一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法
阅读说明：本技术 一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法 (High-purity phycocyanin and method for extracting phycocyanin from spirulina ) 是由 杨南超 于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法,应用于生物化学技术领域,包括以下步骤：(1)螺旋藻破壁：将螺旋藻粉浸泡于氯化钠溶液中,离心,得上清液；(2)藻蓝蛋白粗提纯：向步骤(1)上清液中加入多功能化硅胶材料I,搅拌,过滤,取上清液,得藻蓝蛋白粗提液；(3)藻蓝蛋白精提纯：向步骤(2)上清液中加入多功能化硅胶材料II,搅拌,过滤,洗脱,干燥,得高纯度藻蓝蛋白。本发明是一种具有低成本易操作、高纯度,适合于大规模生产等优点的藻蓝蛋白提取纯化方法,其具有非常重要的意义。(The invention relates to a high-purity phycocyanin and a method for extracting the phycocyanin from spirulina, which are applied to the technical field of biochemistry and comprise the following steps: (1) breaking the walls of spirulina: soaking the spirulina powder in a sodium chloride solution, and centrifuging to obtain a supernatant; (2) crude purification of phycocyanin: adding the multifunctional silica gel material I into the supernatant obtained in the step (1), stirring, filtering, and taking the supernatant to obtain a crude phycocyanin extracting solution; (3) purifying phycocyanin essence: and (3) adding the multifunctional silica gel material II into the supernatant obtained in the step (2), stirring, filtering, eluting and drying to obtain the high-purity phycocyanin. The phycocyanin extracting and purifying method has the advantages of low cost, easy operation, high purity, suitability for large-scale production and the like, and has very important significance.)
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种高纯度藻蓝蛋白及其从螺旋藻中提取的方法。
背景技术
螺旋藻是一种丰富含蛋白质、维生素、必需氨基酸、矿物质和必需脂肪酸的丝状微藻，其丰富的藻蓝蛋白是自然界非常非常少见的蛋白之一，它不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高，占氨基酸总量的37.42％，藻蓝蛋白可以帮助调节和合成人体代谢所需要的多种重要酶，对抑制癌细胞的生长和促进人体细胞再生具有重要作用，同时，藻蓝蛋白还能调节人体免疫系统，增强免疫系统功能，提高人体对疾病的抵抗能力，因此，藻蓝蛋白被食品专家形象地称为“食物钻石”。
