阅读说明：本技术 一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法 (Rapid propagation method for stem segments of flower stalks of phalaenopsis ) 是由 吴勇 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法,包括如下步骤：(1)培养基的配制；(2)外植体的制备；(3)接种；(4)接种后管理。本发明提供了一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法,不仅有效的防止了愈伤组织褐化变质,还大大的降低了蝴蝶兰组织培养的染菌率,提高了愈伤组织分裂、分化、增殖的能力,进而提高了蝴蝶兰组织培养的繁殖率,极具市场推广价值。(The invention discloses a method for rapidly propagating stems of phalaenopsis amabilis, which comprises the following steps: (1) preparing a culture medium; (2) preparing an explant; (3) inoculating; (4) and (5) managing after inoculation. The invention provides a rapid propagation method for stem segments of butterfly orchid stalks, which not only effectively prevents browning and deterioration of callus, but also greatly reduces the strain contamination rate of butterfly orchid tissue culture, improves the capability of division, differentiation and proliferation of the callus, further improves the propagation rate of butterfly orchid tissue culture, and has great market popularization value.)

一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法

技术领域

本发明属于花卉种植技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法。

背景技术

蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）又称蝶兰，属热带气生兰，多年生草本植物。蝴蝶兰属是著名的切花种类，是国际上最具商业价值的四大观赏热带兰之一。蝴蝶兰有“洋兰皇后”的美称，随着国内市场需求量的增加，蝴蝶兰生产前景将越来越好，具有极高的经济价值。由于蝴蝶兰属于单轴性气生兰，种子细小，胚及胚乳等发育不完全，不适合用传统方法进行播种。利用组织培养进行蝴蝶兰种苗大量繁殖是一个快速、便捷、不受时间约束的有效途径。虽然现今对蝴蝶兰组织培养的研究有很多，但是蝴蝶兰在组织培养中仍然有很多问题没有得到好的改善，在组织培养过程中，外植体容易褐化变质随后死亡，并且防止外植体诱导过程中染菌也是一个比较常见的问题，为了克服蝴蝶兰组织培养中存在的问题，本申请主要从组培的培养基，外植体制备以及接种后管理几方面着手，提高蝴蝶兰组织培养的繁殖率，提升组培苗的品质。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，不仅有效的防止了愈伤组织褐化变质，还大大的降低了蝴蝶兰组织培养的染菌率，提高了愈伤组织***、分化、增殖的能力，进而提高了蝴蝶兰组织培养的繁殖率，极具市场推广价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，包括如下步骤：

（1）培养基的配制：

a. 先称取相应重量份的冬瓜皮13.5~14.5份、西瓜皮8.5~9.5份、苋菜梗5.5~6.5份、黄瓜皮11~12份，南瓜藤13~14份共同置于木筛子上，然后在木筛子下面进行蒸汽熏蒸，熏蒸32~38min后，取出混合原料备用；

b. 将操作a中熏蒸处理后的混合原料置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎处理24~28min后，过50~70目筛备用；

c. 先将操作b中过筛后的粉末和无菌水按照重量体积比为1g:4.2~4.8mL共同投入微射流高压均质机内，然后进行均质处理，均质处理11~13min后，用3~5层纱布进行过滤，得滤液和滤饼备用；

d. 称取相应重量份的操作c所得滤液210~290份、柠檬酸2.2~2.8份、微量元素1.2~1.8份、6-苄基氨基嘌呤0.65~0.75份、萘乙酸0.32~0.38份、粉末添加剂3.2~3.8份、琼脂粉7.5~8.5份、纯化水510~590份备用；

e. 先将操作d中所称取的所有原料共同投入搅拌罐内，以42~48℃/min的速度将搅拌罐内的温度升至98~100℃，在升温的过程中以620~680rpm的转速进行搅拌直至原料中的琼脂粉完全融化，然后停止搅拌，将搅拌罐内的温度升至122~128℃，压力升至3.2~3.8MPa，维温维压21~23min，再降温降压，待压力降至常压，温度降至72~78℃时，取出产物趁热分装即得培养基备用；

