阅读说明：本技术 一种合成依替巴肽硫醚的方法 (Method for synthesizing eptifibatide thioether ) 是由 黄�俊 姚志军 陈永汉 唐洋明 陶安进 袁建成 于 2018-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种依替巴肽硫醚化合物,其结构如式I所示。本发明还公开了依替巴肽硫醚的制备方法,其以固相合成方法制备,并以3-氯丙酸进行末端的合成,以1,4-二甲基哌嗪为碱,在溶剂中环化,形成硫醚键。本发明的依替巴肽硫醚化合物稳定性高,制备方法简单,具有较好的抗血小板凝聚的作用。(The invention relates to an eptifibatide compound, the structure of which is shown in formula I. The invention also discloses a preparation method of the eptifibatide thioether, which is prepared by a solid-phase synthesis method, the synthesis of the tail end is carried out by 3-chloropropionic acid, 1, 4-dimethylpiperazine is used as alkali, and cyclization is carried out in a solvent to form a thioether bond. The eptifibatide thioether compound has high stability, simple preparation method and better platelet aggregation resistance.)

一种合成依替巴肽硫醚的方法

技术领域

本发明属于多肽药物合成领域，具体涉及一种高纯度依替巴肽硫醚的合成方法。

背景技术

依替巴肽(Integrilin)是糖蛋白IIb/IIIa抑制剂类的抗血小板药物。依替巴肽是衍生自在东南侏儒响尾蛇(Sistrurus miliarius barbouri)的毒液中发现的蛋白质的环状七肽。它属于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-模拟物的类并可逆地结合到血小板。

依替巴肽具有以下结构：

依替巴肽在碱性环境等条件下会发生二硫键的打开，形成多聚体等其他杂质。由于依替巴肽的结构不稳定，对其药效的影响也较大，如何制备得到性质稳定，药效更好的化合物是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供了一种高收率、纯度高依替巴肽硫醚的合成方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明一个方面提供了一种依替巴肽硫醚化合物，其结构如式I所示，

本发明另一个方面提供了前述依替巴肽硫醚的制备方法，包括以下步骤：

1)选择合适的固相载体通过固相合成法依次连接Fmoc-Cys(Mmt)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Trp(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)–OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Har(Pbf)-OH，得到Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Pbf)-Pro-Cys(Mmt)-固相合成树脂；

2)在步骤1)所的的多肽-固相合成树脂上偶联3-氯丙酸，得到Cl-CH₂-CH₂-CONH-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Pbf)-Pro-Cys(Mmt)-固相合成树脂；

3)以脱除试剂脱除氨基酸的侧链保护基Mmt，得到Cl-CH₂-CH₂-CONH-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Pbf)-Pro-Cys-固相合成树脂；

4)采用1,4-二甲基哌嗪为碱，在溶剂中环化，形成硫醚键，得到依替巴肽硫醚肽树脂；

5)以裂解剂对依替巴肽硫醚肽树脂进行裂解同时脱除所有侧链保护基，得到的依替巴肽硫醚粗肽；

任选地，6)经过液相纯化、冻干得到依替巴肽硫醚。

上述的依替巴肽硫醚的固相合成工艺，其中，步骤1)中所述的固相载体为RinkAmide树脂、Rink Amide-AM树脂或Rink Amide-MBHA树脂，树脂替代度为0.1-0.8mmol/g，优选0.3～0.5mmol/g。

步骤1)所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，将树脂上的或者多肽-固相合成树脂上的Fmoc保护基脱除，然后以偶联剂偶联Fmoc保护的氨基酸，再次脱除Fmoc保护基并依次偶联Fmoc保护的氨基酸。

步骤1)中选用的偶联剂为DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP其中之一。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPEA:A:B＝10:6:5。

步骤2)中所使用的偶联剂为DIC，DIPEA，HOBt，HOAt，PyBOP，PyAOP中的一种或多种的组合。

步骤3)的脱除试剂为三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸浓度为0.8～1.5％，三异丙基硅烷浓度为2～4％。

步骤4)所述溶剂优选为DMF或DMA。反应时间为1-3小时。

步骤5)采用的裂解试剂为TFA(85％-95％)TIS(2.5％-7.5％)EDT(2.5％-7.5％)。所述的纯化为粗肽过反相高压液相纯化、冻干得到产品，纯度大于99.5％。

本发明另一个方面涉及一种前述依替巴肽硫醚抗血小板凝聚的用途。

本发明另一个方面涉及一种前述依替巴肽硫醚在制备抗血小板凝聚的药物中的用途。

本发明另一个方面涉及一种抗血小板凝聚的药物，其包含作为活性成分的前述依替巴肽硫醚。

本发明工艺具有纯度高，收率高的特点。适合大规模生产，具有可观的经济实用价值。

附图说明

图1为多聚体杂质稳定性。

图2为正离子模式的高分辨质谱图谱。

图3为负离子模式的高分辨质谱谱图。

具体实施方式

提供下述实例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法，均落在本发明的保护范围之内。

实施例1：依替巴肽硫醚肽树脂的制备

称取替代度为0.42mmol/g的Rink Amide树脂60g(25.2mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取50mmol Fmoc-Cys(Mmt)-OH和60mmol HOBT、50mmol PyBOP用DMF溶解，加入100mmol DIPEA活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取50mmol Fmoc-Pro-OH和60mmol HOBT、50mmol PyBOP用DMF溶解，加入100mmol DIPEA活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。

反应结束，按以上同样方法依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Har(Pbf)-OH。

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，茚三酮检测树脂有颜色。称取85mmol 3-氯丙酸用DCM溶解，冰水浴下加入50mmol DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2.5小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。