藻蓝蛋白是是美国FDA认可的唯一天然蓝色色素，可以作为食品和化妆品的添加剂，高纯度的藻蓝蛋白具有强烈的荧光特性，荧光强度比常用的荧光素强30倍到100倍，可将其制备成荧光探针，用于科学研究检测；随着藻蓝蛋白作为一种功能性成分在抗癌、消炎、补血、护肝、保养卵巢、抗氧化，增加白细胞方面不断的被科研机构证明，藻蓝蛋白的分离提纯技术成为时下人们研究的热点。
传统的藻蓝蛋白分离提纯技术一般通过超声、反复冻融、酶解和高压均质等方法使细胞裂解获得藻蓝蛋白粗提物，然后将(NH4)2SO4沉淀法与多种色谱层析法结合使用，此类方法存在步骤繁琐、蛋白质损失量较大、难以规模化推广，且高于50％的生产成本用在纯化的过程中等缺点。
近几年不断发展起来的新技术如双水相萃取技术、反胶团萃取技术、膨胀床吸附、壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex柱层析及其一些不同技术结合使用(如盐析结合双水相萃取技术，等电点结合双水相萃取)等为藻蓝蛋白的分离提纯提供了新方法，但也存在相应缺点：反胶团萃取法相对于加盐反萃取操作难度有所下降，但此方法仍不成熟，有部分藻蓝蛋白流失，提取率低；双水相萃取法具有易于放大和操作，节省时间，降低能耗和成本，分离过程条件温等优势，但不易完全从聚合物中分离出藻蓝蛋白；膨胀床吸附法等集成化优势，回收率高，简化操作，降低成本，缩短操作时间，但技术不成熟，操作具有不确定性；盐析结合双水相萃取法可大幅提高藻蓝蛋白的纯度但操作步骤繁琐，耗时长；等电点结合双水相萃取能有效除掉藻毒素和重金属污染，但蛋白质分子结构易发生变化；壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex柱层析法耗时短，操作简便，但对仪器操作要求非常高。
因此，研发一种具有低成本易操作、高纯度，适合于大规模生产等优点的藻蓝蛋白提取纯化方法，其具有非常重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种从螺旋藻中提取高纯度藻蓝蛋白的方法，利用低浓度氯化钠溶液对螺旋藻粉进行溶胀破壁，用以释放藻蓝蛋白等物质，再利用两种已知的多功能化硅胶材料对藻蓝蛋白进行纯化，包括以下步骤：
(1)螺旋藻破壁：将螺旋藻粉浸泡于氯化钠溶液中，离心，得上清液；
(2)藻蓝蛋白粗提纯：向步骤(1)上清液中加入多功能化硅胶材料I，搅拌，过滤，取上清液，得藻蓝蛋白粗提液；
(3)藻蓝蛋白精提纯：向步骤(2)上清液中加入多功能化硅胶材料II，搅拌，过滤，洗脱，干燥，得高纯度藻蓝蛋白。
在本发明的某些实施方式中，步骤(2)所述多功能化硅胶材料I的化学式为：[(O3/2)Si(CH2)xS(CH2)yNH(CH2CH2NH)zH]a[Si(O4/2)]b[(CH2)uWSi(O3/2)]c；
其中，x是从2到12的整数；y是从3到12的整数；z是0到100的整数；u是从2到12的整数；W是SH或S(CH2)vSH，v是2到6的整数；a，b，c均为整数，且a+c：b的比例介于0.000001至100，a和b始终存在，当c大于零时，c与a+b的比介于0.000001至10。
在本发明的某些实施方式中，步骤(3)所述多功能化硅胶材料II的化学式为：[[(O3/2)Si(CH2)xP(＝O)(OM)2]mFen]a[Si(O4/2)]b[(CH2)uWSi(O3/2)]c[VSi(O3/2)]d；
其中，M是H、碱金属、碱土金属，x是从2到12的整数；u是从2到12的整数；W是SH或S(CH2)vSH，v是2到6的整数；V选自C1-22-烷基、C1-22-烷基芳基、芳基、C2-20-烷基硫醚基、C1-12烷基、C2-20-亚烷基硫醚烷基、C2-20-烷基硫醚芳基、C2-20-亚烷基硫醚芳基；a，b，c，d，m，n均为整数，且a+c+d：b的比例介于0.000001至100，a和b均始终存在，当c或d或二者均大于零时，c+d与a+b的比例介于0.000001至100；m与n的比值介于100～0.01。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤(1)为按固液比1：10～50g/ml，将螺旋藻粉加入0.01-0.1M氯化钠溶液中浸泡2-8h，再以6000rpm的转速离心30min。
