阅读说明：本技术 一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法 (Method for artificially and rapidly propagating rhynchophylla by utilizing embryogenic callus ) 是由 黄衡宇 徐福荣 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法,包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的蒴果剖开,其内种子接种于萌发培养基中,待愈伤组织出现后,进行胚愈伤组织诱导和增殖,原球茎分化、生长和增殖,生根培养,炼苗移栽。本发明的核心在于钻喙兰种皮破裂后产生胚性愈伤组织,进而分化出原球茎；在此基础上,对培养基进行了优化调整,将胚性愈伤组织增殖、原球茎分化、萌发生长和增殖同步进行,简化了组培过程,3个培养过程同时在一个培养基中进行,大大提高了繁殖效率。此外,本发明成本低、周期短、种苗质量和成活率高。(The invention discloses a method for carrying out artificial rapid propagation on rhynchophylla by utilizing embryonic callus, which comprises the following steps: splitting the disinfected capsule, inoculating the seeds in a germination culture medium, inducing and proliferating embryonic callus after the callus appears, differentiating, growing and proliferating protocorm, rooting culture, hardening off and transplanting. The core of the invention is that embryonic callus is generated after the seed coat of the coracocephalum rhynchophyllum is cracked, and then protocorm is differentiated; on the basis, the culture medium is optimized and adjusted, the embryogenic callus proliferation, the protocorm differentiation, the germination growth and the proliferation are synchronously carried out, the tissue culture process is simplified, 3 culture processes are simultaneously carried out in one culture medium, and the propagation efficiency is greatly improved. In addition, the invention has low cost, short period and high seedling quality and survival rate.)

一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法。

背景技术

钻喙兰属(Rhynchostylis)为兰科(Orchidaceae)多年生附生草本，约6种，主要分布于热带亚洲，我国有2种，分别为海南钻喙兰[R.gigantea(Lindl.)Ridl.] 和钻喙兰[R.retusa(L.)Bl.]，主产于南方热带地区。钻喙兰属植物花色淡雅且具芳香，花序饱满，下垂或直立，形似一条***的狐狸尾巴，因此其商品俗称“狐尾兰”，为有较高观赏价值的一类附生兰。钻喙兰的花色较为丰富，有红、粉红、白、蓝、橘等颜色，由于其花型独特、花期长且为我国传统节日—春节前后，是极好的新春贺岁花卉，因此受到人们的极度喜爱。

钻喙兰传统繁殖方式为分株繁殖和种子繁殖，分株繁殖尽管能够保持母本性状，但效率低，增殖倍数只有1-3倍，且周期较长，难以满足工厂化生产的需要。而兰科绝大多数种类的种子细小且缺乏子叶和胚乳，导致胚发育不完全，在自然条件下需要和相关共生菌共同作用萌发，这样导致萌发时间长和萌发率低(仅为 5％)、成苗率低，而且从种子萌发到能进行性状鉴定的开花植株一般需要4-5年，甚至更久。因此，需要寻求一种新的成本低、时间短、增殖系数可观，种苗质量和成活率高的无性繁殖方法来扩大钻喙兰种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有繁殖技术存在的缺陷，提供一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法，该方法为杂交后代人工选择育种、发展人工种植奠定了技术基础。通过本发明，亦可提供由单一原球茎产生的、基因型背景一致的优质种苗以满足人工种植的需求。

为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的蒴果剖开，其内种子接种于萌发培养基中，待愈伤组织出现后，进行胚愈伤组织诱导和增殖，原球茎分化、生长和增殖，生根培养，炼苗移栽。

进一步地，所述的利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，人工授粉后取其成熟饱满蒴果；

(2)将1步骤的蒴果进行消毒处理；

(3)种子萌发、愈伤组织诱导、原球茎发生：将经过步骤2消毒灭菌好的蒴果，在工作台上用手术刀纵向剖开，将其内种子均匀撒至下列培养基A中，所述 A培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤(6-BA)

活性炭(AC)

香蕉泥

蔗糖

琼脂粉

控制光照度、温度、光照时间的条件下进行种子萌发、愈伤组织诱导、原球茎发生；

(4)胚性愈伤组织增殖、原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗：将步骤3 培养的愈伤组织转接至培养基B中，所述B培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤(6-BA)

萘乙酸(NAA)

激动素(KT)

活性炭(AC)

香蕉泥

蔗糖

琼脂粉

控制光照度、温度、光照时间的条件下进行胚性愈伤组织增殖、原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗；

(5)复壮生根培养：将步骤4丛生芽中芽单株分开，选取叶子，长势基本一致的幼苗，根剪部分后接入培养基D中，所述D培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

萘乙酸(NAA)

活性炭(AC)

