阅读说明：本技术 一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法 (Efficient brocade rhododendron direct somatic embryogenesis method ) 是由 魏翔莺 张春英 郑秀霞 穆景利 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法,属于植物快速繁殖再生技术领域。本发明首次建立云锦杜鹃的高效体细胞胚胎发生系统,以云锦杜鹃实生苗叶片为外植体的体细胞直接胚胎发生再生植株,是一种高效的获得大量云锦杜鹃组培苗的无性繁殖方式。本发明完善了常绿杜鹃花亚属植物组培快繁体系,解决了传统的播种耗时长且容易产生变异和扦插繁殖系数很低的难题。该方法能够快速繁殖大量性状稳定的植株,快速建立优良单株的无性系,在云锦杜鹃种苗生产、种质创新和新品种选育方面均有重要的应用价值。(The invention discloses a high-efficiency rhododendron brocade direct somatic embryogenesis method, and belongs to the technical field of rapid plant propagation and regeneration. The invention establishes a high-efficiency somatic embryogenesis system of rhododendron micranthum for the first time, takes the leaves of the seedling of the rhododendron micranthum as explants for somatic cell direct embryogenesis to regenerate plants, and is an asexual propagation mode for efficiently obtaining a large amount of tissue culture seedlings of the rhododendron micranthum. The invention perfects the tissue culture and rapid propagation system of the rhododendron evergreen subgenus plant, and solves the problems of long time consumption, easy variation generation and low cuttage propagation coefficient in the traditional sowing. The method can rapidly propagate a large number of plants with stable characters, rapidly establish the clone of a good single plant, and have important application values in the aspects of brocade rhododendron seedling production, germplasm innovation and new variety breeding.)

一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法

技术领域

本发明属于植物快速繁殖再生技术领域，具体涉及一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法。

背景技术

云锦杜鹃作为杜鹃花科植物的重要亲本，具有很高的观赏价值，极其耐寒且具有香气。传统的繁殖方式为种子播种或者茎段扦插，但是育种周期长且效率低，所以通过离体培养再生植株是一种高效且快速大量繁殖植株的方法。云锦杜鹃为木本植物，植物体中含有较多的多酚类物质会阻碍细胞***，因此其再生系统的建立比较困难，通过体细胞胚胎发生再生的方案尚未建立。

胚性细胞具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞，由具有***特性的胚性细胞发育而来的体细胞胚多数是单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少，是最理想的基因转化受体系统。故建立体胚发生系统在云锦杜鹃种苗生产、种质创新和新品种选育方面均有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于针对云锦杜鹃现有种子繁殖和扦插繁殖时间慢且容易产生变异的问题，提供一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：

（1）云锦杜鹃无菌播种苗的准备：云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中，温度25℃，光照强度80mol.m^-2.s^-1的组培室中培养2-3个月，获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用；

（2）叶片体细胞胚胎的诱导：在超净工作台中，取步骤（1）制备的云锦杜鹃幼苗顶端的2-4片嫩叶，置于湿润的无菌滤纸上，用刀片切除叶片两端，正面朝上，将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面，每个平板放四个叶片，用封口膜封好后黑暗培养2个星期，温度25℃；然后放置于培养室中培养，温度25℃，16h光照8h黑暗，光照强度80 lmol m^{- 2}s^-1，培养时间80-100 d；期间观察叶片体细胞胚胎发生的过程，对体细胞胚胎发生的的四个典型阶段：球形胚，心形胚，鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录，并统计体胚发生率及其转化率以及平均每个外植体的成苗数；

（3）移栽及光水管理：将将步骤（2）的小植株从外植体上剥离，移栽到穴盘中后进行喷雾培养，湿度80%-90%，20d后停止喷雾，保持通风良好和遮光处理；水肥管理为每周浇2-3次水，每周浇一次20-20-20水溶性肥料（浓度为200ppm）。

上述步骤（1）中所述培养基的组成为：1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂，pH为5.0 -5.2之间。

上述步骤（2）中，所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为：木本植物培养基WPM+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值调至5.0-5.2，121℃高压30min，冷却到50-60℃后添加过滤灭菌的植物生长调节剂：TDZ （噻苯隆）0.5 mg/L和NAA（萘乙酸）0.2 mg/L，将培养基分装至培养皿中凝固待用（25ml每个培养皿）。

