阅读说明：本技术 一种特利加压素的二硫类似物及其制备方法 (Disulfide analogue of terlipressin and preparation method thereof ) 是由 孟祥明 朱良静 方葛敏 朱满洲 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种特利加压素的二硫类似物及其制备方法,通过使用二氨基二酸将多肽药物特利加压素二硫键替换成硫醚键,得到了一种还原环境下稳定的特利加压素二硫类似物。目标多肽采用Fmoc固相合成法制备。二硫苏糖醇还原稳定性实验表明本发明的特利加压素二硫类似物具有还原稳定性。(The invention discloses a terlipressin disulfide analogue and a preparation method thereof. The target polypeptide is prepared by adopting Fmoc solid phase synthesis. Experiments on reduction stability of dithiothreitol show that the terlipressin disulfide analogue has reduction stability.)

一种特利加压素的二硫类似物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种特利加压素的二硫类似物及其制备方法。

背景技术

食管静脉曲张是消化内科常见病，主要是由于食管静脉回流受阻引起的疾病。一旦产生食道静脉破裂，会导致出血，轻者导致失血性休克，严重者可危及生命。

特利加压素作为一种人工合成的12肽加压素类似物，能有效控制食管胃静脉曲张破裂出血，是仅有被证实能降低静脉曲张出血患者死亡率的药物。

特利加压素第4位和第9位之间的半胱氨酸残基之间通过二硫键成环。二硫键在稳定肽的三维结构上起着至关重要的作用。然而，二硫键在体内容易被硫醇和二硫异构酶还原，导致多肽结构重排和生物活性的丧失。因此，寻找一种结构类似的共价键替换二硫键是一种重要的策略对于提高二硫键环肽的代谢稳定性和保持其生物活性。

本发明针对特利加压素的二硫键在体内容易被硫醇和二硫异构酶还原的缺陷，旨在提供一种特利加压素的二硫类似物及其制备方法。

本发明利用Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH把特利加压素第9位半胱氨酸的S用CH₂替代，以便形成一种还原环境下稳定的二硫类似物。

所述二氨基二酸为Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH，其结构式如下：

本发明特利加压素的二硫类似物，具有如下结构：

本发明特利加压素的二硫类似物的制备方法，包括如下步骤：

称取Rink Amide-AM树脂转移到固相合成管中，DMF溶胀后采用Fmoc固相合成法依特利加压素二硫类似物肽序进行氨基酸的缩合连接，当特利加压素二硫类似物C端第8个氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH缩合完成之后，脱除树脂肽Alloc和Ally保护基团，Fmoc保护基团后分子内环化，依肽序采用Fmoc固相合成法继续缩合氨基酸；当固相合成结束后，外加切割试剂反应2小时，冰***沉淀纯化后得到特利加压素二硫类似物H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-Pro-Lys-Gly-NH₂(Cys4-Ala9，硫醚键)。

具体过程包括如下：

步骤1：Fmoc法固相合成特利加压素二硫类似物

1a：称量9.1mg替代度为0.33mmol/g的Rink Amide-AM树脂于固相合成管中，加入DMF溶胀15分钟后，加入20％哌啶的DMF溶液浸泡Rink Amide-AM树脂10分钟2次，D MF洗涤树脂；现配制DIC、Oxyma和特利加压素二硫类似物C端第一个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma:100uL DMF:4.5倍当量特利加压素二硫类似物C端第一个氨基酸Fmoc-Gly-OH)，加入树脂中55℃反应40分钟，DMF洗涤树脂；封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89，V％)浸泡树脂2分钟，DMF洗涤树脂，外加20％哌啶的DMF溶液浸泡树脂8分钟和6分钟；DMF洗涤树脂后加入现配制DIC、Oxyma和特利加压素二硫类似物C端第二个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma:100uL DMF:4.5倍当量特利加压素二硫类似物C端第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH)，加入树脂中55℃反应40分钟，DMF洗涤树脂；封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89,V％)浸泡树脂2分钟，DMF洗涤树脂，外加20％哌啶的DMF溶液浸泡树脂8分钟和6分钟；接下的氨基酸的缩合重复上面的操作。依次缩合的氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。对于特殊氨基酸的缩合，配制Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH(2.6mg,4.5umol)、Oxyma(0.85mg,6umol)、PyBOP(3.1mg,6umol)、NMM(2.1uL,18umol)和DMF(100uL)的混合液，加入树脂中常温过夜反应。当特利加压素C端第8个氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH缩合完成之后，DMF洗涤后加入Pd(PPh₃)₄(3.6mg,3.1umol)、N-甲基苯胺(9uL,83.2umol)和THF(200uL)的混合液，常温避光反应2小时；然后依次用DMF(3次)、DMF配制的0.5％NaS₂CN(C₂H₅)₂溶液(6次)、D CM(2次)、DMF(2次)洗涤树脂。外加20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，DMF洗涤树脂。加入PyAOP(7.82mg，15umol)、HOAT(2.1mg，15umol)、NMM(3.4uL，30umol)和DMF(150uL)混合液，常温反应4小时；DMF洗涤。依肽序继续Fmoc固相法缩合氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-OH。