（2）外植体的制备：

a. 先选取花朵凋谢，花期已过，生长健壮的蝴蝶兰花梗，然后将选取的花梗切成4~6cm的茎段；

b. 先将操作a中所得的蝴蝶兰花梗茎段投入杀菌液中进行浸泡，在浸泡的同时进行搅拌，浸泡处理15~19min后，用无菌水冲洗蝴蝶兰花梗茎段直至将表面的杀菌液冲洗干净，然后用无菌吸水纸将所得花梗茎段表面的无菌水吸干备用；

c. 将操作b中所得的无菌茎段的两端以及表面切除，然后将剩余的茎段部分切成0.7~1cm的小段即得外植体备用；

（3）接种：

将步骤（2）中所得的外植体接种到步骤（1）所得的培养基中，接种量每50mL培养基中接种4~6个外植体；

（4）接种后管理：

将步骤（3）中接种后的培养基置于光照培养箱中进行培养，培养过程中保持培养箱中的空气相对湿度为50~60%，温度为25~27℃，期间利用可调节光谱的LED光源控制光照条件。

进一步的，所述步骤（1）操作a中的冬瓜皮、西瓜皮、苋菜梗、黄瓜皮，南瓜藤均是新鲜采摘的。

进一步的，所述步骤（1）操作a中蒸汽的制备方法是：先称取相应重量份的小杭菊5.5~6.5份、金银花2.2~2.8份、金丝桃5.2~5.8份、艾草2.2~2.8份、雷公藤1.2~1.8份投入320~380份去离子水中，大火煮至沸腾，然后改用中火进行加热，边加热边缓慢匀速滴加无水乙醇，采用32~38min后冒出的蒸汽作为步骤（1）操作a中熏蒸处理的蒸汽，其中无水乙醇的滴加量为去离子水的10~20%。

进一步的，所述步骤（1）操作b中粉碎处理时粉碎机内的温度控制为-30~-20℃，粉碎机的转速为1250~1350rpm。

进一步的，所述步骤（1）操作c中均质处理时，微射流高压均质机的工作压力为145~155MPa。

进一步的，所述步骤（1）操作d中微量元素中各成分及对应重量份为：硼酸0.0022~0.0028份、硫酸锰0.00012~0.00018份、硫酸锌0.0032~0.0038份、钼酸钠0.00022~0.00028份、硫酸铜0.000012~0.000018份、氯化钴0.000023~0.000025份。

进一步的，所述步骤（1）操作d中粉末添加剂的制备方法是将步骤（3）中所得的滤饼和活性炭按照重量比为4.2~4.8:1.2~1.8共同投入珠磨机中，向珠磨机中加入液氮，以420~480rpm的转速进行研磨，研磨11~13min后，取出混合粉末过80目筛即可。

进一步的，所述步骤（2）操作b中杀菌液中各成分及对应重量份为：富里酸3~5份、75%乙醇45~55份、次氯酸钠1~2份。

进一步的，所述步骤（2）和步骤（3）的整个操作都在超净工作台中进行。

进一步的，所述步骤（4）中光照条件的控制具体为：接种后的8d内采用黑暗条件培养，8d后每天光照培养16~18h，黑暗培养6~8h，其中光照培养采用红蓝光比为1:2~3进行，光照强度为1300~1500Lux。

