阅读说明：本技术 利用玉米皮水解产物制备苏氨酸发酵培养基的工艺 (Process for preparing threonine fermentation medium by using corn bran hydrolysate ) 是由 白红兵 董力青 王振义 韩杨 李航 于晶 于 2019-12-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于氨基酸发酵技术领域,公开了利用玉米皮水解产物制备苏氨酸发酵培养基的工艺,其包括如下步骤：步骤1)取发酵培养基原料,蔗糖,葡萄糖,玉米皮水解产物,硫酸铵,磷酸二氢钾,磷酸氢二钾,七水硫酸镁,七水硫酸亚铁,一水硫酸锰,V<Sub>B1</Sub>,V<Sub>H</Sub>；步骤2)将各原料搅拌均匀后,调节pH为6-7,灭菌,自然冷却,即得发酵培养基。本发明利用了玉米皮废弃作为原料进行水解,利用水解产物制备了苏氨酸发酵培养基,实现了废弃物的再利用,提高了工业附加值。(The invention belongs to the technical field of amino acid fermentation, and discloses a process for preparing a threonine fermentation medium by using a corn bran hydrolysate, which comprises the following steps: step 1) taking fermentation medium raw materials, sucrose, glucose, corn bran hydrolysate, ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate, ferrous sulfate heptahydrate, manganese sulfate monohydrate, and V B1 ，V H (ii) a And 2) uniformly stirring all the raw materials, adjusting the pH value to 6-7, sterilizing, and naturally cooling to obtain the fermentation medium. The invention utilizes the corn bran waste as the raw material to hydrolyze, and utilizes the hydrolysate to prepare the threonine fermentation medium, thereby realizing the reutilization of the waste and improving the industrial added value.)

利用玉米皮水解产物制备苏氨酸发酵培养基的工艺

技术领域

本发明属于氨基酸发酵技术领域，具体涉及利用玉米皮水解产物制备苏氨酸发酵培养基的工艺。

背景技术

苏氨酸的主要生产途径是微生物发酵，近年来，每年以20%的产量增幅递增，为提高饲料行业的产品品质，苏氨酸的添加量还会进一步增加。高品质的苏氨酸产品的主要市场也是医药行业，主要用于各种氨基酸输液。目前，全世界主要的苏氨酸生产企业为日本味之素公司、德国德固赛公司、美国ADM公司、日本协和发酵工业公司等，这几大公司的产量占全球份额的90%左右，产能达到10万吨左右，而国内苏氨酸生产处于发展阶段，截至2014年初，国内生产厂家有8至9家，苏氨酸大部分供应国内需求，而且部分公司有向国外出口氨基酸，苏氨酸的国内生产水平还是与国外存在一定差距，产品价格总体比国外价格略高；降低苏氨酸发酵成本是生产企业所需要解决的技术问题。

玉米（Corn )是禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物，其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。玉米原产于中美洲墨西哥和秘鲁，16世纪传入我国，至今有400余年的栽培历史。目前全国各地都有种植，尤以东北、华北和西南各省较多。东北地区普遍种植硬粒型玉米，华北地区多种植适于磨粉的马齿型玉米，品质次于硬粒型玉米。玉米含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素、纤维素等，具有开发高营养、 高生物学功能食品的巨大潜力。

玉米皮，是玉米深加工企业生产的一种副产品。即将玉米颗粒经过浸泡后进入淀粉生产过程，后经洗涤、挤水、烘干等工序加工而成。其主要成分是纤维、淀粉、蛋白质等。玉米表皮中蛋白质、淀粉含量较高，主要用于饲料行业；玉米皮中的玉米纤维（Corn Fiber)经过添加玉米浆后干燥而成的产品即为加浆纤维，蛋白含量可达16%(干基)以上，主要用于生产饲料。