上述 ER培养基的配方为：NH₄NO₃ 400 mg/L； (NH₄)₂SO₄ 132 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，CaCl₂ 332.2 mg/L，CoCl₂ . 6H₂O 0.025mg/L，CuSO₄ . 5H₂O 0.025mg/L，DTPA 39.34 mg/L，FeSO₄.7H₂O 27.8 mg/L，MgSO₄ 180.8 mg/L，MnSO₄ . H₂O 16.9 mg/L，Na₂MoO₄ . 2H₂O0.25 mg/L，C₆H₁₂O₆ 100 mg/L，KNO₃ 202 mg/L，KH₂PO₄ 408 mg/L， C₁₂H₁₇ClN₄OS . HCl 0.4mg/L，ZnSO₄ . 7H₂O 8.6mg/L，琼脂8 g/L，蔗糖 30g/L，PH 5.0-5.2。

上述木本植物培养基WPM的配方为：NH₄NO₃ 400 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，CaCl₂72.47 mg/L，Ca(NO₃)₂ . 4H₂O 556 mg/L，CuSO₄ 0.16 mg/L，C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2H₂O 37.3 mg/L，FeSO₄.7H₂O 27.85 mg/L，MgSO₄ 180.7 mg/L，MnSO₄ . H2O 22.3 mg/L，Na₂MoO₄ . 2H₂O0.25 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，K₂SO₄ 990 mg/L，ZnSO₄.7H₂O 8.6 mg/L琼脂8 g/L，蔗糖 30g/L，PH 5.0-5.2。

上述步骤（3）所述的穴盘中装栽培基质，用营养液浇透后进行移栽；所述栽培基质的制备方法为：沙子先用自来水冲洗数遍，然后自来水浸泡三天，中间换3~5次水，最后风干备用，将草炭和备好的沙子按2：1的体积比混合后分装于96孔标准穴盘中；所述营养液的配方为：CaCl₂·2H₂O 0.05g/L, NaCl 0.025g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15g/L,（NH₄）₂HPO₄ 0.25g/L, KH₂PO₄ 0.5g/L, 柠檬酸0.2g/L, 维生素B1 0.1mg/L，葡萄糖 15g/L，琼脂 20g/L, 调节pH至5.0 -5.2。

本发明的优点在于：

1、建立了高效的云锦杜鹃体细胞胚胎发生系统，繁殖系数高且性状稳定。解决种子繁殖性状分离以及扦插生根困难的问题。

2、 本发明完善了杜鹃花组培快繁体系，移栽后组培苗成活率高达90%以上，且不需经历组培瓶内生根阶段，大大缩短了组培周期，节省时间和空间，大幅度降低成本， 对组培产业化水平提升具有重要意义。

附图说明

图1 云锦杜鹃体细胞胚胎发生的四个阶段。 A：球形胎阶段； B：心形胚阶段； C：鱼雷形胚阶段；D：子叶形胚阶段。

图2 体细胞胚胎成苗后移栽至温室。 A：单个叶片边缘产生体细胞胚胎； B：单个叶片产生的体细胞胚胎成苗产生小植株；C.：体细胞胚胎成苗后剥下来的单个小植株；D：体细胞胚胎成苗后的小植株移栽至穴盘。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

培养基：

ER培养基的配方为：NH₄NO₃ 400 mg/L； (NH₄)₂SO₄ 132 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，CaCl₂332.2 mg/L，CoCl₂ . 6H₂O 0.025mg/L，CuSO₄ . 5H₂O 0.025mg/L，DTPA 39.34 mg/L，FeSO₄.7H₂O 27.8 mg/L，MgSO₄ 180.8 mg/L，MnSO₄ . H₂O 16.9 mg/L，Na₂MoO₄ . 2H₂O 0.25mg/L，C₆H₁₂O₆ 100 mg/L，KNO₃ 202 mg/L，KH₂PO₄ 408 mg/L， C₁₂H₁₇ClN₄OS . HCl 0.4 mg/L，ZnSO₄ . 7H₂O 8.6mg/L，琼脂8 g/L，蔗糖 30g/L，PH 5.0-5.2。

