阅读说明：本技术 一种菜豆凝集素卵黄抗体及其制备方法与应用 (Phaseolus vulgaris agglutinin egg yolk antibody and preparation method and application thereof ) 是由 韩雪 陈泽才 陈禅友 徐勋 陈高 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种菜豆凝集素卵黄抗体及其制备方法与应用,所示方法包括：(1)将菜豆凝集素经处理后作为免疫原来免疫产蛋母鸡一段时间后收集鸡蛋；(2)去蛋清得蛋黄,稀释后用辛酸调pH至5.2～5.6进行第一次沉淀后离心取上清,加48％～52％硫酸铵溶液进行第二次沉淀后离心去除上清后,再加以33％～40％硫酸铵进行第三次沉淀,离心、去除上清后得到白色沉淀即为菜豆凝集素卵黄抗体粗品；(3)菜豆凝集素卵黄抗体的纯化：将得到的菜豆凝集素卵黄抗体粗品经G100分子筛、离子交换柱层析收集洗脱液,透析浓缩后即得；该菜豆凝集素卵黄抗体可有效识别和结合菜豆凝集素,并在动物实验中体现有优良的对菜豆凝集素的解毒作用。(The invention discloses a phaseolus vulgaris agglutinin egg yolk antibody and a preparation method and application thereof, wherein the method comprises the following steps: (1) treating phaseolus vulgaris agglutinin as immunogen to immunize egg laying hens for a period of time, and collecting eggs; (2) removing egg white to obtain egg yolk, diluting, adjusting the pH value to 5.2-5.6 by using caprylic acid, performing primary precipitation, centrifuging to obtain supernatant, adding 48-52% ammonium sulfate solution, performing secondary precipitation, centrifuging to remove supernatant, performing tertiary precipitation by adding 33-40% ammonium sulfate, centrifuging, removing supernatant to obtain white precipitate, namely the phaseolus vulgaris agglutinin egg yolk antibody crude product; (3) purification of phaseolus vulgaris agglutinin yolk antibody: collecting eluate of the obtained crude product of phaseolus vulgaris agglutinin yolk antibody by G100 molecular sieve and ion exchange column chromatography, dialyzing and concentrating to obtain the final product; the phaseolus vulgaris agglutinin yolk antibody can effectively recognize and combine phaseolus vulgaris agglutinin, and has excellent detoxifying effect on the phaseolus vulgaris agglutinin in animal experiments.)

一种菜豆凝集素卵黄抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其涉及一种菜豆凝集素卵黄抗体及其制备方法与应用。

背景技术

菜豆中毒的主要原因是由于菜豆凝集素对人体具有毒性，大约在在食用三十到六十分钟出现中毒症状，主要为恶心，呕吐和头晕。现在对于菜豆中毒解毒途径为食物中毒的通用方法，即催吐，洗胃及静脉补液，无特异性，并且病人感受度差。现在避免菜豆食用中毒的方法主要在烹调方法上，沸水中加热五分钟以上完全破坏凝集素，再进行烹饪是现在菜豆加工的金标准，但长时间的加热将菜豆中很多营养都遭到损失。现在避免菜豆凝集素中毒的方法为高温加热法，给烹饪菜豆带来很***烦，同时使菜豆的营养价值大打折扣。食用菜豆经常会有因为凝集素未被破坏而导致的中毒事件，市面上没有针对菜豆的高效特异性解毒剂，解毒方法为食物中毒通用方法。效率低，对机体产生一定不舒适性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种菜豆凝集素卵黄抗体及其制备方法与应用，所述的菜豆凝集素卵黄抗体可有效识别和结合菜豆凝集素，并在动物实验中体现有优良的对菜豆凝集素的解毒作用。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种菜豆凝集素卵黄抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1、菜豆凝集素卵黄抗体的制备：将菜豆凝集素经处理后作为免疫原来免疫产蛋母鸡一段时间后收集鸡蛋；

