以期获得含有GG的藻细胞，为拔高阶段提供良好基础。
优选的，该阶段的培养时间为3-20天，进一步优选的，该阶段的培养时间为5-10天。
优选的，培养温度为：15-40℃，进一步优选的，培养温度为20-40℃。
优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m-2·s-2。
进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
在GG拔高阶段一中：
在最优选的实施方式中，藻细胞特征是经过GG生成阶段培养后已经含有一定量的GG。在GG生成阶段中长时间持续培养，细胞会分泌一些对细胞成长起到阻碍作用的物质，从而导致细胞代谢活性降低，细胞内的GG合成能力下降。而将经过培养后含有一定量GG的细胞接入GG拔高阶段一的培养基后，细胞能够恢复活性继续成长，为GG合成反应提供驱动力，提高了GG累积的效率。
GG拔高阶段一的培养基条件，基本上与GG生成阶段相同，作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG。除了微藻成长所需的营养元素以外，需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，这种GG诱导物质的添加量至少要维持与GG生成阶段相同，增大GG诱导物质添加量更有效的促进GG的合成反应，比如加入300＜C1≤800mmol/L浓度的氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
基于此，对GG拔高阶段一的培养条件进行优化，以期获得较高含量GG的藻细胞。
优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。
优选的，培养温度为：15-40℃；进一步优选的，黑暗期间温度设置15-25℃，光照期间温度设置25-40℃。
优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m-2·s-2。
进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的混合气既能降低氧气浓度又能促进GG的积累。
在最优选的实施方式中，通过GG拔高阶段一培养后，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
在GG拔高阶段二中：
对于自养型微藻，选用与GG拔高阶段一相同培养条件，区别是能够改变细胞渗透压的物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
对于异养型微藻或者经过基因工程技术改造后提高细胞壁的小分子透过性的微藻细胞，在本培养基内除了使能够改变细胞渗透压的物质浓度为800＜C2≤1500mmol/L以外，还需添加合成GG的反应底物，比如甘油或者可以利用的糖，比如葡萄糖、麦芽糖，但不限于上述两种糖，可以进一步提高微藻细胞的GG含量。优选的，所述甘油或者葡萄糖，通过流加等方式维持甘油的浓度0.5-2g/L，葡萄糖的浓度为0.5-5g/L。
优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。
本发明人发现，不同的培养方法和培养条件对藻细胞内GG的含量影响较大，本发明通过特定的培养方法(包括昼夜组合方式、高盐培养藻种后再高盐度养殖，高光条件等)和逐级调控的模式，能够获得高含量GG的藻细胞。
在本发明一个优选的实施方式中，上述GG拔高阶段一或GG拔高阶段二步骤后还包括采收步骤，该步骤包括：从GG拔高阶段一或GG拔高阶段二中的培养基中采收富集GG的藻细胞，获得微藻藻泥。
在本发明一个优选的实施方式中，在采收的步骤后还包括清洗步骤，该步骤包括：清洗微藻藻泥表面，去除表面附着物，获得洁净藻泥。
本发明中的各个步骤所使用的反应器不限，可以是密闭式反应器，也可以是开放式跑道池。对于异养型微藻细胞，用封闭式反应器更有效的防止杂菌污染。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序二处理，在GG提取的同时回收藻蓝蛋白，获得含有藻蓝蛋白的萃取液。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与无盐水溶液按体积比1:1比例混合，萃取1次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)所得的低渗萃取液采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为0.1μm，再将精细过滤后的溶液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为2000D，低渗萃取液中的盐离子和GG透过滤膜，得到含有藻蓝蛋白的萃取液。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率13.3％，纯度为0.65。
实施例2
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序三、工序四处理，获得含有不同浓度的藻蓝蛋白粗提液。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与无菌去离子水按体积比1:1比例混合，萃取8次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)获得藻泥固体与浓度为1g/lCaCl2溶液混合，藻泥与CaCl2溶液按体积比1:10的比例混合，置于4℃环境下，并遮光处理，溶胀时间为6小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液。
3)将2)所得混合液经过工序四进行固液分离，在4℃环境下采用管式离心机进行高速离心，得到藻蓝蛋白粗提液。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率31.4％，纯度为0.63。
实施例3
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序二、工序三、工序四处理，获得含有不同浓度的藻蓝蛋白。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与镁盐水溶液按体积比1:1比例混合，萃取4次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)所得的低渗萃取液采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为5μm，再将精细过滤后的溶液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为0.1μm，低渗萃取液中的盐离子和GG透过滤膜，得到含有藻蓝蛋白的萃取液。
3)将1)获得藻泥固体与浓度为10g/lCaCl2溶液混合，藻泥与CaCl2溶液按体积比1:100的比例混合，置于40℃环境下，溶胀时间为72小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液。
4)将3)所得混合液经过工序四进行固液分离，在40℃环境下采用板框过滤机过滤，滤布大小为600目，得到藻蓝蛋白粗提液。将2)所得的含有藻蓝蛋白的萃取液与4)所得的藻蓝蛋白的粗提液混合。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率46.7％，纯度为0.78。
实施例4
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序三、工序四、工序五处理，获得藻蓝蛋白。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与无菌去离子水按体积比1:1比例混合，萃取6次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)获得藻泥固体与浓度为5g/lCaCl2溶液混合，藻泥与CaCl2溶液按体积比1:40的比例混合，置于15℃环境下，并遮光处理，溶胀时间为50小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液。
3)将2)所得混合液经过工序四进行固液分离，在15℃环境下采用板框过滤机过滤，滤布大小为2000目，得到藻蓝蛋白粗提液。
4)将3)所得的藻蓝蛋白粗提液采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为0.2μm，再将精细过滤后的溶液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为6000D，低渗萃取液中的盐离子和GG透过滤膜，得到含有藻蓝蛋白的萃取液。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率33.9％，纯度为0.73.