1b：当特利加压素二硫类似物固相合成结束后，将树脂用大量DMF、DCM洗涤，自然干燥后，外加切割试剂(TFA：苯酚：水：TIPS＝88:5:5:2,V％)0.2mL-0.3mL处理2小时。收集切割试剂，加入15倍以上体积当量的冰***沉淀，离心粉末状粗肽；粗肽溶于水中，过滤，滤液经反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA；流速为3mL/min；检测波长为：210nm。以流动相B/％(5→5→32→80→90)，Time/min(0→5→15→40→50)的梯度收集所需要的流出液，样品峰合并后经真空冷冻干燥，获得特利加压素二硫类似物精肽H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-Pro-Lys-Gly-NH₂(Cys4-Ala9,硫醚键)。HPLC分析谱如图3，质谱如图4所示。[M+H]⁺:1207.67、[M+Na]⁺:1229.70、[M+K]⁺:1245.91特利加压素二硫类似物的理论分子量：1206.52，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。

本发明的特利加压素二硫类似物与现有的特利加压素相比，具有还原稳定性，并且在结构上只有一个原子的差别，避免了结构上的较大改变。

附图说明

图1是特利加压素和本发明特利加压素二硫类似物的结构对比示意图。

图2本发明的合成路线。

图3特利加压素二硫类似物的HPLC谱图。

图4特利加压素二硫类似物的质谱图。

图5是特利加压素还原稳定性测试HPLC跟踪图(a)和特利加压素二硫类似物还原稳定性测试HPLC跟踪图(b)。

具体实施方法以下结合实施例做进一步的说明：

本发明所使用的缩写的含义列于下表：

英文缩写	中文含义
		Fmoc	9-芴甲氧羰基
THF	四氢呋喃
		tBu	叔丁基
Boc	叔丁氧羰基
		Trt	三苯甲基
Alloc	烯丙氧羰基
		Allyl	烯丙基
DCM	二氯甲烷
		DMF	N,-N二甲基甲酰胺
TFA	三氟乙酸
		Pd(PPh<sub>3</sub>)<sub>4</sub>	四(三苯基膦)钯
DIC	N,N-二异丙基碳化二亚胺
		Oxyma	2-肟氰乙酸乙酯
NaS<sub>2</sub>CN(C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>)<sub>2</sub>	二乙基二硫代氨基甲酸钠
		PyBop	六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷
NMM	N-甲基***啉
		PyAop	六氟磷酸(7-氮杂苯并***-1-氧基)三吡咯烷磷
HOAT	N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
		TIPS	三异丙基硅烷
DTT	二硫苏糖醇
		NMM	N-甲基吗啉
Tris	三羟甲基氨基甲烷
		Fmoc-A<sub>2</sub>(Ally/Alloy)-OH	二氨基二酸
Triton X-100	聚乙二醇辛基苯基醚
		HPLC	高效液相色谱
MALDI-TOF	基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪

实施例1：Fmoc法固相合成特利加压素二硫类似物

1a：称量9.1mg替代度为0.33mmol/g的Rink Amide-AM树脂于固相合成管中，加入DMF溶胀15分钟后，加入20％哌啶的DMF溶液浸泡Rink Amide-AM树脂10分钟2次，D MF洗涤树脂；现配制DIC、Oxyma和特利加压素二硫类似物C端第一个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma:100uL DMF:4.5倍当量特利加压素二硫类似物C端第一个氨基酸Fmoc-Gly-OH)，加入树脂中55℃反应40分钟，DMF洗涤树脂；封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89,V％)浸泡树脂2分钟，DMF洗涤树脂，外加20％哌啶的DMF溶液浸泡树脂8分钟和6分钟。DMF洗涤树脂后加入现配制DIC、Oxyma和特利加压素二硫类似物C端第二个氨基酸的DMF混合液(4.5倍当量DIC:4.5倍当量Oxyma:100uL DMF:4.5倍当量特利加压素二硫类似物C端第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH)，加入树脂中55℃反应40分钟，DMF洗涤树脂；封闭试剂(醋酸酐：2,6-二甲基吡啶：DMF＝5:6:89,V％)浸泡树脂2分钟，DMF洗涤树脂，外加20％哌啶的DMF溶液浸泡树脂8分钟和6分钟。接下的氨基酸的缩合重复上面的操作。依次缩合的氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-A₂(Ally/Alloy)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。对于特殊氨基酸的缩合，配制Fmoc-A₂-OH(2.6mg,4.5umol)、Oxyma(0.85mg,6umol)、PyBOP(3.1mg,6umol)、NMM(2.1uL,18umol)和DMF(100uL)的混合液，加入树脂中常温过夜反应。当特利加压素C端第8个氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH缩合完成之后，DMF洗涤后加入Pd(PPh₃)₄(3.6mg,3.1umol)、N-甲基苯胺(9uL,83.2umol)和THF(200uL)的混合液，常温避光反应2小时；然后依次用DMF(3次)、DMF配制的0.5％NaS₂CN(C₂H₅)₂溶液(6次)、DCM(2次)、DMF(2次)洗涤树脂。外加20％哌啶的DMF溶液分别浸泡树脂8分钟和6分钟，DMF洗涤树脂。加入PyAOP(7.82mg，15umol)、HOAT(2.1mg，15umol)、NMM(3.4uL，30umol)和D MF(150uL)混合液，常温反应4小时；DMF洗涤。依肽序继续Fmoc固相法缩合氨基酸F moc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-OH。

1b：当特利加压素二硫类似物固相合成结束后，将树脂用大量DMF、DCM洗涤，自然干燥后，外加切割试剂(TFA：苯酚：水：TIPS＝88:5:5:2,V％)0.2mL-0.3mL处理2小时。收集切割试剂，加入15倍以上体积当量的冰***沉淀，离心粉末状粗肽。粗肽溶于水中，过滤，滤液经反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA；流速为3mL/min；检测波长为：210nm。以流动相B/％(5→5→32→80→90)，Time/min(0→5→15→40→50)的梯度收集所需要的流出液，样品峰合并后经真空冷冻干燥，获得特利加压素二硫类似物精肽H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-Pro-Lys-Gly-NH₂(Cys4-Ala9,硫醚键)。HPLC分析谱如图3，质谱如图4所示。[M+H]⁺:1207.67、[M+Na]⁺:1229.70、[M+K]⁺:1245.91特利加压素二硫类似物的理论分子量：1206.52，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。

实施例2：特利加压素和特利加压素二硫类似物还原稳定性比较测试

特利加压素和特利加压素二硫类似物各称取100ug，溶于100uL DTT的缓冲溶液(20m M Tris-HCl,PH＝7.4,150mM NaCl,1mM CaCl₂,1mM MgCl₂,0.1％Triton X-100,3mMDTT)。在25℃条件下，利用HPLC,MALDI-TOF在0，32，64分钟分别监测特利加压素和特利加压二硫类似物还原稳定性，(图5a，5b)。反应液与等体积的2％TFA水溶液混合淬灭反应进样。从图5中我们可以看出，在DTT的缓冲溶液中，特利加压素32分钟已被还原，而特利加压素二硫类似物基本保持稳定。说明本发明特利加压素二硫类似物在还原环境下比特利加压素稳定。