一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体及其应用
阅读说明：本技术 一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体及其应用 (Anti-procalcitonin high-affinity nano antibody and application thereof ) 是由 林景涛 宋海鹏 于建立 刘原源 于 2019-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体,所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3,本发明还提供了含有该纳米抗体可变区编码序列的表达载体,以及含有该表达载体的宿主细胞,本发明还提供了纳米抗体可变区与碱性磷酸酶的融合蛋白,所述纳米抗体在制备降钙素原检测试剂盒中的应用,应用所述纳米抗体进行降钙素原免疫检测的方法,以及相应的检测试剂盒。本发明提供的抗降钙素原纳米抗体对降钙素原具有特异的识别和结合能力,该纳米抗体亲和力可达到3.773E-9,具有独特的抗原决定簇识别位点,能够在降钙素原检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效果。(The invention discloses a high-affinity nano antibody for resisting procalcitonin, which has 3 unique complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3, an expression vector containing a variable region coding sequence of the nano antibody, a host cell containing the expression vector, a fusion protein of a variable region of the nano antibody and alkaline phosphatase, an application of the nano antibody in preparing a procalcitonin detection kit, a method for performing procalcitonin immunodetection by using the nano antibody and a corresponding detection kit. The anti-procalcitonin nano antibody provided by the invention has specific recognition and binding capacity to procalcitonin, the affinity of the nano antibody can reach 3.773E-9, the nano antibody has a unique antigenic determinant recognition site, and an excellent detection effect can be obtained in procalcitonin detection, particularly in a double-antibody sandwich method.)
技术领域
本发明公开了一种纳米抗体，属于多肽技术领域。
背景技术
降钙素原(PCT)是一种无激素活性的降钙素前肽物质，由降钙蛋白、降钙素、N端残基片段组成，相对分子量为13KDa。降钙素仅在甲状腺C细胞受到激素性刺激时才产生，而PCT可由很多器官的不同类型细胞在受到促炎症反应刺激特别是受到细菌引起的刺激后分泌。
PCT可作为一种能特异性区分细菌感染和其他原因导致的炎症反应的重要标志物，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，其在血浆中的水平升高。临床资料显示，PCT浓度大于0.1ng/ml时说明存在临床相关的细菌感染，需要采用抗生素进行治疗；当PCT浓度大于0.5ng/ml时，要考虑患者可能发展成重症败血症或败血症性休克的危险。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。而影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。检测病例中PCT浓度的变化，有利于判断机体细菌感染情况，评判机体健康状况，对临床和基础性研究均具有重要意义。
自上世纪80年代以后，免疫学检测技术随着单克隆抗体、人工合成多肽、基因工程表达抗原及各种标记技术的成熟而迅速发展，免疫比浊法、速率散射比浊法、胶乳增强透射比浊法与化学发光分析技术逐渐取代传统的免疫沉淀、免疫凝集物，使检测更为快捷。目前，检测PCT的方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量。常用的方法有如下几种：
1、放射免疫学分析法：该方法利用人工合成的多克隆抗体特异性地识别和连接合成氨基酸降钙素原。该方法能检测正常人的血清PCT，敏感度可达4pm/ml，检测的是游离PCT、结合型PCT和降钙素基因相关肽前体的混合物，而不能区别上述三种物质。且该方法检测耗时19-22h，并有放射性元素污染的风险。
2、胶体金比色法：该方法利用的是胶体金标记的抗PCT的单克隆抗体和用做包被的抗PCT多克隆抗体。当血清或者血浆加入标本孔，金标单克隆抗体与标本中的PCT结合，形成金标记的抗原抗体复合物。该复合物在反应膜上移动，与固定在膜上的抗PCT抗体结合形成更大的复合物。当PCT浓度超过0.5ng/ml，该复合物显示红色，红色的深浅与PCT的浓度成正比，与标准比色板比较即可得出PCT的浓度范围。然而此方法在颜色对比过程中容易产生较大的误差。
3、透射免疫浊度法：该方法的原理为样品中的PCT与试剂中的PCT单克隆抗体发生抗原抗体反应，使反应液浊度增加，并在一定范围内反应液浊度与所加抗原的量呈线性关系，使用生化分析仪或其他光学检测仪器在600nm波长处测定反应液吸光度值。所测吸光度值与所检测PCT浓度成正比。该方法虽然简便、快速，但免疫透射比浊的方法学及临床应用尚需进一步的验证。
4、双抗体夹心免疫化学发光法：该方法运用双单克隆抗体，其中一个抗体为降钙素抗体，另一个为抗钙素抗体，分别结合到PCT分子的降钙素和抗钙素部位，可排除交叉反应。其中一个抗体是光标记的，另一个未标记的抗体固定在反应容器的内壁，反应过程中两个抗体与PCT分子结合而形成三明治复合体，发光部位于反应容器的表面。该方法操作简便、特异性强、敏感度高，测定的底限值可达0.1ng/ml，且耗时2h。
基于PCT在临床诊断方面所表现出的突出特性，研发出针对PCT的特异性结合抗体，在保证灵敏度的同时增加检测范围成为现有技术的迫切需求。
1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。
纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值及发展前景。
鉴于PCT更多地过量表达于一些严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭等疾病中，因此研发抗PCT的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力，特别是识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇成为抗体技术领域的一种新的需求。但是鉴于纳米抗体分子量过低而存在的一些诸如亲和力低、易于集聚、血清半衰期短等结构和功能缺陷却阻碍着纳米抗体的进一步应用。在PCT的免疫检测具体应用中，如果抗PCT抗体识别PCT的抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应收到影响，从而严重影响检测效率。本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗PCT的纳米抗体，即，所述抗体具有独特的抗原决定簇识别位点，能够高度特异性地识别和结合抗原，能够在PCT抗原的免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效率。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗降钙素原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1区序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2区序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3区序列由SEQ IDNO.3所述氨基酸序列组成。所述抗体具有独特的抗原决定簇识别位点。
在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体6H6。
其次，本发明提供了上述纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由所述纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶串联而成。
第三，本发明还提供了一种编码上述纳米抗体的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的序列由SEQ ID NO.5所示。
第四，本发明提供了一种含有上述多核苷酸分子的表达载体，所述载体为pMES4。
第五，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
