阅读说明：本技术 一种n-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法 (Fermentation production method of N-acetylglucosamine ) 是由 卢健行 刘长峰 卢建智 张建华 吴祥舟 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法,将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌制得混合发酵剂接种至发酵培养基中恒温摇床培养；发酵过程采用恒速补料方式进行,控制葡萄糖补料速度为3-5g/L·h,用氨水控制发酵过程pH不小于6.9,当发酵液OD600nm大于30时,加入诱导剂IPTG、甲醇溶液和半胱氨酸溶液,培养时间为35-72h。本发明通过混合发酵剂提高大肠杆菌活性,并通过多种手段降低谷氨酸的累积速度,有利于实现产品高产量生产。(The invention discloses a fermentation production method of N-acetylglucosamine, which comprises the steps of preparing a mixed leavening agent from escherichia coli, bacillus subtilis and saccharomyces cerevisiae, inoculating the mixed leavening agent into a fermentation medium, and carrying out constant-temperature shaking table cultivation; the fermentation process is carried out by adopting a constant-speed feeding mode, the feeding speed of glucose is controlled to be 3-5 g/L.h, the pH value of the fermentation process is controlled to be not less than 6.9 by using ammonia water, when the OD600nm of the fermentation liquor is more than 30, an inducer IPTG, a methanol solution and a cysteine solution are added, and the culture time is 35-72 h. The invention improves the activity of the escherichia coli by mixing the leavening agent, reduces the accumulation speed of the glutamic acid by various means, and is beneficial to realizing the high-yield production of products.)

一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法。

背景技术

氨基葡萄糖(GleN)是一种重要的氨基己糖，它由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成，目前市面上氨基葡萄糖主要有两类，一是氨基葡萄糖盐酸盐，一类是氨基葡萄糖硫酸盐。氨基葡萄糖盐酸盐(D-Glucosamine Hydrochloride)，分子式C₆H₁₃NO₅·HCl，是一种白色结晶，无气味，略有甜味，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于乙醇等有机溶剂，它对人体具有重要的生理功能，参与肝肾解毒，发挥抗炎护肝作用，对治疗风湿性关节炎症和胃溃疡有良好的疗效，是合成抗生素和抗癌药物的主要原料；还可应用于食品、化妆品和饲料添加剂中。氨基葡萄糖盐酸盐是由天然的甲壳质提取的，是一种海洋生物制剂，是硫酸软骨素的主要成分。它能促进人体粘多糖的合成，提高关节滑液的粘性，能改善关节软骨的代谢，有利于关节软骨的修复，具有明显的消炎镇痛作用。它具有促进抗生素注射效能的作用，可供糖尿病者作营养补助剂。

N-乙酰氨基葡萄糖，为白色针状晶体，无气味，易溶于水，是一种重要的氨基葡萄糖衍生物，是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，是具有较高甜度的特殊单糖，具有还原性，亦是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有重要的生理功能，临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物，亦作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剂，糖尿病患者的甜味剂，在食品、医药、化工等领域广泛应用，具有广阔的市场前景。目前，国内关于N-乙酰氨基葡萄糖的获取方法主要有化学法和生物法两种，其中生物法是通过微生物发酵法合成N-乙酰氨基葡萄糖，其优点在于生产时间短，效率高。但是发酵法合成N-乙酰氨基葡萄糖存在积累的氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖会被细胞从胞外转入胞内作为碳源利用使得发酵液中无法大量积累N-乙酰氨基葡萄糖从而很难实现工业化生产。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，生产效率高，成本低，操作简单。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，其特殊之处在于：将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌进行种子活化后制得混合发酵剂；将混合发酵剂接种至发酵培养基中恒温摇床培养；发酵过程采用恒速补料方式进行，控制葡萄糖补料速度为3-5g/L·h，用氨水控制发酵过程pH不小于6.9，当发酵液OD600nm大于30时，加入诱导剂IPTG、甲醇溶液和半胱氨酸溶液，培养时间为35-72h。

作为优选方案，所述诱导剂IPTG、甲醇溶液和半胱氨酸溶液采用混合后流加的方式加入发酵体系中，可减缓谷氨酸的累积速度。

进一步的，发酵体系中，IPTG最终浓度为0.05-0.1mmol/L，半胱氨酸最终浓度为1-5g/L，甲醇最终浓度为1-5ml/L；IPTG作为诱导剂诱导大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的蛋白表达，甲醇溶液诱导酿酒酵母菌的表达，半胱氨酸的加入抑制谷氨酸的累积。

所述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌按照体积比(1-3):1:1的比例制得混合发酵剂。

所述发酵培养基包括：葡萄糖35g/L、酵母浸粉20g/L、丙氨酸10g/L、乳酸钠3g/L、磷酸氢二钾1.05g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸锌0.3g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乳糖3.2g/L、甘油5.5g/L。

所述大肠杆菌、酿酒酵母菌在进行种子活化前在平板培养基上活化培养6-8h。

所述平板培养基包括蛋白胨15g/L、酵母浸粉8g/L、半乳糖2g/L、氯化钠1g/L、硫酸铵1g/L、琼脂15g/L。

所述大肠杆菌、酿酒酵母菌的种子活化为将菌种接种在种子培养基中，控制培养温度37℃，摇床速度220-270rpm，培养时间为12-14h。

所述种子培养基包括蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉20g/L、半乳糖2g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、甘油5.5g/L。