WPM培养基的配方为：NH₄NO₃ 400 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，CaCl₂ 72.47 mg/L，Ca(NO₃)₂ . 4H₂O 556 mg/L，CuSO₄ 0.16 mg/L，C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2H₂O 37.3 mg/L， FeSO₄.7H₂O27.85 mg/L，MgSO₄ 180.7 mg/L，MnSO₄ . H2O 22.3 mg/L，Na₂MoO₄ . 2H₂O 0.25 mg/L，KH₂PO₄ 170 mg/L，K₂SO₄ 990 mg/L，ZnSO₄.7H₂O 8.6 mg/L琼脂8 g/L，蔗糖 30g/L，PH 5.0-5.2。

实施例1

一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：

（1）云锦杜鹃无菌播种苗的准备：云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中，温度25℃，光照强度80mol.m^-2.s^-1的组培室中培养3个月，获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用；

（2）叶片体细胞胚胎的诱导：在超净工作台中，取步骤（1）制备的云锦杜鹃幼苗顶端的2片嫩叶，置于湿润的无菌滤纸上，用刀片切除叶片两端，正面朝上，将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面，每个平板放四个叶片，用封口膜封好后黑暗培养2个星期，温度25℃；然后放置于培养室中培养，温度25℃，16h光照8h黑暗，光照强度80 lmol m^{- 2}s^-1，培养时间80d；期间观察叶片体胚发生的过程，对体细胞胚胎发生的四个典型阶段：球形胚，心形胚，鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录（图1），并统计体胚发生率及其转化率以及平均每个外植体的成苗数；

（3）移栽及光水管理：将步骤（2）体胚成苗的小植株（图2B）从外植体上剥离（图2C），移栽到穴盘（图2D）后进行喷雾处理，湿度80%，培养20d停止喷雾，保持通风良好和遮光处理；水肥管理为每周浇3次水，每周浇一次20-20-20水溶性肥料（浓度为200ppm）。

上述步骤（1）中所述培养基的组成为：1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂，pH为5.0。

上述步骤（2）中，所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为：木本植物培养基WPM，+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值调至5.1，121℃高压30min，冷却到50℃后添加不同组合的过滤灭菌的植物生长调节剂：将培养基分装至培养皿中凝固待用（25ml每个培养皿）。 生长调节剂组合为：细胞***素TDZ的浓度为0.5 mg/L，添加5个梯度的生长素NAA，NAA浓度分别为：0 mg/L ，0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L和0.2 mg/L。共5种体细胞胚胎发生诱导培养基（即5个处理），每个处理6个重复（6个平板），每个平板4个叶片外植体，计算单个外植体成苗数时先计算每个平板中4个外植体成苗数的平均值，最后6个重复再平均，即为最后每个处理的单个外植体的平均成苗数。

上述步骤（3）所述的穴盘中装栽培基质，用营养液浇透后进行移栽；所述栽培基质的制备方法为：沙子先用自来水冲洗数遍，然后自来水浸泡三天，中间换5次水，最后风干备用，将草炭和备好的沙子按2：1的体积比混合后分装于96孔标准穴盘中；所述营养液的配方为：CaCl₂·2H₂O 0.05g/L, NaCl 0.025g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15g/L, （NH₄）2HPO₄ 0.25g/L,KH₂PO₄ 0.5g/L, 柠檬酸0.2g/L, 维生素B1 0.1mg/L，葡萄糖 15g/L，琼脂 20g/L, 调节pH至5.0 -5.2。

不同TDZ和NAA组合对杜鹃叶片体细胞胚胎发生的影响见表1。

表1 浓度 NAA和TDZ的配比对云锦杜鹃体胚发生的影响

注：图中数字后面不同小写字母表示LSD测验差异显著（P<0.05）

表1结果表明，体细胞胚胎发生诱导培养基中TDZ含量0.5 mg/L，NAA含量为0.2 mg/L的组合对云锦杜鹃体胚发生的诱导效果最为显著。体胚发生率为96 %；体胚转化率为67%，单个外植体平均能产生34.83个植株。

本实施例移栽后组培苗成活率高达90%。

实施例2

一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：

（1）云锦杜鹃无菌播种苗的准备：云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中，温度25℃，光照强度80mol.m^-2.s^-1的组培室中培养2.5个月，获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用；

（2）叶片体细胞胚胎的诱导：在超净工作台中，取步骤（1）制备的云锦杜鹃幼苗顶端的4片嫩叶，置于湿润的无菌滤纸上，用刀片切除叶片两端，正面朝上，将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面，每个平板放四个叶片，用封口膜封好后黑暗培养2个星期，温度25℃；然后放置于培养室中培养，温度25℃，16h光照8h黑暗，光照强度80 lmol m^{- 2}s^-1，培养时间100 d；期间观察叶片体胚发生的过程，对体细胞胚胎发生的四个典型阶段：球形胚，心形胚，鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录，并统计得体胚发生率为97% ，其转化率为70% ；平均每个外植体的成苗数为32.23；