椰汁

蔗糖

琼脂粉

pH

控制光照度、温度、光照时间的条件下进行复壮生根培养；

(6)炼苗和移栽：取步骤5中的生根植株置于室温下炼苗，从培养基D中取出幼苗，用清水洗净根部培养基D，然后放置于室内晾干水分，待其根部发白时，移栽至用百菌清杀菌消毒过的碎松树皮中，保持湿度一段时间后，即得移栽苗。

进一步地，步骤2中所述蒴果进行消毒处理的方法为：将步骤1的蒴果先用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒30s，再用质量百分比为0.1％的HgCl₂灭菌20min，最后无菌水冲洗2-3次，每次不低于 3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。

进一步地，步骤3中所述A培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

进一步地，所述A培养基的pH值为5.4-5.6。

进一步地，步骤4中所述B培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

进一步地，所述B培养基的pH值为5.4-5.6。

进一步地，还包括以下步骤：将步骤4丛状苗切割为3-5株一丛、基部带部分愈伤组织转接入C培养基中，所述C培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

控制光照度、温度、光照时间的条件下进行胚性愈伤组织增殖、原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗。

进一步地，步骤5中所述D培养基，包括以下原料：

1/2MS基本培养液

进一步地，所述D培养基的pH值为5.4-5.6。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明用组织培养技术在培养室内好可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点；

(2)本发明实现了高效快繁的目的，90d为一个增殖培养周期，繁殖系数可达10.0以上；

(3)本发明解决了传统种子繁殖效率低下，周期长等难题，通过本发明，可在短时间内获得数量极大的种苗，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗；

(4)本发明对钻喙兰快速繁殖体系进行了优化，在同一培养基中，可同时进行胚性愈伤组织增殖、原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗，简化了培养程序；整个快速繁殖过程除起始阶段的种子萌发和胚性愈组织增殖、原球茎发生外，只需2种培养基就解决了从胚性愈伤组织增殖、原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗以及生根问题，利于安排生产计划；

(5)本发明由于试管苗来源于原球茎，试管内便苗壮根粗，炼苗和移栽成活率高。

附图说明

图1为愈伤组织增殖和芽发生各个生长阶段的图；

其中图1-A为转接20d后，愈伤开始增殖图；图1-B为愈伤组织的表面分化出的原球茎有萌发迹象图；图1-C为每个材料均有胚性愈伤出现，进而产生的原球茎伴有明显的假根毛(rhizoids)图；图1-D为原球茎开始大量萌发，每一原球茎均出现假根毛图；图1-E为随着愈伤的增殖，由原球茎萌发的幼苗成“丛芽”状；图1-F为胚性愈伤分化出的原球茎图；图1-G为原球茎先根后芽萌发图；

图1-H为由众多原球茎萌发出的“丛芽”图。

图2为实施例1的芽的生长和增殖各阶段图；

图2-A为转接20d左右芽的生长情况图；。图2-B、C为40d左右幼芽叶片伸展，其基部愈伤增殖迅速图；图2-D为由于原球茎的大量发生，愈伤变为翠绿色图；图2-E、F为原球茎萌发为幼芽成“丛状”图；图2-G、H为培养90d左右的生长情况图。

图3为实施例1的复壮生根及驯化移栽图；

图3-A、B为培养20d的复壮生根苗图；图3-C为50d后试管苗生长迅速，新根不断发生，已达4-5条图；图3-E、F为生根苗90d后的生长情况图；图3-G、 H为驯化90d后的试管苗图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，人工授粉后取其成熟饱满蒴果。

2、将步骤1的蒴果先用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用10％洗衣粉溶液(质量比)浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒30s，再用质量百分比为0.1％的HgCl₂灭菌20min，最后无菌水冲洗2次，每次3min。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、种子萌发、愈伤组织诱导、原球茎发生：将经过步骤2消毒灭菌好的蒴果，在超净工作台上用手术刀纵向剖开，将其内种子均匀撒至下列培养基A中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下进行种子萌发，15d胚吸水膨大，种皮破裂处出现绿色愈伤组织；30d后绿色愈伤组织逐渐转化为胚性，其上分化出颗粒状原球茎；60d后愈伤组织(含胚性愈伤组织)大量增殖，基本覆盖整个培养基表面。

4、胚性愈伤组织增殖、原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗：将步骤3培养的愈伤组织按0.5×0.5cm包含若干原球茎为一块切割，转接至培养基B中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度2000-2500lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养90d。胚性愈伤组织大量出现，并产生数量极多的原球茎；随着原球茎的萌发，每一愈伤组织块上产生丛状芽，可见明显的假根毛(rhizoids)。此步骤愈伤增殖系数为17.68，芽发生系数也达20.16。

5、将步骤4丛状苗切割为3株一丛、基部带部分愈伤组织转接入C培养基中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度2000-2500lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20d左右基部愈伤开始增殖，幼芽的根生长迅速，其叶片开始伸展； 40d左右幼芽叶片进一步伸展，其基部愈伤亦明显增多；50d后幼芽具4片新叶，基部愈伤由于原球茎的大量出现变为翠绿色；70d后愈伤上的原球茎大量萌发； 90d后幼芽生长为小植株，其基部这由原球茎萌发出的新芽所覆盖，此时芽发生系数为17.87，愈伤增殖系数亦可达10.32。