控制发酵过程摇床转速230-250rpm，培养温度为36-38℃，压力0.03-0.05MPa，通气量0.6-1.2vvm，实现发酵体系的溶氧控制。

本发明的有益效果是：本发明通过混合发酵剂不仅提高了发酵活力，同时酿酒酵母菌在甲醇溶液诱导作用下作为发酵剂增加了N-乙酰氨基葡萄糖的产量，最终实现高效发酵生产氨基葡萄糖，半胱氨酸的加入可以降低发酵过程中谷氨酸的产生速度，提高N-乙酰氨基葡萄糖的合成速率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，本发明的保护范围包括但不限于以下实施例，在不偏离本申请的精神和范围的前提下任何对本发明的技术方案的细节和形式所做出的修改均落入本发明的保护范围内。

本发明所用原料均为市售普通原料。

以下实施例均按照下列培养基组成：

平板培养基包括：蛋白胨15g/L、酵母浸粉8g/L、半乳糖2g/L、氯化钠1g/L、硫酸铵1g/L、琼脂15g/L。

种子培养基包括：种子培养基包括蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉20g/L、半乳糖2g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、甘油5.5g/L。

发酵培养基包括：葡萄糖35g/L、酵母浸粉20g/L、丙氨酸10g/L、乳酸钠3g/L、磷酸氢二钾1.05g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸锌0.3g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乳糖3.2g/L、甘油5.5g/L。

实施例1

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌分别在平板培养基上活化培养7h，控制培养温度为37℃，控制摇床速度220rpm；将培养的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌按照体积比2:1:1混合后接种在种子培养基中活化培养12h；在5L发酵罐中培养3L发酵培养基，将活化后的混合发酵剂按照接种量12％(体积比)接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制温度37℃，摇床转速230-250rpm，压力0.05MPa，通气量0.6-1.2vvm，调节通气量和转速实现发酵体系的溶氧控制在40％左右，发酵过程控制葡萄糖的补料速度为3g/L·h，用25％氨水控制发酵液pH值不小于6.9，当发酵液OD600nm大于30％时，开始向发酵液中流加诱导剂IPTG、半胱氨酸水溶和0.5％甲醇溶液的混合液，控制IPTG在发酵液中最终浓度为0.1mmol/L，半胱氨酸最终浓度为1-5g/L，甲醇最终浓度为1-5ml/L，发酵培养48h，N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量为176g/L。

实施例2

将大肠杆菌、酿酒酵母菌分别在平板培养基上活化培养7h，控制培养温度为37℃，控制摇床速度220rpm；将培养的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌按照体积比2:1混合后接种在种子培养基中活化培养12h；在5L发酵罐中培养3L发酵培养基，将活化后的混合发酵剂按照接种量12％(体积比)接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制温度37℃，摇床转速230-250rpm，压力0.05MPa，通气量0.6-1.2vvm，调节通气量和转速实现发酵体系的溶氧控制在40％左右，发酵过程控制葡萄糖的补料速度为3g/L·h，用25％氨水控制发酵液pH值不小于6.9，当发酵液OD600nm大于30％时，开始向发酵液中流加诱导剂IPTG、半胱氨酸水溶和0.5％甲醇溶液的混合液，控制IPTG在发酵液中最终浓度为0.1mmol/L，半胱氨酸最终浓度为1-5g/L，甲醇最终浓度为1-5ml/L，发酵培养48h，N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量为159g/L。

实施例3

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别在平板培养基上活化培养7h，控制培养温度为37℃，控制摇床速度220rpm；将培养的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌按照体积比2:1混合后接种在种子培养基中活化培养12h；在5L发酵罐中培养3L发酵培养基，将活化后的混合发酵剂按照接种量12％(体积比)接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制温度37℃，摇床转速230-250rpm，压力0.05MPa，通气量0.6-1.2vvm，调节通气量和转速实现发酵体系的溶氧控制在40％左右，发酵过程控制葡萄糖的补料速度为3g/L·h，用25％氨水控制发酵液pH值不小于6.9，当发酵液OD600nm大于30％时，开始向发酵液中流加诱导剂IPTG、半胱氨酸水溶和0.5％甲醇溶液的混合液，控制IPTG在发酵液中最终浓度为0.1mmol/L，半胱氨酸最终浓度为1-5g/L，甲醇最终浓度为1-5ml/L，发酵培养48h，N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量为146g/L。

实施例4

本实施发酵制备过程同实施例1，其区别在于当发酵液OD600nm大于30％时，开始向发酵液中只流加诱导剂IPTG，所得N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量为121g/L。

实施例5

本实施发酵制备过程同实施例1，其区别在于当发酵液OD600nm大于30％时，开始向发酵液中流加诱导剂IPTG、半胱氨酸水溶，所得N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量为136g/L。

实施例6

本实施发酵制备过程同实施例1，其区别在于当发酵液OD600nm大于30％时，开始向发酵液中流加诱导剂IPTG、0.5％甲醇溶液，所得N-乙酰氨基葡萄糖发酵产量为132g/L。