（3）移栽及光水管理：将步骤（2）的小植株从外植体上剥离，移栽到穴盘中，先遮阳和密封处理一周，之后进行喷雾培养，湿度90%，25d后停止喷雾，保持通风良好和遮光处理；水肥管理为每周浇2次水，每周浇一次20-20-20水溶性肥料（浓度为200ppm）。

上述步骤（1）中所述培养基的组成为：1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂，pH为5.12。

上述步骤（2）中，所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为：WPM，加入30g/L蔗糖和8g/L琼脂，PH值调至5.2, 121℃高压30min，冷却到室温后添加过滤灭菌的植物生长调节剂： TDZ 0.5 mg/L和NAA0.2 mg/L，将培养基分装至培养皿中凝固待用（25ml每个培养皿）。

上述步骤（3）所述的穴盘中装栽培基质，用营养液浇透穴盘内的栽培基质后移栽小植株；所述栽培基质的制备方法为：沙子先用自来水冲洗数遍，然后自来水浸泡三天，中间换五次水，最后风干备用，将草炭和备好的沙子按2：1的体积比混合后分装于96孔标准穴盘中；所述营养液的配方为：CaCl₂·2H₂O 0.05g/L, NaCl 0.025g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15g/L, （NH₄）2HPO₄ 0.25g/L, KH₂PO₄ 0.5g/L, 柠檬酸0.2g/L, 维生素B1 0.1mg/L，葡萄糖15g/L，琼脂 20g/L, 调节pH至5.2。

本实施例移栽后组培苗成活率为93%。

实施例3

一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：

（1）云锦杜鹃无菌播种苗的准备：云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中，温度25℃，光照强度80mol.m^-2.s^-1的组培室中培养3个月，获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用；

（2）叶片体细胞胚胎的诱导：在超净工作台中，取步骤（1）制备的云锦杜鹃幼苗顶端的3片嫩叶，置于湿润的无菌滤纸上，用刀片切除叶片两端，正面朝上，将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面，每个平板放四个叶片，用封口膜封好后黑暗培养2个星期，温度25℃；然后放置于培养室中培养，温度25℃，16h光照8h黑暗，光照强度80 lmol m^{- 2}s^-1，培养时间90 d；期间观察叶片体胚发生的过程，对体细胞胚胎发生的四个典型阶段：球形胚，心形胚，鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录，并统计得体胚发生率为96.5%，其转化率为70%；平均每个外植体的成苗数为33.53；

（3）移栽及光水管理：将步骤（2）的小植株从外植体上剥离，移栽到穴盘中，先遮阳和密封处理一周，之后进行喷雾，湿度85%，培养22d后停止喷雾，保持通风良好和遮光处理；水肥管理为每周浇2-3次水，每周浇一次20-20-20水溶性肥料（浓度为200ppm）。

上述步骤（1）中所述培养基的组成为：1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂，pH为5.15之间。

上述步骤（2）中，所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为： WPM，加入30g/L蔗糖和8g/L琼脂，PH值用1.0 M NaOH调至5.1, 121℃高压30min，冷却到室温后添加过滤灭菌的植物生长调节剂： TDZ 0.5 mg/L和NAA 0.2 mg/L，将培养基分装至培养皿中凝固待用（25ml每个培养皿）。

上述步骤（3）所述的穴盘中装栽培基质，用营养液浇透穴盘内的栽培基质后进行移栽；所述栽培基质的制备方法为：沙子先用自来水冲洗数遍，然后自来水浸泡三天，中间换五次水，最后风干备用，将草炭和备好的沙子按2：1的体积比混合后分装于96孔标准穴盘中；所述营养液的配方为：CaCl₂·2H₂O 0.05g/L, NaCl 0.025g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15g/L,（NH₄）2HPO₄ 0.25g/L, KH₂PO₄ 0.5g/L, 柠檬酸0.2g/L, 维生素B1 0.1mg/L，葡萄糖 15g/L，琼脂 20g/L, 调节pH至5.2。

本实施例移栽后组培苗成活率达到95%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。