本发明综合考虑蝴蝶兰快速繁殖过程中存在的问题，提供了一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，主要是为了防止外植体褐化，降低染菌率，提高蝴蝶兰的繁殖率。在培养基的配制中，首先将新鲜的冬瓜皮、西瓜皮等进行蒸汽熏蒸，蒸汽中含有大量的挥发性醇类等有机物质，不仅能够促进原料细胞的膨胀，热蒸汽还能充分杀死原料中存在的虫卵和各种菌类，另外，热蒸汽能够促使原料中的部分营养成分分解，转化为更有利于外植体吸收的存在形式。紧接着在冷冻条件下进行粉碎，快速有效的将原料粉碎，为后续操作奠定基础，并且冷冻条件还能进一步杀死原料中可能遗留的病原菌和虫卵，进一步保障了培养基的品质。然后将所得粉末与无菌水一起进行微射流高压均质处理，通过在振荡反应腔中对物料进行高速碰撞，高频振荡、瞬时压降和强烈剪切、气穴作用等作用，从而实现对物料细胞的破碎，促进细胞内容物的流出，并且在微射流高压的条件下，多糖分子链断裂，发何时能降解，单糖的组成、粒度和分子聚集状态也随之发生改变，转化成更易于被外植体消化吸收的结构，所得的滤液可以为蝴蝶兰外植体细胞的***、分化、增殖提供充分的营养成分。将均质处理所得的滤液同其他原料成分共同投入搅拌罐内进行搅拌混匀，并通过高温高压条件的控制，起到杀菌的作用。在原料中除了添加均质处理所得的滤液，还添加有柠檬酸、微量元素、6-苄基氨基嘌呤、萘乙酸、粉末添加剂等，微量元素的添加主要是为了弥补滤液中微量元素含量不足的问题，6-苄基氨基嘌呤、萘乙酸作为植物生长调节剂，能够起到辅助作用，加快细胞的***、分化，粉末添加剂主要是以均质后的滤饼为基材，然后将其与活性炭共同进行珠磨处理，活性炭吸附进入滤饼的纤维孔隙中，将其与柠檬酸共同添加到原料中，可以有效的防止外植体氧化褐变，并且在组织培养的过程中，能够起到吸收外植体的代谢产物，防止代谢产物对外植体、以及愈伤组织，分化苗等的毒害作用，进一步提升了培养基的品质。在外植体的制备中，选取蝴蝶兰的花梗茎段作为外植体材料，蝴蝶兰花梗茎段取材方便，原料丰富，细胞分化能力强，可以作为蝴蝶兰快速繁殖的首选材料，茎段经过杀菌剂的杀菌处理后，表面组织会有所损害，切除表面以及两端，露出无菌的生命力旺盛的茎段部分，在将其切成合适大小的小段，太小容易死亡，太大会导致无法充分吸收营养，然后接种到制备的培养基中，接种后8d内采用黑暗条件培养，能有效的减轻外植体的褐化，加上培养基中柠檬酸和粉末添加剂的协同作用，一定程度的抑制了分泌物的浸出，缓和了褐化的现象，然后利用可调节光谱的LED光源控制光照条件，增强外植体中多种酶的活性，加快细胞呼吸速度，促进愈伤组织的形成。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明提供了一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，不仅有效的防止了愈伤组织褐化变质，还大大的降低了蝴蝶兰组织培养的染菌率，提高了愈伤组织***、分化、增殖的能力，进而提高了蝴蝶兰组织培养的繁殖率，极具市场推广价值。

具体实施方式

实施例1

一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，包括如下步骤：

（1）培养基的配制：

a. 先称取相应重量份的冬瓜皮13.5份、西瓜皮8.5份、苋菜梗5.5份、黄瓜皮11份，南瓜藤13份共同置于木筛子上，然后在木筛子下面进行蒸汽熏蒸，熏蒸32min后，取出混合原料备用；

b. 将操作a中熏蒸处理后的混合原料置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎处理24min后，过50目筛备用；

c. 先将操作b中过筛后的粉末和无菌水按照重量体积比为1g:4.2mL共同投入微射流高压均质机内，然后进行均质处理，均质处理11min后，用3层纱布进行过滤，得滤液和滤饼备用；

d. 称取相应重量份的操作c所得滤液210份、柠檬酸2.2份、微量元素1.2份、6-苄基氨基嘌呤0.65份、萘乙酸0.32份、粉末添加剂3.2份、琼脂粉7.5份、纯化水510份备用；

e. 先将操作d中所称取的所有原料共同投入搅拌罐内，以42℃/min的速度将搅拌罐内的温度升至98℃，在升温的过程中以620rpm的转速进行搅拌直至原料中的琼脂粉完全融化，然后停止搅拌，将搅拌罐内的温度升至122℃，压力升至3.2MPa，维温维压21min，再降温降压，待压力降至常压，温度降至72℃时，取出产物趁热分装即得培养基备用；

