具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

请参阅图1；

一种藻蓝色素稳定性及其酸解改性研究方法，包括以下步骤：

S1、以藻蓝色素为原料，精确称取一定量的藻蓝色素，配置成适宜浓度的藻蓝色素溶液；

S2、以色素保存率为指标，结合色度变化，系统研究环境因素和添加剂种类对藻蓝色素溶液实验组稳定性的影响，分析藻蓝色素稳定性的影响因素；

S2中提到的环境因素和添加剂种类具体包括有温度、pH、光照、金属离子、氧化还原剂和食品添加剂；色素保存率的计算公式为：

式中，A₁表示最终吸光度值，A₀表示起始吸光度值；

S3、取用藻蓝色素溶液置于具塞试管中，向实验组的试管中添加蛋白质保护剂，充分摇晃、混匀；

S4、将S3中处理后的实验组试管置于65℃的水中水浴1h后取出，立即用冰水冷却；

S5、测量S4中各实验组的吸光度值A，根据其计算色素保存率，进而分析得出蛋白质保护剂对藻蓝色素热稳定性的影响，同时进一步探究藻蓝色素热降解规律及有效保护剂对藻蓝色素热降解过程的动力学及热力学参数的影响；

S3-S5在探究藻蓝色素热降解规律及有效保护剂对藻蓝色素热降解过程的动力学及热力学参数的影响时，为进一步探究保护剂提高藻蓝色素热稳定性的机理，分别在分别在65℃、70℃、75℃、80℃条件下对添加不同保护剂的藻蓝色素溶液进行加热处理，每隔5min取样，迅速冷却后测定藻蓝色素含量，以不加保护剂的藻蓝色素溶液在同样热处理条件下测得的结果为空白对照；绘制热降解曲线，符合一级动力学模型

ln(p/p0)＝-kt

式中：P0为初始藻蓝浓度，mg/mL；P为加热t时间后藻蓝浓度，mg/mL；k为一级反应速率常数，min^-1；t为加热时间；

半衰期计算公式为

t_1/2＝ln2/k

在热力学上，化学反应速率常数随温度变化的关系常用阿伦尼乌斯方程表示，以热降解速率常数的对数值分别与相应的绝对温度的倒数进行回归，做阿伦尼乌斯图，根据所得回归直线斜率可计算活化能Ea：

lnk＝lnA-Ea/RT

联合Eyring过渡态理论可计算得到其它热力学参数

△H＝Ea-RT

△S＝R[lnA-ln(kB/hp)-lnT]

△G＝△H-T△S

式中：A为指前因子，min^-1；R为气体常数，8.314J/mol·K；T为开氏温度，K；kB为玻尔兹曼常数；hp为普朗克常数；Ea为活化能，J/mol；△H为活化焓，J/mol；△S为活化熵，J/mol·K；△G为吉布斯自由能，J/mol；

S6、设计单因素及正交实验，优化藻蓝色素酸解工艺，得到酸解产物，研究酸解产物的特性，同时更进一步的添加多酚作为增色剂研究其稳定性；

S6中提到的单因素及正交试验，具体包括以下步骤：

A1、准确称取适量藻蓝色素，将藻蓝色素与盐酸按比例混合，置于室温下磁力搅拌进行酸解反应；

A2、根据实验需要对S1中混合溶液进行相应时长的搅拌酸解，到达规定时间后，加入适量纯净水稀释，使得酸解反应停止；

A3、将A1-A2中所提到的酸解反应时间、藻蓝色素与酸质量比以及盐酸浓度作为实验因素，将其作为单因素实验变量或者采用正交方法对实验因素进行处理，重复A1-A2中操作；

A4、将稀释后的混合溶液放置在离心机上进行离心处理，取其沉淀用水复溶后调pH至中性，冷却干燥得到酸解改性藻蓝色素，测定产物质量；

A5、取A4中所得酸解改性藻蓝色素，配成一定浓度的pH2.5的色素溶液，测器色差以及全波长扫描，以产物质量及其色差b^*值为指标，确定最适酸解时间；

S7、通过傅里叶红外、激光粒度分布仪、圆二色谱和原子力显微镜对原藻蓝色素以及S6中所得的酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物的内部结构变化进行表征；