6、复壮生根培养：将步骤5丛生芽中较大的芽单株分开，选取高为3cm、具3片叶子，长势基本一致的幼苗，根剪去2/3接入培养基D中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度2000-2500lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20d后，新叶发生，基部出现细嫩新根；50d后可见粗壮且生长迅速的新根；90d后，试管苗叶片舒展完全，具5条新根，根粗14mm。在整个复壮生根培养中，没有愈伤和原球茎发生，也未见“丛芽”出现，表明培养基非常适宜钻喙兰此阶段的培养。

7、炼苗和移栽：取步骤6中具4片小叶，根长4cm，株高5cm生根植株置于室温下炼苗3d后，从培养基D中取出幼苗，用清水小心洗净根部培养基D，然后放置于室内晾干水分，待其根部发白时，移栽至用质量浓度0.1％的百菌清杀菌消毒过的碎松树皮中，湿度保持在62％，90d后，即得移栽苗。

实施例2

一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，人工授粉后取其成熟饱满蒴果。

2、将步骤1的蒴果先用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用10％洗衣粉溶液(质量比)浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒30s，再用质量百分比为0.1％的HgCl₂灭菌20min，最后无菌水冲洗2-3次，每次不低于3min。在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、种子萌发、愈伤组织诱导、原球茎发生：将经过步骤2消毒灭菌好的蒴果，在超净工作台上用手术刀纵向剖开，将其内种子均匀撒至下列培养基A中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度1500-2000lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下进行种子萌发，15d胚吸水膨大，种皮破裂处出现绿色愈伤组织；30d后绿色愈伤组织逐渐转化为胚性，其上分化出颗粒状原球茎；60d后愈伤组织(含胚性愈伤组织)大量增殖，基本覆盖整个培养基表面。

4、将步骤3原球茎苗切割为4株一丛、基部带部分愈伤组织转接入C培养基中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度2000-2500lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20d左右基部愈伤开始增殖，幼芽的根生长迅速，其叶片开始伸展； 40d左右幼芽叶片进一步伸展，其基部愈伤亦明显增多；50d后幼芽具5片新叶，基部愈伤由于原球茎的大量出现变为翠绿色；70d后愈伤上的原球茎大量萌发； 90d后幼芽生长为小植株，其基部这由原球茎萌发出的新芽所覆盖，此时芽发生系数为17.37，愈伤增殖系数亦可达10.85。

从钻喙兰的实际情况来看，培养至此步骤时，减少了“原步骤4”，缩短成苗时间，采用本步骤培养基(即C培养基)，即可一次性完成胚性愈伤组织增殖，原球茎发生和增殖、原球茎萌发成苗等阶段，可将180d甚至更长的培养时间缩短为90d左右。

5、复壮生根培养：将步骤4丛生芽中较大的芽单株分开，选取高为3.1cm、具4片叶子，长势基本一致的幼苗，根剪去2/3接入培养基D中：

1/2MS基本培养液

培养条件：在光照度2000-2500lx，光照时间12h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20d后，新叶发生，基部出现细嫩新根；50d后可见粗壮且生长迅速的新根；90d后，试管苗叶片舒展完全，具6条新根，根粗14.2mm。在整个复壮生根培养中，没有愈伤和原球茎发生，也未见“丛芽”出现，表明培养基非常适宜钻喙兰此阶段的培养。

6、炼苗和移栽：取步骤6中具5片小叶，根长5cm，株高5.3cm生根植株置于室温下炼苗3d后，从培养基D中取出幼苗，用清水小心洗净根部培养基D，然后放置于室内晾干水分，待其根部发白时，移栽至用质量浓度0.1％的百菌清杀菌消毒过的碎松树皮中，湿度保持在73％，90d后，即得移栽苗。

本发明的技术原理：

本发明的核心在于钻喙兰种皮破裂后产生胚性愈伤组织，进而分化出原球茎，且证明了天然附加产物椰汁在钻喙兰体外快繁中起着至关重要的作用；在此基础上，对培养基进行了优化调整，通过4因素3水平正交试验筛选出协同作用效果最好的3种外源激素配合使用，将胚性愈伤组织增殖、原球茎分化、萌发生长和增殖同步进行，简化了组培过程，3个培养过程同时在一个培养基中进行，将180 d甚至更长的培养时间缩短为90d左右，大大提高了繁殖效率。

本发明提供的钻喙兰通过胚性愈伤组织高效人工繁殖方法成本低、时间短、种苗质量和成活率高，且能将优良性状固定下来；通过该方法可用来扩钻喙兰种苗的繁殖量，从而进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。