步骤2、菜豆凝集素卵黄抗体的粗提：去蛋清得蛋黄，稀释后用辛酸调pH至5.2～5.6进行第一次沉淀后离心取上清，加48％～52％硫酸铵溶液进行第二次沉淀后离心去除上清后，再加以33％～40％硫酸铵进行第三次沉淀，离心、去除上清后得到白色沉淀即为菜豆凝集素卵黄抗体粗品；

步骤3、菜豆凝集素卵黄抗体的纯化：将得到的菜豆凝集素卵黄抗体粗品过G100分子筛收集大分子物质，再经离子交换柱层析收集洗脱液，透析浓缩后即可得到精纯化后的菜豆凝集素卵黄抗体。

优选地，所述步骤1中免疫产蛋母鸡分3次，第一针(第1天)所用的免疫原为菜豆凝集素标准品与等体积的弗氏完全佐剂乳化所形成的乳状物进行背部皮下注射产蛋母鸡；第二针(第7天)和第三针(第21天)所用的免疫原为菜豆凝集素标准品与等体积的弗氏不完全佐剂所形成的乳状物。

优选地，所述步骤1中第一针免疫原注射后的45天开始收集鸡蛋。

优选地，所述步骤2中第一次沉淀、第二次沉淀、第三次沉淀时的温度均为4℃；所述离心的速率均为8000～10000r/min；所述离心的时间均为20～60min。

优选地，所述步骤3中过G100分子筛的具体步骤为：用Buffer I平衡层析柱，然后将菜豆凝集素卵黄抗体粗品用Buffer I溶液溶解后上所述层析柱，再用Buffer I洗脱，收集洗脱下来的大分子物质；所述Buffer I溶液为：20mmol/L Tris，20mmolNaCl。

优选地，所述步骤3中离子交换柱层析的具体步骤为：用3倍柱体积的Buffer I平衡离子交换柱，将过G100分子筛收集的大分子物质用Buffer I溶液溶解，上柱3次；然后NaCl梯度浓度洗脱液进行梯度洗脱分别收集洗脱液，再进行透析浓缩。

所述NaCl梯度浓度洗脱液中均含20mmol/L Tris，NaCl浓度分别从100～1000mmol/L。

本发明目的之二在于提供所述的方法制备得到的菜豆凝集素卵黄抗体。

本发明的目的之三在于提供所述的菜豆凝集素卵黄抗体在制备菜豆解毒剂上的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明提供的菜豆凝集素卵黄抗体的制备方法，将菜豆凝集素经处理后作为免疫原来免疫产蛋母鸡一段时间后收集鸡蛋，并进行粗提(通过辛酸，硫酸铵沉淀)和纯化(分子筛及离子交换层析后)得到纯度为95％以上的卵黄抗体。

2、本发明提供的菜豆凝集素卵黄抗体，(1)从免疫鸡的鸡蛋中提取，对比血清抗体，血清抗体来自血液中，含有多种不确定成分(包括病毒，细菌等)不适合口服，而卵黄抗体来自鸡蛋蛋黄由于胎盘屏障作用，细菌病毒不会进入蛋黄，而且鸡蛋作为日常食品，口服安全性高，因此蛋黄中提取的卵黄抗体适合口服。(2)卵黄抗体制备成本比血清抗体更低，按蛋鸡计算，一只蛋鸡加强免疫后，卵黄抗体可以维持一年，一只鸡蛋含400mg卵黄抗体，一只鸡一年可以产40-50克卵黄抗体，等于同期38只家兔的血清抗体产量。因此，卵黄抗体成本比血清抗体成本低很多。(3)卵黄抗体耐热，耐酸碱，耐胃蛋白质和胰蛋白酶，并且储存年限可以到10年，比血清抗体稳定，USDA及FDA已经批准用于人类。