S7中提到的对原藻蓝色素以及S6中所得的酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物的内部结构变化进行表征，具体包括酸解改性藻蓝色素的氨基酸测定及评价、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物粒径测定、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物微观结构测定、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物傅里叶红外测定以及酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物圆二色谱测定，其中氨基酸评价采用Bano的计算方法，计算公式如下：

AAS＝Ax/As×100％

式中，AAS指氨基酸评分；Ax指待测蛋白质中所含某种氨基酸的量，mg/g；As指FAO/WHO评分标准中某种氨基酸的量，mg/g；

S8、基于S7中所得表征信息，结合S1-S6中实验内容，整理分析得出藻蓝色素稳定性及其酸解改性研究方法。

本发明从藻蓝色素稳定性影响因素入手，采用分光光度法确立以色素保存率为指标的评价方法；研究了温度、pH、光照、金属离子、氧化还原剂对藻蓝色素稳定性的影响，探究证实了对藻蓝色素保存率影响最大的为温度和pH，藻蓝色素应尽量保持在40℃以下，pH4～6，避免强光光照的环境中；本发明从藻蓝色素的热稳定性入手，采用动力学的方法并结合热力学参数，研究多羟基化合物(糖类、多元醇)对藻蓝色素热稳定性的影响，探究其热降解动力学规律，结合荧光光谱进行分析，证实了糖和多元醇在加热条件下对藻蓝色素的保护作用是与藻蓝色素的辅基蛋白部分以氢键相结合，保护了辅基蛋白结构的稳定性；本发明针对藻蓝色素的酸稳定性，对藻蓝色素进行酸解改性以期解决其在酸性条件下不稳定且沉淀的问题，通过实验探究确定了藻蓝色素酸解的最佳工艺；同时进一步探究了酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物的性质，有效提高了藻蓝色素的热稳定性，同时证实酸解改性后的藻蓝色素的DPPH清除率、总还原力、ABTS清除率均有所提高；本发明对酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物的内部结构变化进行表征，探究证实了酸解改性对藻蓝色素个氨基酸的相对含量响应不大，第一限制性氨基酸均为赖氨酸，且探究发现经酸解改性后藻蓝色素在酸性溶液中溶解性更好。综上，本发明以藻蓝色素为研究对象，对其稳定性影响因素进行详细考察，并从热不稳定性和酸不稳定性两方面着手，成功探究出提高藻蓝色素热稳定性和酸稳定性的方法，为藻蓝色素的实际应用和推广提供了新的思路。

实施例2：

请参阅图2-9，基于实施例1但有所不同之处在于，如图2所示，酸解改性藻蓝色素制备工艺流程具体为：

1.1称取适量藻蓝色素，将藻蓝色素与盐酸以质量比1:3混合，置于室温下磁力搅拌进行酸解，盐酸浓度选择12mol/L，反应2.5h后加入适量水稀释终止反应，置于离心机5000r/min离心30min，取其沉淀用水复溶后调pH至中性，冷冻干燥得到酸解改性藻蓝色素；

1.2上述所得酸解改性藻蓝色素在酸性条件下有较好的溶解性，尤其pH2.0-3.0的条件下，仍呈现亮蓝色，且热稳定性、光稳定性显著提高(如图3所示)；

1.3上述所得酸解改性藻蓝色素在pH2.0-4.0的环境中，其颜色及稳定性得到显著改善，而在其他pH条件下呈色不佳(如图4所示，其中A-I分别为pH2.0-10.0)；

2.1通过在水溶液中将原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及特定优化的多酚复配，形成原藻蓝色素-酸解改性藻蓝色素-多酚三者复合物，该复合物在酸性条件下能够具有更高的溶解性及更佳的呈色效果，对酸、热及光稳定性增强，且在pH2.0-10.0条件下都能保持良好的溶解性和亮蓝色。优先选择原藻蓝:酸解改性藻蓝色素:单宁酸以质量比30:5:1-3:2:1、原藻蓝:酸解改性藻蓝色素:迷迭香酸以质量比30:5:2-3:2:2进行充分混合(注：原藻蓝色素、原藻蓝色素-酸解改性藻蓝色素、原藻蓝色素-酸解改性藻蓝色素-单宁酸复合物、原藻蓝-酸解改性藻蓝色素-迷迭香酸复合物分别以pc、pc-AHpc、pc-AHpc-TA、pc-AHpc-RA表示)；

