阅读说明：本技术 一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法 (Tissue culture propagation method of revived plant selaginella pulvinata ) 是由 余蓉培 汪国鲜 浦艳飞 李帆 卢珍红 莫锡君 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。该方法包括：垫状卷柏无菌外植体的获得、原生芽的诱导、不定芽的增殖以及组培苗壮苗和生根培养。本发明成功以复苏植物垫状卷柏幼嫩枝条尖端为外植体,构建了垫状卷柏组培繁殖体系,不定芽的增殖率达8倍以上,组培苗壮苗和生根培养过程中的单个不定芽的再次增殖率达11倍以上,1个垫状卷柏幼嫩枝条尖端在170～175天内可以扩繁得到88株以上的组培苗,获得了较高的繁殖效率,为垫状卷柏的规模化扩繁奠定了良好的基础,对复苏植物垫状卷柏的野生种群保护和资源开发利用具有重要意义。(A tissue culture propagation method of resuscitated plant Selaginella pulvinata (lour.) DC. The method comprises the following steps: obtaining a sterile tamariskoid spikemoss herb explant, inducing an original bud, proliferating an adventitious bud, and performing tissue culture seedling strengthening and rooting culture. The method successfully takes the tips of the young branches of the revived plant selaginella pulvinata as explants to construct a selaginella pulvinata tissue culture propagation system, the multiplication rate of the adventitious buds is more than 8 times, the re-multiplication rate of a single adventitious bud in the process of tissue culture seedling strengthening and rooting culture is more than 11 times, 1 young branch of the selaginella pulvinata can be propagated to obtain more than 88 tissue culture seedlings within 170-175 days, higher propagation efficiency is obtained, a good foundation is laid for the large-scale propagation of the selaginella pulvinata, and the method has important significance for the wild population protection and resource development and utilization of the revived plant selaginella pulvinata.)

一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法

技术领域

本发明属植物繁殖领域，具体涉及一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。

背景技术

垫状卷柏[Selaginella pulvinata(Hook.&Grev)Maxim.]，隶属于卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属，呈垫状，主茎不呈匍匐状，主要生长于裸露的石灰岩表面或石缝，生长环境较为干旱。垫状卷柏俗称“九死还魂草”，是典型的复苏植物，具有极强的耐脱水特性，能在极端脱水的情况下通过较低的新陈代谢保持长期生存，水分条件适宜时，能迅速恢复正常生长。垫状卷柏因其神奇的复苏特性成为一类特殊的观赏植物资源。同时，垫状卷柏含有黄酮、双黄酮、炔酚等药用成分，具有抗癌、抗病毒、抗氧化和降糖等功效，是重要的药用植物资源。

垫状卷柏为异形孢子蕨类，具有大孢子和小孢子，在湿润环境中，大孢子发育成为具有颈卵器的雌配子体，小孢子发育成为具有***器的雄配子体，在水环境下，***器中的***进入颈卵器中，与卵子结合形成受精卵，最终发育成为垫状卷柏幼苗。然而，垫状卷柏的生境较为干旱，仅雨季有短暂的湿润期，不利于垫状卷柏的孢子繁殖，难以形成孢子繁殖后代。连续野外调查发现，垫状卷柏野外种群的自然繁殖率较低，种群内的个体数量没有明显增加。加之垫状卷柏兼具观赏和药用价值，野生资源被大肆采掘，导致垫状卷柏野外种群数量急剧减少，野生资源已经无法满足当前的需求。

卷柏属中，部分主茎匍匐状的种类，如：小翠云，茎节处具有不定根，可以进行扦插繁殖，但垫状卷柏的主茎不呈匍匐状，极难进行扦插繁殖。此外，在前期研究中发现，垫状卷柏组培过程中极容易产生褐化，组培繁殖难度较大。目前，尚未见关于复苏植物垫状卷柏相关繁殖技术的报道，亦未见复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。

为解决复苏植物垫状卷柏野生种群急剧减少、自然繁殖力低等问题，本发明提供一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。

本发明所述的一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法，包括以下步骤：

(1)无菌外植体的获得

选取野生垫状卷柏植株的幼嫩枝条尖端作为外植体，经过消毒灭菌后，获得无菌外植体；

(2)原生芽的诱导

将步骤(1)中获得的无菌外植体接种在原生芽诱导培养基上，放置于20～25℃培养室中进行暗培养，暗培养周期为30～45天，所述原生芽诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.1～0.2mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+柠檬酸400～500mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(3)不定芽的增殖

将步骤(2)中获得的原生芽接种在不定芽增殖培养基上，放置于培养室中进行增殖培养，增殖培养的周期为50～60天，所述不定芽增殖培养基为：1/2MS+6-BA 0.8～1.0mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；所述增殖培养环境条件为：20～25℃,光照强度为30～40μmol·m^-2·s^-1，每天光照时间为16小时；

(4)组培苗壮苗和生根培养

待步骤(3)中不定芽的高度达到5～7mm时，将单个的不定芽切割下来，接种于组培苗壮苗和生根培养基上，放置于与步骤(3)相同的培养环境条件下培养，组培苗壮苗和生根培养周期为70～80天，所述组培苗壮苗和生根培养基为：1/4～1/2MS+活性炭1～2g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

进一步，所述消毒灭菌方式具体是用1％v/v的洗洁***对外植体进行表面清洁，然后放置于烧杯中，烧杯上覆盖纱布，用流动水冲洗2～2.5小时；再在无菌条件下，将外植体用消毒剂消毒灭菌12～15分钟，随后用无菌水冲洗5～6次，每次冲洗2～3分钟，即得到无菌外植体。