近年来，为了提高玉米皮的应用价值，研究人员将玉米皮加工成膳食纤维，目前纤维素的水解主要是无机酸和酶水解。无机酸水解效率高、温度低、副产物较少，但是酸回收困难，设备腐蚀达、成本高、产物难分离以及环境污染严重等问题。酶解法条件温和，副产物少，是较为常用的方法。如文献“复合酶法提取玉米皮渣中水溶性膳食纤维的研究，马雪等2016年” ：以玉米皮渣为原料，酶解其不溶性膳食纤维，使其改性转化为水溶性膳食纤维，利用纤维素酶和半纤维素酶复合酶解玉米皮渣，采用单因素实验和正交实验方法，研究水不溶性膳食纤维改性制备高品质水溶性膳食纤维的制备工艺。申请人之前的专利技术“一种赖氨酸发酵培养基”，通过脱脂、淀粉酶和中性蛋白酶水解工艺对玉米皮进行了处理，得到了膳食纤维和玉米皮处理物，玉米皮处理物应用于赖氨酸发酵培养基中，一举两得；但是酶存在价格昂贵的问题，对规模化生产造成影响。

为了降低酶解法存在的酶成本昂贵的技术问题，研究人员尝试采用菌株对玉米皮进行降解，如文献“黑曲霉固态发酵及酶解玉米皮，胡慧东等2011年” 以玉米提取淀粉后的玉米皮渣为主要原料，采用黑曲霉固态发酵法产酶再酶解的二步法降解玉米皮中纤维素类物质。经Plackeu-Bunnan法及响应面设计优化发酵条件，中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维降解率分别为46.09％、48.82％，还原糖质量分数达到9.02％。该方法对纤维素的降解率仍然较低，得到的产品中纤维素含量较高，杂质较多，无法作为高价值产品来应用，工业使用价值并不大；可能原因是黑曲霉产生的纤维素酶的酶活和类型并不能完全降解纤维素。

发明内容

为了克服现有技术中对苏氨酸发酵培养基成本较高的技术问题，本发明提出了利用玉米皮水解产物制备苏氨酸发酵培养基的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

利用玉米皮水解产物制备苏氨酸发酵培养基的工艺，其包括如下步骤：

步骤1）取发酵培养基原料，蔗糖，葡萄糖，玉米皮水解产物，硫酸铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水硫酸镁，七水硫酸亚铁，一水硫酸锰，V_B1，V_H ；

步骤2）将各原料搅拌均匀后，调节pH为6-7，灭菌，自然冷却，即得发酵培养基。

进一步地，所述工艺包括如下步骤：

步骤1）取发酵培养基原料，按照以下浓度配制：蔗糖60g/L，葡萄糖10g/L，玉米皮水解产物300ml/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L；

步骤2）将各原料搅拌均匀后，调节pH为7，灭菌，自然冷却，即得发酵培养基。

进一步地，所述玉米皮水解产物按照如下工艺制备而得：

步骤1）玉米皮预处理：将玉米皮经水洗2遍，干燥，粉碎过50-100目筛，再采用无水***进行脱脂，得到预处理的玉米皮；

步骤2）超声辅助盐酸水解：将预处理的玉米皮添加到0.4-0.6M的稀盐酸中，添加量为1g：3-10ml，超声波处理，然后升温至80-90℃，静置2-5h，降温至55℃，再滴加氨水，控制在pH为6.5-7.0；

步骤3）微生物水解：按照2-5%的接种量接入耐热芽孢杆菌种子液，培养36-48h，然后按照2-5%的接种量接入热纤梭菌种子液，继续培养96h，高速碟片离心机离心，收集沉淀物和上层液体；

步骤4）水解菌体：将沉淀物按照1g：3-10ml的比例添加浓度为0.5-0.8M的盐酸溶液，在100℃下微波辅助水解，然后添加中性蛋白酶进行水解12-24h，水解完成后，用过滤网过滤去除不溶物，收集上清液；

