阅读说明：本技术 一种阿托西班的制备方法 (Preparation method of atosiban ) 是由 董华建 郭德文 文永均 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种阿托西班的制备方法,方法中采用了特殊的保护氨基酸片段：Mpr(R)-D-Tyr(Et),提高了规模化制备中产品的纯度和收率。(The invention provides a preparation method of atosiban, which adopts special protective amino acid segments: mpr (R) -D-Tyr (Et) improves the purity and yield of products in large-scale preparation.)

一种阿托西班的制备方法

技术领域

本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种阿托西班的制备方法。

背景技术

阿托西班(Atosiban)一种合成的肽类物质，可在受体水平对人催产素产生竞争性抑制作用。大鼠和豚鼠的动物试验结果显示本品与催产素受体结合后可降低子宫的收缩频率和张力，抑制子宫收缩。本品也与加压素受体结合抑制加压素的作用。

阿托西班具有以下的结构：

有关阿托西班的制备方法，目前国内现有技术的一般做法为Fmoc固相合成法，采用氨基树脂为开始的载体树脂，依次接入保护氨基酸，所得阿托西班碘氧化后裂解，获得阿托西班。但是，上述现有工艺在粗肽纯度方面以及总收率方面都存在不足。

此外，在本产品结构中有D-Tyr(Et)，由于Fmoc-D-Tyr(Et)在接肽过程中容易发生消旋反应，产生[Tyr(Et)²]-阿托西班杂质，该杂质与阿托西班自身的极性相近，通过纯化很难完全去掉，从而影响了产品质量。

发明内容

本发明提供一种阿托西班的制备方法，目的制备高纯度的阿托西班，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种阿托西班的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，固相合成阿托西班线性肽树脂，阿托西班线性肽树脂酸解后获得阿托西班线性肽，阿托西班线性肽采用醋酸溶液溶解，然后搅拌下滴加碘至完全环化，获得阿托西班粗品，阿托西班粗品纯化后获得纯品。

其中阿托西班多树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，同时使用了以下特殊保护氨基酸片段Mpr(R)-D-Tyr(Et)。

阿托西班树脂为：

Mpr(R)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-氨基树脂

上述阿托西班的制备方法中，所述的氨基树脂，其氨基取代值为0.3～1.5mmol/g树脂，优选的取代值为0.5～1.0mmol/g树脂。

上述阿托西班的制备方法中，所述氨基树脂为Rink MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的一种，优选为Rink Amide MBHA树脂。

上述阿托西班的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

作为本发明优选的方案，上述阿托西班树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基，得到阿托西班素线性肽粗品。

进一步地，所述阿托西班树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比列为80-95％(V/V)，EDT的比例为1～10％(V/V)，余量为水。优选的配比TFA为89-91％、EDT 4-6％、余量为水。最优的，配比为90％、EDT 5％、余量为水。

所述酸解剂用量为每克阿托西班树脂需要4～15ml酸解剂，优选的，每克阿托西班树脂需要9～11ml酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。

进一步的，阿托西班线性肽粗品用醋酸溶解，过滤后用氧化剂氧化环化，得到阿托西班粗品溶液。醋酸的体积百分比浓度为20～40％，优选为30％。氧化剂为碘、H₂O₂或DMSO，优选为碘。氧化剂采用滴定方式加入，到氧化终点时停止加入。

进一步的，阿托西班粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到阿托西班纯品，具体方法为：

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得阿托西班纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到阿托西班醋酸水溶液，冷冻干燥，得阿托西班纯品。

具体实施方式

本发明公开了一种合成阿托西班的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

表1 英文缩写释义

英文缩写	中文名称	英文缩写	中文名称
				Fmoc	9-芴甲氧羰基	Acm	乙酰氨甲基
tBu	叔丁基	Trt	三苯甲基
				Boc	叔丁氧羰基	Asn	门冬酰胺
Gly	甘氨酸	Thr	苏氨酸
				Orn	鸟氨酸	Ile	异亮氨酸
Pro	脯氨酸	D-Tyr(Et)	O-乙基-D-酪氨酸
				Cys	半胱氨酸	Mpr	巯基丙酸

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：阿托西班肽树脂的合成

阿托西班树脂为：

Mpr(R)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-氨基树脂

使用Rink Amide MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得阿托西班树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸或片段如下所示：

表2

接肽顺序n＝	保护氨基酸
		1	Fmoc-Gly-OH
2	Fmoc-Orn(Boc)
		3	Fmoc-Pro
4	Fmoc-Cys(Trt)
		5	Fmoc-Asn(Trt)
6	Fmoc-Thr(tBu)
		7	Fmoc-Ile
8	Mpr(R)-D-Tyr(Et)

1、接入第1个保护氨基酸

取0.15mol第1个保护氨基酸和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.05mol的Rink Amide MBHA树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。

2、接入第2～8个保护氨基酸或片段

采用上述同样方法，依次接入上述对应的第1～8个保护氨基酸或片段，得阿托西班肽树脂。

实施例2：阿托西班粗品的制备

取0.025mol实施例1制得的阿托西班线性肽树脂，加入体积百分比为85％的TFA、体积百分比为7.5％的EDT和体积百分比为7.5％的水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克阿托西班树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，35～45℃减压干燥得类白色粉。

所得类白色粉末用20％醋酸溶液溶解并制成约3mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至完全环化，35～40℃减压浓缩，得阿托西班粗品浓缩溶液，粗品纯度为87.6％。

实施例3：阿托西班粗品的制备

取0.025mol实施例1制得的阿托西班线性肽树脂，加入体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT和体积百分比为5％的水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克阿托西班树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，35～45℃减压干燥得类白色粉。

所得类白色粉末用30％醋酸溶液溶解并制成约3mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至完全环化，35～40℃减压浓缩，得阿托西班粗品浓缩溶液，粗品纯度为89.4％。

实施例4：阿托西班粗品纯化

取实施例3所得阿托西班粗品，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得阿托西班纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到阿托西班醋酸水溶液，冷冻干燥，得阿托西班纯品15.2g，纯度为99.7％，最大单一杂质为0.06％，总收率为61.1％，[Tyr(Et)²]-阿托西班未检出。分子量为994.2(100％M+H)。

实施例5：阿托西班粗品纯化

取实施例4所得阿托西班粗品，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得阿托西班纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到阿托西班醋酸水溶液，冷冻干燥，得阿托西班纯品15.9g，纯度为99.8％，最大单一杂质为0.04％，总收率为63.9％，[Tyr(Et)²]-阿托西班未检出。分子量为994.2(100％M+H)。

上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.5％，单一杂质均小于0.15％，提高了产品质量，具有广泛的实用价值和应用前景。