第六，本发明还提供了上述的纳米抗体在制备降钙素原检测试剂盒中的应用。
第七，本发明提供了一种基于非诊断目的的降钙素原检测方法，所述方法为双抗体夹心酶联免疫检测法，所述第一抗体的可变区序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9所示，所述第二抗体为酶联第二抗体，其可变区序列如SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列所示。
在一个优选的技术方案中，所述酶联第二抗体为抗降钙素原的纳米抗体与碱性磷酸酶的融合蛋白。
最后，本发明还提供了一种运用双抗体夹心法检测PCT的免疫试剂盒，所述试剂盒包括用于捕获抗原的第一抗体，以及用于与抗原结合引发酶联反应的第二抗体，其特征在于，所述第一抗体的可变区序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9所示，所述第二抗体为抗降钙素原的纳米抗体与碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白序列如SEQ ID NO.8所述的氨基酸序列所示。
本发明提供的抗PCT的纳米抗体6H6具有独特的抗原决定簇识别位点，对PCT抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体具有较高的抗原亲和力，所述亲和力可达到3.773E-9，且与几种抗PCT纳米抗体相比，识别不同的抗原决定簇，可与其它纳米抗体组合应用于双抗体夹心酶联免疫法检测降钙素原，在一个优选的实施方案中，纳米抗体6H6分别与BF5、2H4两株纳米抗体组合使用，显示出了优异的检测效果。
附图说明
图1.提取的总RNA电泳鉴定图；
图2.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图3.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图4.pMES4表达载体结构示意图；
图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；
图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；
图7.纳米抗体纯化SDS-PAGE图；
图8.Biacore分析纳米抗体结合位点流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1抗PCT纳米抗体的制备
1.1抗PCT纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
1.1.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只，将人重组PCT抗原与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/Kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
1.1.2驼源淋巴细胞的分离：按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。
1.1.3总RNA提取：按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL(见图1)。
1.1.4反转录合成cDNA：根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcriporfirst stand cDNA synthesis KIT)以1.1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。
1.1.5抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图2：M为Trans 2K DNA Marker；1为第一轮PCR产物)。第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图3：M为Marker；1为第二轮PCR产物)。
1.1.6载体构建：将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图4)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图5：M为Trans 2K Plus DNA Marker；1为pMES4载体双酶切后产物；2为pMES4载体未酶切质粒)。
1.1.7电转化及库容测定：取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选18个克隆，进行菌落PCR鉴定(图6：M为Marker；1-22为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
1.1.8噬菌体扩增：取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100
1.1.9纳米抗体筛选：通过ELISA方法以PCT抗原筛选阳性克隆。以PCT抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
1.1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化：挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗PCT的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行分析，登录IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_ vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。
纳米抗体6H6重链核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-25位氨基酸序列为CDR1，第26-42位氨基酸序列为FR2，第43-49位氨基酸序列为CDR2，第50-87位氨基酸序列为FR3，第88-95位氨基酸序列为CDR3，第96-106位氨基酸序列为FR4。
纳米抗体BF5可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
纳米抗体2H4可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例2.抗PCT纳米抗体6H6的制备
2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃，200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.2纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1：100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3h至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10min收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2min后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2min，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10min，收集约4.5mL的上清(周质提取物)。
2.3纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图7:M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体6H6)。
实施例3.抗PCT纳米抗体与抗原的亲和活性测定
3.1芯片抗原偶联
将PCT抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20μg/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。
3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μL/分钟。进样条件均为120秒，30μL/分钟。再生条件均为30秒，30μL/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/mL，150μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
3.3亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60s，30μL/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30μL/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200min。
3.4结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。抗PCT纳米抗体6H6的亲和力数值为3.773E-9。
表1：纳米抗体亲和力数据
样品编号
结合常数
解离常数
亲和力
VHH-6H6
8.468E+4
3.195E-4
3.773E-9
VHH-BF5
7.384E+4
3.177E-4
4.302E-9
VHH-2H4
2.736E+4
6.461E-4
2.361E-8