在本发明的某些实施方式中，步骤(2)和步骤(3)，所述多功能化硅胶材料I和所述多功能化硅胶材料II的粒径均为200～500um，搅拌时间均为2～8h，搅拌温度均为10～40℃，过滤所用滤布目数均为200目。
在本发明的某些实施方式中，步骤(2)和步骤(3)，所述多功能化硅胶材料I和所述多功能化硅胶材料II与含藻蓝蛋白液体的固液比均为：10～25g/L。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤(3)中的洗脱包括：
a.向过滤后的固体中加入0.005～0.01M磷酸缓冲液搅拌0.5～2h，固液比为1:50～1000g/ml，用200目滤布过滤，保留固体；
b.向步骤a所得固体中加入0.05～0.5M的磷酸缓冲液搅拌2～4h，固液比为1:1～10g/ml，用40目滤布过滤，保留液体；
c.对步骤a所得固体重复两次步骤b，保留液体。
在本发明的某些实施方式中，将步骤b和步骤c所得液体在冷冻干燥机内进行干燥得高纯度藻蓝蛋白。
在本发明的某些实施方式中，步骤a和步骤b所述磷酸缓冲液的pH均为6～7。
本发明还提供一种根据上述方法提取得到的高纯度藻蓝蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明采用低浓度氯化钠溶液对螺旋藻粉进行溶胀破壁，时间短，操作简单，无设备要求，能耗小，更环保。
2、本发明所述的多功能化硅胶材料的粒径可定制，过滤简单速度快，所用滤布较滤膜成本低，分离提纯过程可在大型搅拌罐中进行，可大规模的应用。
3、本发明利用多功能化硅胶材料对杂质和藻蓝蛋白吸附的先后顺序，控制材料用量比，用以实现定向吸附和洗脱，所得藻蓝蛋白纯度高，粗提纯A620/A280＞2，高于食品级别，精提纯A620/A280＞5，高于试剂级别。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：
本实施例提供了一种从螺旋藻中提取高纯度藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
多功能化硅胶材料I的合成：
在安装有玻璃塞和冷凝回流装置的500mL三口烧瓶中加入0.4mol二乙烯三胺和0.4mol 3-(3-氯丙基)硫丙基三甲氧基硅烷，在130℃下回流2.5h后冷却到70℃，加入40mL甲醇回流1小时，冷却后，投入125ml二甲苯和90g无定形硅胶(200-500μm,Makall)的混合溶液，在125℃下回流2h后，再投入0.2mol 3-巯丙基三甲氧基硅烷持续加热5小时后冷却，过滤用甲醇洗涤5次后干燥，得到化学式I中的一种组分，其中x＝3，y＝3，z＝2，u＝3，W为SH。
多功能化硅胶材料II的合成：
在200L反应釜中加入20kg硅胶(300-500μm,)和42L水，在100℃搅拌混合，再加入16mol乙烯基三甲氧基硅烷，将反应混合物加热并搅拌5h，冷却后过滤固体，用水充分洗涤，干燥后生成乙烯基硅胶固体；在50L反应釜中投入亚磷酸(3280g,40mol)和RO(10L)水并开启搅拌，投入乙烯基硅胶(1.4-2.0mmol/g，4.0kg)并加入40ml叔丁基过氧化氢，保持室温搅拌40min后，开启加热，油浴锅温度设定在130℃，当油浴锅温度达到且有液体回流时，开始以每15分钟8ml加入叔丁基过氧化氢，冷却后将液体移除，固体中加30L水搅拌30min后过滤，再向固体中加入更多的水(30L)，将混合物搅拌30min后过滤，此过程再重复3次后干燥，取5g产物加入100ml的100ppm硫酸铁溶液，在60℃下搅拌6h后过滤洗涤干燥，得化学式II的一种组分，其中M是H；x是3；整数c是0，整数d是0。