脱除保护基：用DCM洗涤树脂6次,将DCM：TFA：TIS＝96:1:3的脱保护液加入固相反应柱中，氮气鼓气反应10分钟后，抽掉，再加入脱保护液氮气鼓气反应10分钟，抽掉，再重复两次脱保护反应。

固相环化：脱Mmt保护基反应结束后，用DCM洗涤3次，DMF洗涤3次。称取100mmol1,4-二甲基哌嗪用适量DMF溶解加入固相反应柱中，室温反应2小时后，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。

反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥得到81.1g依替巴肽硫醚肽树脂，树脂增重31.2g，理论增重31.3g，增重率99.7％

实施例2：依替巴肽硫醚精肽的制备

将实施例1得到的依替巴肽硫醚肽树脂75克加入到2000ml三口瓶中，氮气保护。加入预先配制好的TFA：TIS：EDT＝95:2.5:2.5(V:V)850ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入7850ml冰***中沉淀、离心，***洗涤2次，减压干燥得到粗肽23.6克，HPLC纯度96.4％。经过高压液相制备纯化，冻干得到依替巴肽硫醚精肽22.6g，纯度99.6％，最大单杂0.07％。理论产量25.7g，总收率87.8％。

实施例3：依替巴肽硫醚肽树脂的制备

称取替代度为0.48mmol/g的Rink Amide树脂75g(36mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取50mmolFmoc-Cys(Mmt)-OH和60mmol HOBT、50mmol PyBOP用DMF溶解，加入100mmol DIPEA活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应1.5小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取50mmol Fmoc-Pro-OH和和60mmol HOBT、50mmol PyBOP用DMF溶解，加入100mmol DIPEA活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应1.5小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。

反应结束，按以上同样方法依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Har(Pbf)-OH。

反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂3次，DCM洗涤树脂3次，茚三酮检测树脂有颜色。称取80mmol 3-氯丙酸用DCM溶解，冰水浴下加入58mmol DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。

脱除Mmt保护基：用DCM洗涤树脂6次,将DCM：TFA：TIS＝95.5:1.5:3的脱保护液加入固相反应柱中，氮气鼓气反应10分钟后，抽掉，再加入脱保护液氮气反应10分钟，抽掉，再重复两次脱保护反应。

固相环化：脱Mmt保护基反应结束后，用DCM洗涤3次，DMF洗涤3次。称取100mmol1,4-二甲基哌嗪用适量DMF溶解加入固相反应柱中，室温反应2小时后，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。

反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥得到103.5g依替巴肽硫醚肽树脂，树脂增重44.4g,理论增重44.7g，增重率99.3％

实施例4：依替巴肽硫醚精肽的制备

将实施例3得到的依替巴肽硫醚肽树脂75克加入到2000ml三口瓶中，氮气保护。加入预先配制好的TFA：TIS：EDT＝95:2.5:2.5(V:V)850ml，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入7850ml冰***\中沉淀、离心，***洗涤2次，减压干燥得到粗肽23.4克，HPLC纯度95.6％。经过高压液相制备纯化，冻干得到依替巴肽硫醚精肽22.2g，纯度99.4％，最大单杂0.09％。理论产量25.7g，总收率86.4％。

将产物采用正离子模式的高分辨质谱进行测定，[M+H]⁺＝800.34923：见图2。

将产物采用负离子模式的高分辨质谱进行测定，[M-H]-＝798.33596：见图3。

实施例5：采用溴丙酸为原料的对比例

按照实施例1的方法，将3-氯丙酸改为3-溴丙酸进行固相偶联后，其余步骤完全相同。采用实施例2的方法裂解得到粗肽，粗肽纯度65.4％，明显低于实施例2。

实施例6：采用碱催化依替巴肽合成依替巴肽硫醚的方法对比

取依替巴肽5g，加入10mL pH8.0氨水50rpm搅拌30分钟后，加入20mL冰乙酸中和，冻干得到依替巴肽硫醚精肽3g，纯度为35.3％，明显低于实施例2和实施例4。

实施例7：依替巴肽硫醚与依替巴肽的稳定性对比

分别取依替巴肽硫醚、依替巴肽150mg，加入5.25mg/mL柠檬酸150mL溶解，用1M氢氧化钠调节pH至5.35，加水稀释至200mL。将两种溶液分别置于25℃、30℃恒温恒湿箱中保存，在1个月及2个月采用SEC进行多聚体杂质的检测。多聚体杂质的检测结果分别如下表及图1：

	依替巴肽溶液	依替巴肽硫醚溶液
			零天	0.03％	0.03％
25度1个月	0.15％	0.08％
			25度2个月	0.43％	0.10％
30度1个月	0.35％	0.10％
			30度2个月	0.72％	0.15％

实施例8：依替巴肽及依替巴肽硫醚中多聚体杂质的检测方法

采用TSK Gel G2000SWXL色谱柱，以乙腈-水-三氟乙酸＝40:60:0.1(v/v/v)作为流动相，柱温为30℃，检测波长为220nm，进样体积为5μL。

实施例9：依替巴肽硫醚与依替巴肽的体外活性对比

采用比浊法测定血小板聚集，观察依替巴肽及依替巴肽硫醚体外抗血小板聚集作用，结果表明依替巴肽体外抗犬血小板聚集的半数抑制浓度为136.7±72.6nmol·L，依替巴肽硫醚体外抗犬血小板聚集的半数抑制浓度为134.6±67.9nmol·L。从实验结果可以看出依替巴肽硫醚的效果优于依替巴肽。