（2）外植体的制备：

a. 先选取花朵凋谢，花期已过，生长健壮的蝴蝶兰花梗，然后将选取的花梗切成4cm的茎段；

b. 先将操作a中所得的蝴蝶兰花梗茎段投入杀菌液中进行浸泡，在浸泡的同时进行搅拌，浸泡处理15min后，用无菌水冲洗蝴蝶兰花梗茎段直至将表面的杀菌液冲洗干净，然后用无菌吸水纸将所得花梗茎段表面的无菌水吸干备用；

c. 将操作b中所得的无菌茎段的两端以及表面切除，然后将剩余的茎段部分切成0.7cm的小段即得外植体备用；

（3）接种：

将步骤（2）中所得的外植体接种到步骤（1）所得的培养基中，接种量每50mL培养基中接种4个外植体；

（4）接种后管理：

将步骤（3）中接种后的培养基置于光照培养箱中进行培养，培养过程中保持培养箱中的空气相对湿度为50%，温度为25℃，期间利用可调节光谱的LED光源控制光照条件。

进一步的，所述步骤（1）操作a中的冬瓜皮、西瓜皮、苋菜梗、黄瓜皮，南瓜藤均是新鲜采摘的。

进一步的，所述步骤（1）操作a中蒸汽的制备方法是：先称取相应重量份的小杭菊5.5份、金银花2.2份、金丝桃5.2份、艾草2.2份、雷公藤1.2份投入320份去离子水中，大火煮至沸腾，然后改用中火进行加热，边加热边缓慢匀速滴加无水乙醇，采用32min后冒出的蒸汽作为步骤（1）操作a中熏蒸处理的蒸汽，其中无水乙醇的滴加量为去离子水的10%。

进一步的，所述步骤（1）操作b中粉碎处理时粉碎机内的温度控制为-30℃，粉碎机的转速为1250rpm。

进一步的，所述步骤（1）操作c中均质处理时，微射流高压均质机的工作压力为145MPa。

进一步的，所述步骤（1）操作d中微量元素中各成分及对应重量份为：硼酸0.0022份、硫酸锰0.00012份、硫酸锌0.0032份、钼酸钠0.00022份、硫酸铜0.000012份、氯化钴0.000023份。

进一步的，所述步骤（1）操作d中粉末添加剂的制备方法是将步骤（3）中所得的滤饼和活性炭按照重量比为4.2:1.2共同投入珠磨机中，向珠磨机中加入液氮，以420rpm的转速进行研磨，研磨11min后，取出混合粉末过80目筛即可。

进一步的，所述步骤（2）操作b中杀菌液中各成分及对应重量份为：富里酸3份、75%乙醇45份、次氯酸钠1份。

进一步的，所述步骤（2）和步骤（3）的整个操作都在超净工作台中进行。

进一步的，所述步骤（4）中光照条件的控制具体为：接种后的8d内采用黑暗条件培养，8d后每天光照培养16h，黑暗培养8h，其中光照培养采用红蓝光比为1:2进行，光照强度为1300Lux。

实施例2

一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，包括如下步骤：

（1）培养基的配制：

a. 先称取相应重量份的冬瓜皮14份、西瓜皮9份、苋菜梗6份、黄瓜皮11.5份，南瓜藤13.5份共同置于木筛子上，然后在木筛子下面进行蒸汽熏蒸，熏蒸35min后，取出混合原料备用；

b. 将操作a中熏蒸处理后的混合原料置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎处理26min后，过60目筛备用；

c. 先将操作b中过筛后的粉末和无菌水按照重量体积比为1g:4.5mL共同投入微射流高压均质机内，然后进行均质处理，均质处理12min后，用4层纱布进行过滤，得滤液和滤饼备用；

d. 称取相应重量份的操作c所得滤液250份、柠檬酸2.5份、微量元素1.5份、6-苄基氨基嘌呤0.7份、萘乙酸0.35份、粉末添加剂3.5份、琼脂粉8份、纯化水550份备用；

e. 先将操作d中所称取的所有原料共同投入搅拌罐内，以45℃/min的速度将搅拌罐内的温度升至99℃，在升温的过程中以650rpm的转速进行搅拌直至原料中的琼脂粉完全融化，然后停止搅拌，将搅拌罐内的温度升至125℃，压力升至3.5MPa，维温维压22min，再降温降压，待压力降至常压，温度降至75℃时，取出产物趁热分装即得培养基备用；

