一种精氨加压素的纯化方法
阅读说明：本技术 一种精氨加压素的纯化方法 (Method for purifying argirelin ) 是由 李海贵 黄伟 钟南旦 周亚清 于 2021-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种精氨加压素的纯化方法,将粗品溶解于乙腈水溶液中,经氧化得环肽粗品,过滤；将滤液用一种反相填料,两步纯化,一种转盐方法即可得到高纯度、高质量、高稳定性的精氨加压素原料药。通过优化纯化方法,控制纯化过程中产品组分液的pH值,和优化转盐过程中的乙酸比例、降低有机试剂比例进行等度洗脱,即可将产品中易降解杂质的含量稳定在≤0.10％范围内。本发明的纯化方法操作简单易行,纯化轮数少,试剂使用成本低,提高了生产效率,又有效地解决了精氨加压素稳定性差、纯度低的问题。(The invention provides a purification method of argininol, which comprises the steps of dissolving a crude product in acetonitrile aqueous solution, oxidizing to obtain a cyclic peptide crude product, and filtering; purifying the filtrate with a reverse phase filler in two steps, and obtaining the high-purity, high-quality and high-stability argininol bulk drug by a salt conversion method. By optimizing the purification method, controlling the pH value of the product component liquid in the purification process, optimizing the acetic acid proportion in the salt conversion process and reducing the organic reagent proportion for isocratic elution, the content of easily degradable impurities in the product can be stabilized within the range of less than or equal to 0.10 percent. The purification method provided by the invention is simple and feasible to operate, has few purification rounds and low reagent use cost, improves the production efficiency, and effectively solves the problems of poor stability and low purity of the argininol.)
技术领域
本发明涉及多肽合成中的纯化技术领域，特别涉及一种精氨加压素的纯化方法。
背景技术
精氨加压素是由九个氨基酸组成的合成多肽，理论分子量为1084.24，是一种抗利尿激素。是中枢神经系统的一种重要的神经递质。是由下丘脑细胞分泌的这种物质，与机体的体液代谢、血容量、心血管功能、体温平衡、学习和记忆、促肾上腺皮质激素的分泌等功能密切相关。具有升高血压、抗利尿、参与记忆、限制发热和促进退热的作用。同时还拥有着广泛的心血管作用，如调节水钠潴留及血管收缩、直接调控心肌细胞，参与心肌肥大、心肌纤维化、心律失常等作用。已成功用于血管扩张性休克、心肺脑复苏、尿崩症及出血性疾病的治疗。抗利尿激素分泌不足会引起尿崩症，如果得不到及时治疗，容易引起头痛头晕、记忆力衰退的症状，严重的患者会出现水中毒，出现视力下降、昏迷甚至死亡，危害极大。因此，对精氨加压素纯化研究具有重要的意义。
专利“一种乙酸去氨加压素的纯化方法”，公告号：CN105131079B，使用一次纯化，纯度低，且转盐步骤中使用的有机试剂的比例较高，达到5％～18％，导致去杂效果欠佳；
专利“一种纯化乙酸特利加压素的方法”，公开号：CN102775475A，纯化效果差，不稳定。可知，现有技术中的精氨加压素的稳定性较差，纯度低，杂质含量多等缺点。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种精氨加压素的纯化方法，来解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
S1、制备环肽粗品溶液：取精氨加压素线性态粗品溶于5～10％(V/V)的乙腈水溶液中，所述精氨加压素线性态粗品和乙腈水溶液的质量体积比g/L为3～22:1.5～11，再使用碱性调节剂调节pH值为6.0～9.0，优选pH值为7.0～8.0，加入氧化剂氧化，用0.22μm有机微米膜过滤，滤液为环肽粗品溶液；
S2、第一步纯化：将环肽粗品溶液进行第一步纯化：
色谱柱直径和长度为：30*250mm、50*250mm、80*250mm中的一种。