3、本发明提供的菜豆凝集素卵黄抗体，可特异性识别和结合菜豆凝集素；可有效解除小鼠菜豆凝集素灌胃产生的，对小鼠肝脏和肾脏的损伤程度。

附图说明

图1为本发明实施例提供的菜豆凝集素卵黄抗体的制备方法中纯化后得到的菜豆凝集素卵黄抗体的SDS-PAGE图；

图2为菜豆凝集素卵黄抗体IgY与凝集素PHA同时加入时的效价测定结果；

图3为凝集素PHA先加入15min后再加菜豆凝集素卵黄抗体IgY时的效价测定结果；

图4为实验例2中小鼠灌胃试验中小鼠内脏外观变化图；其中(A)图小鼠剖开图；(B)图为内脏取出图；

图5为实验例2中小鼠灌胃试验中小鼠肝组织切片；

图6为实验例2中小鼠灌胃试验中小鼠肾组织切片。

具体实施方式

实施例1

一、卵黄抗体的制备

取菜豆凝集素标准品100ug，与等体积的弗氏佐剂乳化，背部皮下注射产蛋母鸡，第一针用弗氏完全佐剂，2，3针用弗氏不完全佐剂加强免疫，第一针免疫原注射后的25～30天开始收集鸡蛋。

取冻干后的大豆凝集素，用灭菌的生理盐水稀释到适当的浓度，加入等体积的弗氏完全佐剂FCA或者弗氏不完全佐剂FICA，然后用注射器双推法混匀佐剂与免疫抗原，使其充分混匀成油包水乳状物，

二、卵黄抗体的粗提

鸡蛋去蛋清，蛋黄按重量蒸馏水稀释9倍，辛酸调pH＝5.4，4℃过夜，9000r/min离心20min，上清以50％硫酸铵溶液4℃沉淀过夜，9000r/min离心30min，去除上清，再次以40％硫酸铵进行第二次沉淀，4℃过夜，9000r/min，离心30min，去除上清后得到白色沉为粗提的IgY。

三、卵黄抗体的精制备

G100分子筛：将IgY粗品用BufferI溶液溶解，Buffer I平衡层析柱，(Buffer1溶液为：20mmol/L Tris，20mmolNaCl，总体积为150ml)，样品上柱，Buffer I洗脱，收集不入凝胶的大分子部分。

离子交换柱层析：3倍柱体积的Buffer I平衡层析柱，(Buffer1溶液为：20mmol/LTris，20mmolNaCl，总体积为150ml)，将IgY粗品用BufferI溶液溶解，上柱3次。NaCl梯度浓度洗脱液对IgY进行洗脱，洗脱液中均含20mmol/LlTris，NaCl浓度分别从100-1000mmol/L，分别收集洗脱液，透析浓缩后即可得到精纯化后的IgY。经过辛酸，硫酸铵粗提取，分子筛，离子交换柱精提纯的IgY经SDS-PAGE变性电泳分析，出现65KD,25KD两条主带，与IgY性质相符，从图中可以看出，IgY纯度已经达到95％以上。

实施例2

该实施例中除卵黄抗体的粗提步骤不同外，其余均同实施例1，具体地：

一、卵黄抗体的制备，同实施例1

二、卵黄抗体的粗提

鸡蛋去蛋清，蛋黄按重量蒸馏水稀释9倍，辛酸调pH＝5.2，4℃过夜，8000r/min离心20min，上清以52％硫酸铵溶液4℃沉淀过夜，8000r/min离心30min.去除上清，再次以37％硫酸铵进行第二次沉淀，4℃过夜，8000r/min，离心30min，去除上清后得到白色沉为粗提的IgY。

三、卵黄抗体的精制备，同实施例1。得到纯度为94％的卵黄抗体。

实施例3

该实施例中除卵黄抗体的粗提步骤不同外，其余均同实施例1，具体地：

一、卵黄抗体的制备，同实施例1

二、卵黄抗体的粗提

鸡蛋去蛋清，蛋黄按重量蒸馏水稀释9倍，辛酸调pH＝5.6，4℃过夜，10000r/min离心20min，上清以48％硫酸铵溶液4℃沉淀过夜，10000r/min离心30min.去除上清，再次以33％硫酸铵进行第二次沉淀，4℃过夜，10000r/min，离心30min，去除上清后得到白色沉为粗提的IgY。