步骤5）浓缩和蒸汽处理：将上层液体和上清液按照2-4:1的体积比混合，蒸发浓缩至三分之一，然后121℃蒸汽处理5-20min，自然冷却至室温，即得水解产物。

优选地，所述超声波处理的条件为：超声时间为6s，间隔时间为3s，超声总时间为180-270s，超声波频率为20-25kHz。

优选地，所述高速碟片离心机离心的条件为：以4000-5000rpm离心3-5min。

优选地，所述微波辅助水解的参数为：时间为1h，微波功率为440 W。

优选地，所述中性蛋白酶的水解参数为：水解时间为12-24h，水解温度为40℃，pH为7.5，加酶量为400U/ml。

优选地，所述过滤网的孔径为50-100目。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

玉米皮中蛋白质以特殊的立体结构组成蛋白质网，这种蛋白质网包裹着淀粉颗粒和纤维素组分，首先采用超声波辅助稀酸进行预水解，使得蛋白质变得疏松，降低结合紧密度，有利于后续的菌利用；

氨水与过剩的盐酸进行反应生产氯化铵，不但能够增加pH，以适应菌株生长，还能够为菌株提供一定的无机氮源；

首先接种耐热芽孢杆菌，能够在高温条件下，以淀粉为碳源，以氯化铵为氮源，产中性蛋白酶，水解蛋白质，释放出纤维素，而且高温条件有利于蛋白和纤维素的水解；待蛋白和纤维素完全脱离后，接种热纤梭菌接种，利用纤维素和水解蛋白质产生的氮源，来高产C1、Cx葡聚糖酶以及β-1,4糖苷酶，能够将纤维素和半纤维素水解成葡萄糖还原糖；

耐热芽孢杆菌和热纤梭菌可以相互共生，协同作用于玉米皮，实现了对玉米皮的彻底降解；

对玉米皮的微生物处理物进行物理破壁，微波辅助稀酸水解，过滤去除不溶物，得到含有多肽、氨基酸以及还原糖的水解产物，能够应用于苏氨酸发酵，降低了成本，并且提高了发酵效率。

附图说明

图1：不同菌株选择对NDF和ADF降解率的影响；

图2：菌株处理时间对还原糖含量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种玉米皮水解产物，其按照如下工艺制备而得：

将玉米皮经水洗2遍，干燥，粉碎过100目筛，再采用无水***进行脱脂，得到预处理的玉米皮。

将预处理的玉米皮添加到0.5M的稀盐酸中，添加量为1g：4ml，超声波处理，超声时间为6s，间隔时间为3s，超声总时间为180s，超声波频率为20kHz，然后升温至85℃，静置3h，降温至55℃，再滴加氨水，控制在pH为6.8；

按照5%的接种量接入耐热芽孢杆菌XJT9503种子液(密度为1×10⁹cfu/ml)，培养48h，然后按照5%的接种量接入热纤梭菌ATCC27405种子液（密度为1×10⁹cfu/ml），继续培养96h，高速碟片离心机以4000rpm离心5min，收集沉淀物和上层液体；

将沉淀物按照1g：5ml的比例添加浓度为0.6M的盐酸溶液，在100℃下微波辅助水解1h，微波功率为440 W，然后添加AS.1398中性蛋白酶进行水解12h，水解温度为40℃，pH为7.5，加酶量为400U/ml，水解完成后，以孔径为50目的过滤网过滤去除不溶物，收集上清液；

将上层液体和上清液按照2:1的体积比混合，蒸发浓缩至三分之一，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得水解产物。

实施例2

一种玉米皮水解产物，其按照如下工艺制备而得：

将玉米皮经水洗2遍，干燥，粉碎过80目筛，再采用无水***进行脱脂，得到预处理的玉米皮。

将预处理的玉米皮添加到0.5M的稀盐酸中，添加量为1g：5ml，超声波处理，超声时间为6s，间隔时间为3s，超声总时间为270s，超声波频率为25kHz，然后升温至85℃，静置5h，降温至55℃，再滴加氨水，控制在pH为7.0；