螺旋藻破壁：在2L烧杯中加入50g螺旋藻粉与1L浓度为0.05M的氯化钠溶液，浸泡6h后，将溶液在6000rpm下离心30min，取上清液。
藻蓝蛋白粗提纯：向上述上清液中加入10g多功能化硅胶材料I，在10℃下搅拌6h后，用200目滤布过滤，得藻蓝蛋白粗提取液，其中，A620/A280＝2.9。
藻蓝蛋白精提纯：
第一步，向藻蓝蛋白粗提取液中加入10g多功能化硅胶材料II，在40℃下搅拌4h后，用200目滤布过滤，留固体；
第二步，向第一步过滤后的固体中加入1L浓度为0.01M的磷酸缓冲液(pH为6～7)搅拌0.5h，用200目滤布过滤，留固体；
第三步，向第二步所得固体中加入20ml浓度为0.5M的磷酸缓冲液(pH为6～7)搅拌2h，用40目滤布过滤，保留液体；
第四步，对第二步所得固体重复第三步操作两次，保留液体；
第五步，将第三、四步中所得液体在冷冻干燥机下进行干燥，得高纯度藻蓝蛋白，其中，A620/A280＝5.8。
实施例2：
本实施例提供了一种从螺旋藻中提取高纯度藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
多功能化硅胶材料I的合成：
在安装有玻璃塞和冷凝回流装置的500mL三口烧瓶中加入0.4mol多乙烯多胺和0.4mol 3-(3-氯丙基)硫丙基三甲氧基硅烷，在130℃下回流2.5h后冷却到70℃，加入40mL甲醇后回流1小时，冷却后，投入125ml二甲苯和90g球形硅胶(300-500μm,Makall)的混合溶液，于125℃下回流2h后，再投入0.2mol 3-巯丙基三甲氧基硅烷后持续加热5小时后冷却，过滤用甲醇洗涤5次后干燥得得化学式I的一种组分，其中x＝3,y＝3,z＝9,u＝3,W为SH。
多功能化硅胶材料II的合成：
在200L反应釜中加入20kg硅胶(300-500μm,)和42L水，在100℃搅拌混合，再加入16mol乙烯基三甲氧基硅烷，将反应混合物加热并搅拌5h，冷却后过滤固体，用水充分洗涤，干燥后生成乙烯基硅胶固体，在50L反应釜中投入亚磷酸钠(4880g,40mol)和RO(10L)水并开启搅拌，投入乙烯基硅胶(1.4-2.0mmol/g，4.0kg)并加入40ml叔丁基过氧化氢，保持室温搅拌40min后开启加热，油浴锅温度设定在130℃，当油浴锅温度达到且有液体回流时开始以每15分钟8ml加入叔丁基过氧化氢，冷却后将液体移除，固体加30L水搅拌30min后过滤，再向固体中加入更多的水(30L)，将混合物搅拌30min后过滤。此过程再重复3次后干燥，取5g产物加入100ml的100ppm硫酸铁溶液，在25℃下搅拌4h后过滤洗涤干燥，得化学式II的一种组分，其中M是Na；x是3；整数c是0，整数d是0。
螺旋藻破壁：在2L烧杯中加入50g螺旋藻粉与1L浓度为0.1M的氯化钠溶液，浸泡4h后，将溶液在6000rpm下离心30min，取上清液。
藻蓝蛋白粗提纯：向上述上清液中加入10g多功能化硅胶材料I，在30℃下搅拌4h后，用200目滤布过滤，得藻蓝蛋白粗提取液，其中，A620/A280＝3.5。
藻蓝蛋白精提纯：
第一步，向藻蓝蛋白粗提取液中加入15g多功能化硅胶材料II，在20℃下搅拌6h后，用200目滤布过滤，留固体；
第二步，向第一步过滤后的固体中加入1L浓度为0.01M的磷酸缓冲液(pH为6～7)搅拌0.5h，用200目滤布过滤，留固体；
第三步，向第二步所得固体中加入20ml浓度为0.5M的磷酸缓冲液(pH为6～7)搅拌2h，用40目滤布过滤，保留液体；
第四步，对第二步所得固体重复第三步操作两次，保留液体；
第五步，将第三、四步中所得液体在冷冻干燥机下进行干燥，得高纯度藻蓝蛋白，其中，A620/A280＝6.3。
实施例3：
本实施例提供了一种从螺旋藻中提取高纯度藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：
多功能化硅胶材料I的合成：