三、卵黄抗体的精制备，同实施例1。得到纯度为93％的卵黄抗体。

对比例1

该实施例中除卵黄抗体的粗提步骤中辛酸调pH改为5外，其余均同实施例1。得到纯度为82％的卵黄抗体。

对比例2

该实施例中除卵黄抗体的粗提步骤中辛酸调pH改为6外，其余均同实施例1。得到纯度为81％的卵黄抗体。

实验例1效价测定

实施例1制备得到的菜豆凝集素卵黄抗体IgY的效价测定。

图2为菜豆凝集素卵黄抗体IgY与凝集素PHA同时加入时的效价测定结果；14个孔中，上面一排1至7个孔IgY量均为25ug,1至7个孔PHA量分别为：12.5ug 6.25ug，3.13ug，1.56ug，0.78ug，0.37ug，0.19ug。下面一排1至7个孔IgG浓度均为25ug。1至7个孔PHA浓度分别为：1至7个孔PHA量分别为：12.5ug 6.25ug，3.13ug，1.56ug，0.78ug，0.37ug，0.19ug。

换算后可得到以下结果，1ug的PHA与血细胞孵育时同时加入抗体，需7.9ugIgY或32ugIgG可完全解除1ugPHA的凝血作用。从定量结果上来看，对于PHA刚和血细胞接触，尚未产生凝血作用的阶段，IGY解除PHA凝血能力强于IgG。

图3为凝集素PHA先加入血细胞发生凝聚反应(15min)后再加菜豆凝集素卵黄抗体IgY时的效价测定结果；14个孔中均加有1ug的PHA与血细胞发生凝聚反应后(反应15分钟)；14个孔中，上面一排1至7个孔IgY量均为25ug,1至7个孔PHA量分别为：12.5ug，6.25ug，3.13ug，1.56ug，0.78ug0.37ug，0.19ug。下面一排1至7个孔IgG量均为25ug。1至7个孔PHA浓度分别为：12.5ug，6.25ug，3.13ug，1.56ug，0.78ug，0.37ug，0.19ug。

换算后可得到以下结果，1ug的PHA与血细胞发生凝聚反应后(反应15分钟)，需要32ug IgY或67ugIgG可完全解除1ug PHA的凝血作用。从定量结果上来看，对于已经产生凝血效应的PHA与血细胞，IGY解除PHA凝血能力也强于IgG。

综上可知凝集素卵黄抗体体外可有效降低菜豆凝集素凝血效价，凝集素的凝血作用在加入凝集素抗体后，得到明显的降低。

实验例2小鼠灌胃保护实验

1、将实施例1制备得到的菜豆凝集素卵黄抗体IgY采用常规方法进行小鼠灌胃试验。分组：(1)灌胃PHA组；(2)灌胃生理盐水组；(3)先PHA，15min后IgY组；(4)先PHA，1h后IgY组。

2、观察小鼠内脏外观变化：如图4所示，肉眼所见小鼠内脏外观，PHA组与生理盐水组的肝脏有显著区别，PHA组肝颜色明显偏浅，PHA组肝脏发白，手触弹性不大，而抗体保护组(包括先PHA，15min后IgY组；以及先PHA，1h后IgY组)颜色与生理盐水组差不多。

3、病例切片结果如图5、图6所示：切片显示，PHA对小鼠肝和肾造成了明显的损伤，均出现胞浆中空化和细胞核变性变大的情况。而PHA灌胃后抗体保护组，其肝和肾明显收到了保护，肝和肾切片和生理盐水组无差异。

由图5可知，本发明制备得到的菜豆凝集素卵黄抗体可有效缓解PHA造成的小鼠肝损伤(肝细胞胞浆中空化)；由图6可知，本发明制备得到的菜豆凝集素卵黄抗体可有效缓解PHA造成的小鼠肾损伤(肾小管胞浆中空化)。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。