（2）外植体的制备：

a. 先选取花朵凋谢，花期已过，生长健壮的蝴蝶兰花梗，然后将选取的花梗切成5cm的茎段；

b. 先将操作a中所得的蝴蝶兰花梗茎段投入杀菌液中进行浸泡，在浸泡的同时进行搅拌，浸泡处理17min后，用无菌水冲洗蝴蝶兰花梗茎段直至将表面的杀菌液冲洗干净，然后用无菌吸水纸将所得花梗茎段表面的无菌水吸干备用；

c. 将操作b中所得的无菌茎段的两端以及表面切除，然后将剩余的茎段部分切成0.85cm的小段即得外植体备用；

（3）接种：

将步骤（2）中所得的外植体接种到步骤（1）所得的培养基中，接种量每50mL培养基中接种5个外植体；

（4）接种后管理：

将步骤（3）中接种后的培养基置于光照培养箱中进行培养，培养过程中保持培养箱中的空气相对湿度为55%，温度为26℃，期间利用可调节光谱的LED光源控制光照条件。

进一步的，所述步骤（1）操作a中的冬瓜皮、西瓜皮、苋菜梗、黄瓜皮，南瓜藤均是新鲜采摘的。

进一步的，所述步骤（1）操作a中蒸汽的制备方法是：先称取相应重量份的小杭菊6份、金银花2.5份、金丝桃5.5份、艾草2.5份、雷公藤1.5份投入350份去离子水中，大火煮至沸腾，然后改用中火进行加热，边加热边缓慢匀速滴加无水乙醇，采用35min后冒出的蒸汽作为步骤（1）操作a中熏蒸处理的蒸汽，其中无水乙醇的滴加量为去离子水的15%。

进一步的，所述步骤（1）操作b中粉碎处理时粉碎机内的温度控制为-25℃，粉碎机的转速为1300rpm。

进一步的，所述步骤（1）操作c中均质处理时，微射流高压均质机的工作压力为150MPa。

进一步的，所述步骤（1）操作d中微量元素中各成分及对应重量份为：硼酸0.0025份、硫酸锰0.00015份、硫酸锌0.0035份、钼酸钠0.00025份、硫酸铜0.000015份、氯化钴0.000024份。

进一步的，所述步骤（1）操作d中粉末添加剂的制备方法是将步骤（3）中所得的滤饼和活性炭按照重量比为4.5:1.5共同投入珠磨机中，向珠磨机中加入液氮，以450rpm的转速进行研磨，研磨12min后，取出混合粉末过80目筛即可。

进一步的，所述步骤（2）操作b中杀菌液中各成分及对应重量份为：富里酸4份、75%乙醇50份、次氯酸钠1.5份。

进一步的，所述步骤（2）和步骤（3）的整个操作都在超净工作台中进行。

进一步的，所述步骤（4）中光照条件的控制具体为：接种后的8d内采用黑暗条件培养，8d后每天光照培养17h，黑暗培养7h，其中光照培养采用红蓝光比为1:2.5进行，光照强度为1400Lux。