实施例4.抗PCT纳米抗体的ELISA叠加数据分析
4.1抗原饱和浓度的确定
以2μg/ml的浓度包被PCT抗原，100μl/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体，阴性对照(阴性血清1:100)，PBS空白对照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10min，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
4.2位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同4.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2*A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)*100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)—叠加2种抗体读数
表2：抗体抗原表位叠加实验
1st抗体
2nd抗体
1st抗体+2nd抗体
叠加率
6H6+2H4
0.218
0.597
0.706
70.40％
6H6+BF5
0.218
0.574
0.737
92.54％
2H4+BF5
0.204
0.634
0.693
79.08％
实验结果见表2，6H6与BF5、2H4两株纳米抗体分别针对PCT抗原不同的抗原表位，这预示着在PCT的检测应用上，该三株纳米抗体组成检测抗体对的几率大大增加，从而可以增大检测效率。
实施例5利用Biacore分析纳米抗体6H6结合位点
Biacore系统主要原理就是通过表面分子的浓度改变使SPR(折射率)发生偏移，在监测器上表现为RU值的变化。由于该系统的的灵敏度更高，我们设计了相关实验来验证ELISA叠加的实验结果。如图8所示，首先重复进2针第一个纳米抗体A，观察RU值的变化，以确认相应的抗原结合位点的饱和并记录；之后进入第二个纳米抗体B，观察并记录RU值：如该RU值比单一的纳米抗体B的RU值相差不超过20％，即可认为两者识别不同的抗原决定簇；如相差值超过20％但低于60％，认为两者有位阻效应；若相差值超过了60％，判定两者识别了同一抗原。具体操作为首先单纯进样抗体B记录RU增加值RB1，并对芯片再生；之后重复进两次抗体A，记录RU增加值RA，并确认饱和后，直接进样抗体B，观察RU值的增加量RB2；之后使用公式(RB2-RA)/RB1来计算位阻率，以此判定二者是否识别同一抗原决定簇。该实施例结果见表3。6H6纳米抗体与BF5、2H4纳米抗体的位阻率分别为6.00％和13.89％。依次判断6H6与其他两株纳米抗体均识别不同抗原位点，该结果与ELISA叠加实验推测的结果一致。更加验证了抗PCT纳米抗体6H6在PCT检测领域的应用前景。
表3：Biacore检测纳米抗体叠加实验RU值变化表
实施例5 6H6-HAP在检测标准血清中的PCT含量中的应用
以人碱性磷酸酶的结合位点序列作为化学发光区氨基酸序列，如SEQ ID NO:7所示。使之通过柔性多肽(GGGGS)3与6H6纳米抗体相融合成为带有化学发光区序列的纳米抗体6H6-HAP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。在所述核苷酸编码序列的两个末端添加有HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点，以该两个酶切位点连接到载体pcDNA3.1(+)上。无内毒素大提质粒后利用状态处于对数生长的293细胞进行转染。获得转染的细胞培养至36h后将细胞培养液倒入50ml离心管中，12000g离心5min，收集上清，用0.22um滤膜过滤，利用阴离子交换层析对培养上清进行纯化。利用实施例3相同的方法对6H6-HAP进行亲和力测试，结果6H6-HAP的亲和力数值为2.856E-9。经过筛选配对，结果见表4所示。选取FC融合纳米抗体BF5或2H4为捕获一抗，其可变区序列含有如SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.9所述的氨基酸序列所示，6H6-HAP为酶标二抗进行双抗体夹心免疫法检测38份临床阳性血清标本中的PCT抗原，获得了优异的检测效果，具体过程如下：
使用无菌CBS稀释捕获抗体至终浓度为10μg/ml；按照每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃静置18h；弃上清后，每孔加入300μL洗涤液，水平震动3min，吸弃上清；重复洗板四次。每孔加入200μl 1％BSA，于37℃静置1h。重复洗板四次；每孔中加入50μL阳性对照、阴性对照或者待测样本；随即每孔加入50μL新鲜稀释的酶标二抗(即纳米抗体6H6-HAP，稀释至工作浓度为2μg/ml)，置于摇床上摇动3～5s；37℃下温育1h。重复洗板四次；每孔加入100μLAP化学发光显色液(BM Chemiluminescence ELISA Substrate)，在摇床上摇动3～5s；室温避光孵育10min；选择酶标仪程序Luminescence，测定各孔的Lum值并计算质控血清的PCT值。结果6H6与BF5纳米抗体对呈现出最佳配对结果，R2＝0.9956。
表4纳米抗体6H6-HAP与BF5、2H4两株纳米抗体配对检测血清中
PCT含量曲线线性指数结果
捕获抗体
检测抗体
线性指数(R<sup>2</sup>)
灵敏度(ng/ml)
漏检数
BF5
6H6-HAP
0.9956
0.02
0
2H4
6H6-HAP
0.9904
0.05
3
序列表
<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司
<120> 一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体及其应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Arg Ser Ile Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 2
Val Thr Ser Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 3
Asn Phe Leu Pro Asn Arg His Gly
1 5
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ser Arg Ser Ile Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Val Val Thr Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
50 55 60
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Leu Pro Asn Arg His Gly Trp
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 5
<211> 318
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 5
gagtctgggg gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tggagcctcg 60
agaagtatct atgccatggg ctggtaccgc caggctccag ggaagcagcg cgagttggtc 120
gcagttgtta ctagtggtgg tgggacaagc tatgcagagt ccgtgaaggg ccgattcacc 180
atttccagag acaacgccaa gaacacggtg tatctgcaaa tgaacagctt gaaacctgag 240
gacacggccg tctattactg taatttctta ccgaaccgac acgggtgggg ccaggggacc 300
caggtcaccg tgtcctcc 318
<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 6
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Gly Thr Ile Ala Ser Val Tyr Ile Met Gly Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Val Val Ala Val Val Thr Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Leu Pro Asn Arg
85 90 95
His Gly Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 7
<211> 484
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala
1 5 10 15
Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala
20 25 30
Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr
35 40 45
Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly
50 55 60
Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser
65 70 75 80
Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu
100 105 110
Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125
Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly
130 135 140
Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr
145 150 155 160
Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala
165 170 175
Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser
180 185 190
Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe
195 200 205
Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly
210 215 220
Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys
225 230 235 240
Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala
245 250 255
Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly
260 265 270
Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg
290 295 300
Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His
305 310 315 320
Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp
325 330 335
Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser
340 345 350
Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro
355 360 365
Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val
385 390 395 400
Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser
405 410 415
Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His
420 425 430
Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu
435 440 445
Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe
450 455 460
Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala
465 470 475 480
Gly Thr Thr Asp
<210> 8
<211> 611
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Arg Ser Ile Tyr Ala Met Gly
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Val Val
35 40 45
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Leu Pro
85 90 95
Asn Arg His Gly Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
115 120 125
Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala
130 135 140
Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala
145 150 155 160
Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val
165 170 175
Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro
180 185 190
Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys
195 200 205
Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr
210 215 220
Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val
245 250 255
Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly Val
260 265 270
Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala
275 280 285
His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser
290 295 300
Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn
305 310 315 320
Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg
325 330 335
Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly
340 345 350
Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg
355 360 365
Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser
370 375 380
Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp
385 390 395 400
Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met
405 410 415
Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly
420 425 430
Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His Glu
435 440 445
Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala
450 455 460
Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu
465 470 475 480
Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu
485 490 495
Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg
500 505 510
Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu
515 520 525
Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro
530 535 540
Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His Ala
545 550 555 560
Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu Val
565 570 575
His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe Ala
580 585 590
Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly
595 600 605
Thr Thr Asp
610
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 9
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Thr Tyr Asp Met Ala Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ser Val Ala Val Ile Thr Thr
35 40 45
Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Thr Asn Thr Met Trp Leu Gln Met Asp Ser Leu
65 70 75 80
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Trp Cys Ala Gln Thr Lys Ala Gly
85 90 95
Arg Ala Thr Pro Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115