2.2按照如图5所示工艺流程来制备复合物，实验发现，复合物在pH 2.0-10.0条件下均能保持更深的蓝色及更强的稳定性(如图6所示，图中A-I分别为pH2-10)；

2.3上述2.2中制备所得复合物较原藻蓝色素及酸解改性藻蓝色素而言，酸稳定性、热稳定性及光稳定性均有明显提高(如图6-图8所示)；

2.4结合2.3及图6-8内容所示，明显得出复合物的水溶液具有更高的算稳定性、热稳定性及光稳定性，能够很好的克服原藻蓝色素诸多不稳定性弊端，对藻蓝色素推广及应用具有重要意义。

综上所述，本发明采用盐酸适度酸解法对藻蓝色素精准改性，通过考察不同酸解条件下藻蓝色素的呈色效果，确定最佳改性工艺，并利用优选的多酚增色、护色效果，即：将原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及多酚三者以合理比例进行复配，并利用三者间的相互作用，通过优化和复配，实现在pH 2.0-pH10.0全范围条件下保持藻蓝色素复合物具有稳定的亮蓝色，且其热稳定性、光稳定性也得到明显提高。

实施例3：

请参阅图10-11，基于实施例1-2但有所不同之处在于，通过傅里叶红外、激光粒度分布仪、原子力显微镜对原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物的内部结构变化进行表征，具体操作包括有：

(3.1)酸解改性藻蓝色素的氨基酸测定及评价

参照GB/T5009.124-2016对藻蓝色素及酸解改性藻蓝色素的氨基酸组成及含量进行测定。氨基酸评价采用Bano的计算方法，公式如下：

AAS＝Ax/As×100％

式中，AAS指氨基酸评分；Ax指待测蛋白质中所含某种氨基酸的量，mg/g；As指FAO/WHO评分标准中某种氨基酸的量，mg/g。

由表1看出，藻蓝色素酸解改性前后都含有17种氨基酸(未检测色氨酸)，种类丰富且合理。酸解改性藻蓝色素与原藻蓝色素相比，其氨基酸的相对含量变化不大，必需氨基酸中异亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸比例有所增加。两种物质中氨基酸含量最多的均为谷氨酸，必需氨基酸中含量最多的均为亮氨酸。

由表2中看出，原藻蓝色素除缬氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、赖氨酸外其余氨基酸评分均大于100，表明藻蓝色素的氨基酸含量丰富，能满足甚至远远超出人体对必须氨基酸的需求，且酸解改性藻蓝色素的氨基酸评分均大于原藻蓝色素。原藻蓝色素和酸解改性藻蓝色素的第一限制性氨基酸均为赖氨酸，且氨基酸评分分别为72.09、79.70。

表1原藻蓝色素与酸解改性藻蓝色素氨基酸相对含量(％)

表2藻蓝色素及酸解改性藻蓝色素的氨基酸评分

(3.2)酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物粒径测定

配制pH 2.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素、单宁酸-藻蓝色素复合物、迷迭香酸-藻蓝色素复合物，配制成0.1％溶液，充分搅拌至完全溶解后在粒度仪上进行测定。以水为分散剂，折光率为5％-8％，介质折射率为1.53。

采用粒度仪对原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及其与单宁酸、迷迭香酸的复合物的粒径进行测定，结果如表3所示。原藻蓝色素在pH 2.5的酸性环境中D50为24.46μm，经酸解改性后D50减小为13.46μm，且D[4,3]、D[3,2]均减小，说明经酸解改性后藻蓝色素的体积、表面积变小，在溶液中颗粒更小，说明经过酸解改性后的藻蓝色素能够改善其在酸性溶液中的溶解状态。在加入单宁酸和迷迭香酸后粒径均增大，说明两种多酚和酸解改性藻蓝色素可能通过氢键或疏水相互作用结合，从而使粒径增大。TA-AHpc比RA-AHpc的粒径更大，这可能是与单宁酸分子量大，有更多的结合位点，更容易与蛋白质结合有关。这与凝胶电泳测得分子量的变化趋势相一致。

表3pc、AHpc、TA-AHpc、RA-AHpc的粒度分布分析

注：D₁₀、D₂₅、D₅₀、D₇₅、D₉₀分别指颗粒直径小于该值的颗粒占总颗粒的10％、25％、50％、75％、90％。D[4,,3]指颗粒粒径对颗粒体积的加权平均；D[3,2]指颗粒粒径对颗粒表面积的加权平均。