实施例3

一种蝴蝶兰花梗茎段快速繁殖方法，包括如下步骤：

（1）培养基的配制：

a. 先称取相应重量份的冬瓜皮14.5份、西瓜皮9.5份、苋菜梗6.5份、黄瓜皮12份，南瓜藤14份共同置于木筛子上，然后在木筛子下面进行蒸汽熏蒸，熏蒸38min后，取出混合原料备用；

b. 将操作a中熏蒸处理后的混合原料置于深冷式粉碎机中进行粉碎处理，粉碎处理28min后，过70目筛备用；

c. 先将操作b中过筛后的粉末和无菌水按照重量体积比为1g:4.8mL共同投入微射流高压均质机内，然后进行均质处理，均质处理13min后，用5层纱布进行过滤，得滤液和滤饼备用；

d. 称取相应重量份的操作c所得滤液290份、柠檬酸2.8份、微量元素1.8份、6-苄基氨基嘌呤0.75份、萘乙酸0.38份、粉末添加剂3.8份、琼脂粉8.5份、纯化水590份备用；

e. 先将操作d中所称取的所有原料共同投入搅拌罐内，以48℃/min的速度将搅拌罐内的温度升至100℃，在升温的过程中以680rpm的转速进行搅拌直至原料中的琼脂粉完全融化，然后停止搅拌，将搅拌罐内的温度升至128℃，压力升至3.8MPa，维温维压23min，再降温降压，待压力降至常压，温度降至78℃时，取出产物趁热分装即得培养基备用；

（2）外植体的制备：

a. 先选取花朵凋谢，花期已过，生长健壮的蝴蝶兰花梗，然后将选取的花梗切成6cm的茎段；

b. 先将操作a中所得的蝴蝶兰花梗茎段投入杀菌液中进行浸泡，在浸泡的同时进行搅拌，浸泡处理19min后，用无菌水冲洗蝴蝶兰花梗茎段直至将表面的杀菌液冲洗干净，然后用无菌吸水纸将所得花梗茎段表面的无菌水吸干备用；

c. 将操作b中所得的无菌茎段的两端以及表面切除，然后将剩余的茎段部分切成0.7~1cm的小段即得外植体备用；

（3）接种：

将步骤（2）中所得的外植体接种到步骤（1）所得的培养基中，接种量每50mL培养基中接种6个外植体；

（4）接种后管理：

将步骤（3）中接种后的培养基置于光照培养箱中进行培养，培养过程中保持培养箱中的空气相对湿度为60%，温度为27℃，期间利用可调节光谱的LED光源控制光照条件。

进一步的，所述步骤（1）操作a中的冬瓜皮、西瓜皮、苋菜梗、黄瓜皮，南瓜藤均是新鲜采摘的。

进一步的，所述步骤（1）操作a中蒸汽的制备方法是：先称取相应重量份的小杭菊6.5份、金银花2.8份、金丝桃5.8份、艾草2.8份、雷公藤1.8份投入380份去离子水中，大火煮至沸腾，然后改用中火进行加热，边加热边缓慢匀速滴加无水乙醇，采用38min后冒出的蒸汽作为步骤（1）操作a中熏蒸处理的蒸汽，其中无水乙醇的滴加量为去离子水的20%。

进一步的，所述步骤（1）操作b中粉碎处理时粉碎机内的温度控制为-20℃，粉碎机的转速为1350rpm。

进一步的，所述步骤（1）操作c中均质处理时，微射流高压均质机的工作压力为155MPa。

进一步的，所述步骤（1）操作d中微量元素中各成分及对应重量份为：硼酸0.0028份、硫酸锰0.00018份、硫酸锌0.0038份、钼酸钠0.00028份、硫酸铜0.000018份、氯化钴0.000025份。

进一步的，所述步骤（1）操作d中粉末添加剂的制备方法是将步骤（3）中所得的滤饼和活性炭按照重量比为4.8:1.8共同投入珠磨机中，向珠磨机中加入液氮，以480rpm的转速进行研磨，研磨13min后，取出混合粉末过80目筛即可。

进一步的，所述步骤（2）操作b中杀菌液中各成分及对应重量份为：富里酸5份、75%乙醇55份、次氯酸钠2份。

进一步的，所述步骤（2）和步骤（3）的整个操作都在超净工作台中进行。

进一步的，所述步骤（4）中光照条件的控制具体为：接种后的8d内采用黑暗条件培养，8d后每天光照培养18h，黑暗培养6h，其中光照培养采用红蓝光比为1:3进行，光照强度为1500Lux。