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：质量分数为0.05～1.0％磷酸水溶液，优选0.5％(m/V)，调节pH为2.0～4.5，优选pH为2.5～4.0，
流动相B：有机试剂混合液或有机试剂，
流速：20～100mL/min，
梯度洗脱：10～50wt％的流动相B，优选30wt％，洗脱30～80min，优选60min，检测波长为220nm，分段收集目的峰值的肽溶液A；
S3、第二步纯化：将S2收集到的肽溶液A用纯化水稀释，进行第二步纯化：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：10～100mmol/L乙酸盐缓冲液，调节pH为4.0～6.0，
流动相B：有机试剂混合液或有机试剂，
流速：20～100mL/min，
梯度洗脱：15～60wt％流动相B，洗脱30～80min，优选60min，检测波长为220nm，分段收集肽溶液B，调节pH值为2.5～4.5，优选pH 3.0～4.0，得到高纯度肽溶液；
S4、乙酸转盐：将S3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：质量分数为0.1～1.0％的乙酸水溶液，优选0.5％(m/V)，
流动相B：乙酸-乙腈溶液，
流速：50～100mL/min，
等度洗脱：流动相B洗脱25～40min，优选30min，冻干，得到精氨加压素冻干纯品。
进一步的，所述S1中氧化剂选自双氧水、二甲基亚砜、单质碘以及金属离子氧化剂的一种或者几种，所述金属离子氧化剂为铁离子氧化剂、铜离子氧化剂或银离子氧化剂。
进一步的，所述S2、S3中流动相B的有机试剂混合液为有机试剂-水溶液或有机试剂-流动相A的混合液或有机试剂。
进一步的，所述有机试剂-水溶液中有机试剂与水溶液的体积比为50～100:0～50；所述有机试剂-流动相A的混合液中，有机试剂与流动相A的体积比为50～100:0～50。
进一步的，所述有机试剂为乙腈、甲醇、异丙醇、乙醇、四氢呋喃中的一种或多种混合，优选乙腈或甲醇中的一种或两种混合。
进一步的，所述S2、S3中梯度洗脱中流动相B的质量百分比为10～60％。
进一步的，所述S3中肽溶液A与水的体积比为1:1。
进一步的，所述S3中乙酸盐缓冲液为乙酸铵、乙酸钠、乙酸钾中的一种或者多种混合物。
进一步的，所述S4中的流动相B为体积比为0.5：99.5的乙酸和乙腈制得，等度洗脱为15wt％流动相B。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明仅需一种反相填料，两步纯化，一种转盐方法即可得到高纯度、高质量、高稳定性的精氨加压素原料药，纯化方法操作简单易行，一步纯化纯度可达98％，二步纯化即可获得纯度大于99.5％，单杂≤0.10％的高纯产品，试剂使用成本低，纯化轮数少，提高了生产效率，又有效地解决了精氨加压素稳定性差、纯度低、杂质含量多的问题。
(2)本发明通过优化纯化方法，控制纯化过程中产品组分液的pH值为2.5～4.5，以及优化转盐过程中的乙酸比例、降低有机试剂比例进行等度洗脱，即可将产品中易降解的杂质：Dimer、Ac-[1-9]、Trisulfide、Glu4、Gly9-OH等的含量稳定在≤0.10％范围内，最终可以获得稳定性好且纯度高的纯品。乙酸转盐方法优势在于，使用低比例的有机试剂等度洗脱，有效减少有机试剂的使用成本。
附图说明
图1是实施例3中精氨加压素环肽粗品的HPLC图；
图2是实施例3中精氨加压素第一步纯化后的产品HPLC图；
图3是实施例3中精氨加压素第二步纯化后的产品HPLC图；
图4是实施例3中精氨加压素产品的MS图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
S1、制备环肽粗品溶液：
取3克精氨加压素线性肽粗品溶于1.5L的5％(V/V)乙腈水溶液中，用氢氧化钠调节线性肽粗品的pH至7.0，用0.3％(V/V)双氧水进行氧化，待氧化完成后用0.22微米膜过滤，收集过滤后的粗品溶液备用；
S2、第一步纯化：
色谱柱：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，色谱柱直径和长度为：30*250mm。
流动相A：质量分数为0.5％磷酸水溶液，用氢氧化钠调pH值为4.0，
流动相B：体积比为80％：20％的乙腈-流动相A溶液，
流速：20mL/min，波长：220nm，上样量3克，
梯度洗脱：10wt％流动相B，洗脱60min，分段收集该梯度段目的峰值肽溶液A，得到纯度大于98％的目的峰值溶液，第一步纯化收率大于85％。
S3、第二步纯化：
将第一步纯化收集的肽溶液A用纯化水按体积1:1比例稀释，进行第二步纯化：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料
流动相A：80mmol/L乙酸铵(用磷酸调pH至6.0)，
流动相B：体积比为80％：20％的乙腈水溶液，
流速：20mL/min，波长：220nm。
梯度洗脱：15wt％流动相B，洗脱60min。
分段收集该梯度段目的峰值的肽溶液B，用磷酸调节pH至3.0～4.0，得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的目的峰值肽溶液，第二步纯化收率大于85％，两步纯化收率大于72％。
S4、乙酸转盐：
将S3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：质量分数0.5％的乙酸水溶液，