按照3%的接种量接入耐热芽孢杆菌XJT9503种子液(密度为3×10⁹cfu/ml)，培养48h，然后按照3%的接种量接入热纤梭菌ATCC27405种子液（密度为3×10⁹cfu/ml），继续培养96h，高速碟片离心机以5000rpm离心3min，收集沉淀物和上层液体；

将沉淀物按照1g：5ml的比例添加浓度为0.6M的盐酸溶液，在100℃下微波辅助水解1h，微波功率为440 W，然后添加AS.1398中性蛋白酶进行水解18h，水解温度为40℃，pH为7.5，加酶量为400U/ml，水解完成后，以孔径为50目的过滤网过滤去除不溶物，收集上清液；

将上层液体和上清液按照3:1的体积比混合，蒸发浓缩至三分之一，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得水解产物。

实施例3

1、菌株类型和配伍方式对玉米皮水解的影响。

检测方法：中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维的(ADF)的含量测定采用范式法；蛋白含量测定：凯氏定氮法。

设置对照组；

对照组1：仅采用耐热芽孢杆菌培养144h；

对照组2：仅采用热纤梭菌培养144h；

对照组3：二者同时接种培养144h；

对照组4：黑曲霉培养144h；

实验组：本发明实施例1。

如图1所示，对照组1仅采用耐热芽孢杆菌，纤维素降解率较低，主要原因为耐热芽孢杆菌产纤维素酶能力较弱，无法对纤维素进行有效降解；对照组2仅仅采用热纤梭菌，产蛋白酶能力较弱，无法将蛋白进行彻底降解而释放出纤维素，从而导致降解率下降，现有技术采用的黑曲霉也存在类似的问题；实验组首先接种耐热芽孢杆菌，能够在高温条件下，以淀粉为碳源，以氯化铵为氮源，产中性蛋白酶，水解蛋白质，释放出纤维素，而且高温条件有利于蛋白和纤维素的水解；待蛋白和纤维素完全脱离后，接种热纤梭菌接种，利用纤维素和水解蛋白质产生的氮源，来高产C1、Cx葡聚糖酶以及β-1,4糖苷酶，能够将纤维素和半纤维素水解成葡萄糖还原糖，处理液中还原糖的含量随着处理时间的增加而增加，如图2所示，总处理时间为144h时还原糖含量最高，继续增加时间，还原糖反而下降，主要原因是，可降解的纤维素组分降低，菌株需要消耗还原糖来维持自身的增殖。

2、预处理后的玉米皮主要组分含量见表1：

表1

组分	蛋白质	淀粉	总纤维素
				预处理后的玉米皮	10.6％	28.3％	57.9％

蒸发浓缩后的水解产物中主要组分的检测，具体见表2。

表2

组分	还原糖g/L	蛋白含量g/L
			实施例1	56.1	64.9

如表2所示，玉米皮水解产物中还原糖和可利用蛋白的含量较高，碳氮比例较为合适，通过微调即可应用于微生物发酵制备苏氨酸的培养基中。

实施例4

利用水解液制备培养基：

采用本发明水解产物来替代苏氨酸发酵培养基的部分组分：

通过计算水解产物中的还原糖和蛋白的含量，来替代培养基中的葡萄糖和酵母粉。

对照培养基：

蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，酵母粉20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L。

改良培养基：

蔗糖60g/L，葡萄糖10g/L，玉米皮水解产物300ml/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B12mg/L，V_H 50μg/L。

利用上述发酵培养基进行的发酵工艺为：

将大肠杆菌工程菌TRFC种子液按照2%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD₆₀₀为0.5，温度36℃，搅拌转速为300rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为40h，停止发酵，收集苏氨酸发酵液；发酵过程中：通过流加50%的蔗糖溶液控制含糖量为2-3%，直至发酵结束；

通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束。

通过检测发酵液中苏氨酸的产量发现，改良培养基的产酸率更高，达到125.8g/L，而对照培养基为116.2g/L，可见，本发明制备的水解产物对发酵更为有利，而且还能降低发酵成本。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。