(3.3)酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物微观结构测定

将稀释后的原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物溶液分别滴加在新拨开的云母片表面中间，置室温下待其自然风干。将云母片固定在原子力显微镜的扫描台上进行扫描，观察不同处理后的藻蓝色素表面形貌。

图10分别显示了原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素、单宁酸-酸解改性藻蓝色素、迷迭香酸-酸解改性藻蓝色素的原子力显微镜照片，原藻蓝色素呈长链状结构，与汪兴平的实验观察结果一样，链条粗度1nm左右。经酸解后，盐酸“剪切”藻蓝色素使长链状结构变短，均匀地趴于基底上，且链条粗度变为0.6nm，这进一步证实盐酸酸解对藻蓝色素产生一定的破坏作用，藻蓝色素分子量变小，结构发生改变，这与聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果一致；观察TA-AHpc结构发现，TA的添加使酸解改性藻蓝色素重新聚集，无序的短链聚集成团，粗度增大至5～10nm，RA对酸解改性藻蓝色素的聚合作用较弱，部分聚集成2.5nm左右的不规则形状，其余部分仍呈短链状分散。这一现象可能与单宁酸分子量大，结合位点多，从而与酸解改性藻蓝色素的结合能力更强有关。这一现象说明多酚与酸解改性藻蓝色素发生相互作用，可能与其对酸解改性藻蓝色素的增色及护色效果有关，由于多酚将酸解改性藻蓝色素进行“重组装”，使其结构更稳定，从而提高酸解改性藻蓝色素的稳定性。

(3.4)酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物傅里叶红外测定

采用溴化钾压片法对原藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物进行傅里叶红外光谱的测定，扫描范围为4000cm^-1～400cm^-1，分辨率为4cm^-1，扫描32次。

藻蓝色素、酸解改性藻蓝色素及其与多酚复合物的红外光谱如图9所示，藻蓝色素经酸解改性后峰型位置发生偏移且强度减小，在1750cm^-1以下的短波长范围内，峰型发生明显变化。酰胺基团中的N-H的伸缩振动与3100～3400cm^-1的吸收峰相关，一般认为3400～3440cm^-1附近为酰胺A带，与N-H伸缩振动有关；1600～1700cm^-1对应酰胺Ⅰ带，主要是由蛋白骨架肽链C＝O伸缩振动、H-O-H的弯曲振动引起的，是蛋白质二级结构变化的敏感区域；1500～1600cm^-1对应酰胺Ⅱ带，反映C-N、C-H键的振动；1200～1360cm^-1属于酰胺Ⅲ带，常与C-O、C-O-C键相关。原藻蓝色素在3500～3100cm^-1存在较大的吸收峰，而经酸解改性后峰强度变弱，这与N-H的伸缩振动有关。酸解改性藻蓝色素在3080cm^-1附近多出一个小峰，说明酸解使藻蓝色素出现更多的N-H，反应了酸解破坏藻蓝色素蛋白质部分肽键断裂。藻蓝色素酸解后酰胺Ⅰ带峰型及强度发生明显变化，说明二级结构改变，在1530cm^-1附近，酸解改性藻蓝色素酰胺Ⅱ带特征吸收峰变宽，表明发生了N-H弯曲和C-H的伸缩振动。从图中可以看出，酸解改性藻蓝色素与原藻蓝色素相比，在酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带的特征吸收峰变弱且出现向右偏移现象，表明经酸解后使得部分酰胺基转变为羧基，且氨基酸残基总吸光度发生变化，蛋白质的二级结构改变。

对照添加单宁酸和迷迭香酸前后酸解改性藻蓝色素的红外光谱发现，在3100～3400cm^-1处峰型及强度有所变化，说明氢键相互作用的存在，对照多酚空白(图11)发现反应后，3400cm^-1左右的特征吸收峰表示多酚的酚基或羟基的收缩振动，与酸解改性藻蓝色素反应后出现右移，说明两种多酚的羟基或酚基参与反应。在1200～1300cm^-1附近酸解改性藻蓝色素与多酚复合后，吸收峰强度增强，说明二者反应后有C-N键的形成。而在1600～1700cm^-1处，TA-AHpc、RA-AHpc复合物吸收峰的个数及位置均发生改变，说明多酚的添加使酸解改性藻蓝色素蛋白质部分的二级结构发生明显变化。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。