流动相B：质量分数0.5％的乙酸-乙腈溶液，
流速：20mL/min，波长：220nm。
洗脱：15wt％的流动相B等度洗脱30min，即可得到转盐后的肽溶液。
将转盐后的肽溶液放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的高纯度、高稳定性的精氨加压素冻干粉，纯化总收率为78％。
实施例2
一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
S1、制备环肽粗品溶液：
取8克精氨加压素线性肽粗品溶于4L的10％(V/V)的乙腈水溶液中，用氢氧化钠调节线性肽粗品的pH至7.0，用0.3％(V/V)双氧水进行氧化，待氧化完成后用0.22微米膜过滤，收集过滤后的粗品溶液备用。
S2、第一步纯化：
色谱柱：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，色谱柱直径和长度为：50*250mm。
流动相A：质量分数0.5％磷酸水溶液，用氢氧化钠调pH值为4.0，
流动相B：体积比为80％：20％的乙腈-流动相A溶液，
流速：50mL/min，波长：220nm，上样量8克，
梯度洗脱：50wt％流动相B，洗脱60min，分段收集该梯度段目的峰值肽溶液A，得到纯度大于98％的目的峰值溶液，第一步纯化收率大于85％。
S3、第二步纯化：
将第一步纯化收集的肽溶液A用纯化水按体积1:1比例稀释，进行第二步纯化：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料
流动相A：80mmol/L乙酸铵(用磷酸调pH至6.0)，
流动相B：体积比为80％：20％的乙腈水溶液。
流速：50mL/min，波长：220nm。
梯度洗脱：60wt％流动相B，洗脱60min。
分段收集该梯度段目的峰值肽溶液B，用磷酸调pH至3.0～4.0，得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的目的峰值肽溶液，第二步纯化收率大于85％。两步纯化收率大于72％。
S4、乙酸转盐：
将S3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：0.5％(m/V)的乙酸水溶液，
流动相B：质量分数0.5％乙酸-乙腈溶液，
流速：50mL/min，波长：220nm。
洗脱：15wt％流动相B等度洗脱30min，即可得到转盐后的肽溶液。
将转盐后的肽溶液放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的高纯度、高稳定性的精氨加压素冻干粉，纯化总收率为75％。
实施例3
一种精氨加压素的纯化方法，包括以下步骤：
S1、制备环肽粗品溶液：
取22克精氨加压素线性肽粗品溶于11L的7％(V/V)的乙腈水溶液中，用氢氧化钠调节线性肽粗品的pH至7.0，用0.3％(V/V)双氧水进行氧化，待氧化完成后用0.22微米膜过滤，收集过滤后的粗品溶液备用。精氨加压素环肽粗品的色谱图参照图1，纯度为75.2％
S2、第一步纯化：
色谱柱：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，色谱柱直径和长度为：80*250mm。
流动相A：质量分数0.5％磷酸水溶液，用氢氧化钠调pH值为4.0，
流动相B：体积比为80％：20％的乙腈-流动相A溶液，
流速：100mL/min，波长：220nm，上样量22克，
梯度洗脱：30wt％的流动相B，洗脱60min，分段收集该梯度段目的峰值肽溶液A，得到纯度大于98％的目的峰值溶液，作为第二步纯化的肽溶液，第一步纯化收率大于85％。第一步纯化后的产品的色谱图参照图2，纯度为98.5％。
S3、第二步纯化：
将第一步纯化收集的肽溶液A用纯化水按体积1:1比例稀释，进行第二步纯化：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：80mmol/L乙酸铵(用磷酸调pH至6.0)，
流动相B：体积比为80％：20％的乙腈水溶液，
流速：100mL/min，波长：220nm。
梯度洗脱：40wt％流动相B，洗脱60min。
分段收集该梯度段目的峰值的肽溶液B，用磷酸调节目pH至3.0～4.0，得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的目的峰值肽溶液，第二步纯化收率大于80％。两步纯化收率大于68％。第二步纯化后的产品的色谱图参照图3，纯度为99.8，单杂≤0.04％。
S4、乙酸转盐：
将S3得到的高纯度肽溶液采用乙酸方法进行转盐：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料，
流动相A：质量分数0.5％乙酸水溶液，
流动相B：质量分数0.5％乙酸-乙腈溶液。
流速：100mL/min，波长：220nm。
洗脱：15wt％流动相B等度洗脱30min，即可得到转盐后的肽溶液。
将转盐后的肽溶液放进冻干盘，进行冷冻干燥，即可得到纯度≥99.5％，单杂≤0.10％的高纯度、高稳定性的精氨加压素冻干粉，纯化总收率为72％。最终冻干产品的MS图参照图4。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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