实施例5
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序二、工序六进行处理，对低渗萃取液脱杂质、脱盐、冻干处理，获得藻蓝蛋白。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与无菌去离子水按体积比1:1比例混合，萃取7次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)所得的低渗萃取液采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为1.5μm，再将精细过滤后的溶液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为2500D，低渗萃取液中的盐离子和GG透过滤膜，得到含有藻蓝蛋白的萃取液。
3)在2)所得的含有藻蓝蛋白的萃取液里添加海藻糖和柠檬酸钠，按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％：40％：20％的质量比添加，将添加海藻糖及柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液放入真空泵预冷冻5小时达到-50℃后，打开真空泵进入升华干燥阶段，当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下直至干燥完成，得到食品级藻蓝蛋白。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率29.7％，纯度为1.03。
实施例6
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序三、工序四、工序五、工序六进行脱杂质、脱盐、冻干处理，获得藻蓝蛋白。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与无菌去离子水按体积比1:1比例混合，萃取7次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)获得藻泥固体与浓度为8g/lCaCl2溶液混合，藻泥与CaCl2溶液按体积比1:40的比例混合，置于15℃环境下，并遮光处理，溶胀时间为30小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液。
3)将2)所得混合液经过工序四进行固液分离，在15℃环境下采用板框过滤机过滤，滤布大小为1200目，得到藻蓝蛋白粗提液。
4)将3)所得的藻蓝蛋白粗提液采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为3μm，再将精细过滤后的溶液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为2500D，低渗萃取液中的盐离子和GG透过滤膜，得到含有藻蓝蛋白的萃取液。
5)在4)所得的萃取液里添加海藻糖和柠檬酸钠，按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为80％：10％：10％的质量比添加，将添加海藻糖及柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液以进风温度117℃、出风温度83℃的条件进行喷雾干燥，最终在主收料中获取藻蓝蛋白干粉。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率65.7％，纯度为0.85。
实施例7
用上述方法获得盐胁迫藻泥，将藻泥通过工序一、工序二、工序三、工序四、工序五、工序六进行脱杂质、脱盐、冻干处理，获得藻蓝蛋白。方法示例如下：
1)使用工序一，将藻泥与无菌去离子水按体积比1:1比例混合，萃取8次，滤出微藻即可获得富含GG、藻蓝蛋白和盐分的低渗萃取液和藻泥固体。
2)将1)所得的低渗萃取液采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为0.2μm，再将精细过滤后的低渗萃取液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为2500D，低渗萃取液中的盐离子和GG透过滤膜，得到含有藻蓝蛋白的萃取液。
3)将1)获得藻泥固体与浓度为8g/lCaCl2溶液混合，藻泥与CaCl2溶液按体积比1:40的比例混合，置于4℃环境下，并遮光处理，溶胀时间为70小时，得到藻蓝蛋白和藻渣的混合液。
4)将3)所得混合液经过工序四进行固液分离，在4℃环境下采用碟片离心机进行高速离心，得到藻蓝蛋白粗提液。
5)将4)所得的藻蓝蛋白粗提液和2)所得的含有藻蓝蛋白的萃取液混合，并先采用膜过滤方法去杂质，选用的膜孔径为0.2μm，再将精细过滤后的混合液采用膜过滤方法进行浓缩和脱盐处理，选用的膜孔径为2500D，混合液中的盐离子透过滤膜，得到藻蓝蛋白浓缩液。
6)在5)所得的藻蓝蛋白浓缩液里添加海藻糖和柠檬酸钠，按照藻蓝蛋白：柠檬酸钠：海藻糖为40％：20％：10％的质量比添加，将添加海藻糖及柠檬酸钠后的藻蓝蛋白浓缩液放入真空泵预冷冻6小时达到-50℃后，打开真空泵进入升华干燥阶段，当隔板温度达到设定的最高温度40℃时，物料进入解析干燥阶段，并在这一温度下直至干燥完成，得到食品级藻蓝蛋白。
经过以上工序，藻蓝蛋白的回收率79.4％，纯度为1.54。
实验1：验证GG提取过程中藻蓝蛋白回收率
实验目的：验证GG提取过程中藻蓝蛋白回收率。
实验方法：在提取GG的低渗溶液中对藻蓝蛋白进行回收，测定藻蓝蛋白回收率。再通过CaCl2溶胀法，对提取完GG后的藻泥中剩余的藻蓝蛋白回收，测定藻蓝蛋白总回收率。
实验结果：
表3GG提取过程中藻蓝蛋白回收效果
小结：在GG的提取过程中造成了藻蓝蛋白的流失，不能充分的利用微藻的应用价值，经济效益不能最大化。然而对这部分藻蓝蛋白进行回收可以保证不影响GG的回收率的前提下，同时提高藻蓝蛋白的回收率，充分利用藻细胞中的营养成分，提高经济效益。
实验2：CaCl2溶胀法选择背景实验
实验目的：对比CaCl2溶胀法与其他方法的藻蓝蛋白回收率。
实验方法：选用盐胁迫后藻泥，依次经过反复冻融法，玻璃珠震荡法，超声波破碎法，CaCl2溶胀法，比较四者的回收率及纯度。
实验结果：
表4CaCl2溶胀法与其他方法藻蓝蛋白回收率结果
小结：假设以玻璃珠震荡法能够提取出全部的藻蓝蛋白为1，CaCl2溶胀法相比其他方法更能提取出高纯度高含量的藻蓝蛋白，因此选用CaCl2溶胀法用于提取藻蓝蛋白的方法。
以上已将发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。