在安装有玻璃塞和冷凝回流装置的500mL三口烧瓶中加入0.4mol多乙烯多胺和0.4mol 3-(3-氯丙基)硫丙基三甲氧基硅烷，在130℃下回流2.5h后冷却到70℃，加入40mL甲醇后回流1小时，冷却后，投入125ml二甲苯和90g球形硅胶(300-500μm,Makall)的混合溶液，于125℃下回流2h后，再投入0.2mol 3-巯丙基三甲氧基硅烷后持续加热5小时后冷却，过滤用甲醇洗涤5次后干燥得得化学式I的一种组分，其中x＝3,y＝3,z＝9,u＝3,W为SH。
多功能化硅胶材料II的合成：
在200L反应釜中加入20kg硅胶(300-500μm,)和42L水，在100℃搅拌混合，再加入16mol乙烯基三甲氧基硅烷，将反应混合物加热并搅拌5h，冷却后过滤固体，用水充分洗涤，干燥后生成乙烯基硅胶固体，在50L反应釜中投入亚磷酸钠(4880g,40mol)和RO(10L)水并开启搅拌，投入乙烯基硅胶(1.4-2.0mmol/g，4.0kg)并加入40ml叔丁基过氧化氢，保持室温搅拌40min后开启加热，油浴锅温度设定在130℃，当油浴锅温度达到且有液体回流时开始以每15分钟8ml加入叔丁基过氧化氢，冷却后将液体移除，固体加30L水搅拌30min后过滤，再向固体中加入更多的水(30L)，将混合物搅拌30min后过滤。此过程再重复3次后干燥，取5g产物加入100ml的100ppm硫酸铁溶液，在25℃下搅拌4h后过滤洗涤干燥，得化学式II的一种组分，其中M是Na；x是3；整数c是0，整数d是0。
螺旋藻破壁：在2L烧杯中加入50g螺旋藻粉与1L浓度为0.1M的氯化钠溶液，浸泡4h后，将溶液在6000rpm下离心30min，取上清液。
藻蓝蛋白粗提纯：向上述上清液中加入10g多功能化硅胶材料I，在30℃下搅拌4h后，用200目滤布过滤，得藻蓝蛋白粗提取液，其中，A620/A280＝3.9。
藻蓝蛋白精提纯：
第一步，向藻蓝蛋白粗提取液中加入25g多功能化硅胶材料II，在20℃下搅拌6h后，用200目滤布过滤，留固体；
第二步，向第一步过滤后的固体中加入1L浓度为0.01M的磷酸缓冲液(pH为6～7)搅拌0.5h，用200目滤布过滤，留固体；
第三步，向第二步所得固体中加入20ml浓度为0.5M的磷酸缓冲液(pH为6～7)搅拌2h，用40目滤布过滤，保留液体；
第四步，对第二步所得固体重复第三步操作两次，保留液体；
第五步，将第三、四步中所得液体在冷冻干燥机下进行干燥，得高纯度藻蓝蛋白，其中，A620/A280＝6.8。
本发明实施例1-3中关于多功能化硅胶材料I以及多功能化硅胶材料II的合成方法，已经分别在中国专利CN110368905A和中国专利CN111939875A中公开，本发明涉及到关于多功能化硅胶材料I以及多功能化硅胶材料II的其他化学式可参照上述专利进行合成，本发明不再进行赘述，本发明重点在于对上述多功能化硅胶材料I以及多功能化硅胶材料II在藻蓝蛋白提取过程中的应用，通过本发明所述的提取方法，可以实现在螺旋藻中得到高纯度的藻蓝蛋白，其中，粗提纯A620/A280＞2，高于食品级别，精提纯A620/A280＞5，高于试剂级别。
本发明实施例中，所述螺旋藻粉的含量为50％蛋白质、20％多糖、10％藻蓝蛋白、7％水分、2％叶绿素、0.5类胡萝卜素、2％油脂、5％不溶解细胞壁以及1.5％核酸类；所述多功能化硅胶材料I为二氧化硅负载有机官能团氨基(NH2)和巯基(SH)，二氧化硅上面有大量的羟基(OH)，根据其极性强弱，可不同程度的吸附藻蓝蛋白中的有机成分，根据有机物的结构差异，此吸附也是有先后顺序的，多功能化硅胶材料I的添加量就可以决定先吸附哪个有机物，研究表明多功能化硅胶材料I主要吸附杂质叶绿素及部分杂蛋白一类，将参数用量控制在一定范围内(例如多功能化硅胶材料I与含藻蓝蛋白液体的固液比控制在10～25g/L)就可以将藻蓝蛋白纯度控制在食品级范围内的(A620/A280＞2)，同时多功能化硅胶材料II主要吸附藻蓝蛋白和少量杂蛋白，多糖等，磷酸缓冲液不同的浓度可以洗脱不同的物质，本发明实施例中pH为6～7的磷酸缓冲液正好可以洗脱藻蓝蛋白，从而获得高纯度藻蓝蛋白(A620/A280＞5)。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。