进一步，所述的消毒剂是浓度为0.1％w/v的HgCl₂溶液。

本发明的主要创新点及有益效果：

1、本发明成功构建了垫状卷柏组培繁殖技术。

本发明筛选出了垫状卷柏原生芽诱导培养基、不定芽增殖培养基以及组培苗壮苗和生根培养基，克服了垫状卷柏组培中的褐化问题，构建了垫状卷柏组培繁殖技术，填补了垫状卷柏组培繁殖技术的空白。

2、获得了较高的垫状卷柏组培繁殖效率，为垫状卷柏的规模化扩繁奠定了基础。

本发明不定芽的增殖率达8倍以上，在步骤(4)所述的组培苗壮苗和生根培养过程中的单个不定芽的再次增殖率达11倍以上，通过本发明构建的组培繁殖技术可以在170～175天内实现1个垫状卷柏幼嫩枝条尖端扩繁得到88株以上的组培苗，获得了较高的繁殖效率，为垫状卷柏的规模化扩繁奠定了良好的基础。

附图说明

图1是垫状卷柏幼嫩枝条尖端。图1中线段为比例尺，长度为5mm。

图2是垫状卷柏原生芽诱导培养。图2中线段为比例尺，长度为1cm。

具体实施方法

以下实施例便于更好地理解本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

以下各实施例培养基的制备方法为常规方法，即：按培养基配方所述各组分及其含量混合后，用pH计调节pH至该培养基要求的pH值，并进行培养基的常规消毒灭菌操作后即制成。

实施例1本发明方法

(1)无菌外植体的获得

选取野生垫状卷柏植株的幼嫩枝条尖端0.8～1.2cm作为外植体，用软毛刷蘸1％v/v的洗洁***对外植体进行表面清洁，然后放置于烧杯中，烧杯上覆盖纱布，用流动自来水冲洗2小时。在无菌条件下，将外植体用消毒剂消毒灭菌12分钟，随后用无菌水冲洗5次，每次冲洗3分钟，即得到无菌外植体。所述消毒剂是浓度为0.1％w/v的HgCl₂溶液。所述幼嫩枝条为垫状卷柏植株中心生长点向外数第2～3层的枝条。

(2)原生芽的诱导

将步骤(1)中获得的无菌外植体接种在原生芽诱导培养基上，放置于22℃培养室中进行暗培养，暗培养周期为42天，所述原生芽诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.1mg/L+NAA0.1mg/L+柠檬酸400mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

接种的外植体个数为30个，诱导培养结束后，对原生芽诱导率进行统计，原生芽诱导率(％)＝[诱导出原生芽的外植体数/接种的外植体总数]×100％。所述原生芽为无菌外植体潜在的芽原基经过在原生芽诱导培养基上的诱导培养抽生形成的芽。

(3)不定芽的增殖

将步骤(2)中获得的原生芽接种在不定芽增殖培养基上，放置于培养室中进行培养，增殖培养的周期为60天。所述不定芽增殖培养基为1/2MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。所述增殖培养的培养室环境条件为：22℃,光照强度为30～40μmol·m^-2·s^-1，每天光照时间为16小时。

接种的原生芽数量为30个，增殖培养结束后，对不定芽的增殖倍数进行统计，不定芽的增殖倍数＝原生芽增殖形成的不定芽总数/接种的原生芽总数。

(4)组培苗壮苗和生根培养

待步骤(3)中不定芽的高度达到5～7mm时，将单个的不定芽切割下来，接种于组培苗壮苗和生根培养基上，放置于与步骤(3)中相同的培养室环境条件(即22℃,光照强度为30～40μmol·m^-2·s^-1，每天光照时间为16小时)中进行培养，组培苗壮苗和生根培养的周期为70天。所述组培苗壮苗和生根培养基为：1/4MS+活性炭1g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80。

接种的不定芽数量为30个，组培苗壮苗和生根培养结束后，对单个不定芽在组培苗壮苗和生根培养过程中的再次增殖倍数、单株组培苗枝条平均数以及组培苗的平均根长进行统计，单个不定芽在组培苗壮苗和生根培养过程中的再次增殖倍数＝不定芽在组培苗壮苗和生根培养过程中增殖形成组培苗植株总数/接种的不定芽总数，单株组培苗枝条平均数(枝/株)＝组培苗的枝条总数/组培苗总数，组培苗平均根长为所有组培苗根长的平均数。

实施例2和实施例3均为本发明方法

实施例2和实施例3除表1所列措施不同外，其余措施均与实施例1相同，不再赘述。

表1实施例2和实施例3与实施例不同的措施

表2实施例1-3的繁殖效果

对照

对照为垫状卷柏野生植株在野外生境中的繁殖情况。

(1)观察对象：在野外同一生长区域内，选择长势一致的垫状卷柏2～3年生野生植株30株为观察群体。

(2)野外生境：裸露的石灰岩表面，土层极薄；旱季和雨季分明，年平均降水量约为600～800mm，其中，旱季降水量占10～12％；晴天正午光照强度为1700～2000μmol·m^-2·s^-1，阴天正午和雨天正午光照强度约为600～800μmol·m^-2·s^-1。

(3)观察周期：2年。

(4)数据统计：在观察期满第1年和满第2年时，对群体中的珠芽繁殖发生率和单个植株的珠芽繁殖后代数量进行统计。珠芽繁殖发生率(％)＝[观察群体中发生珠芽繁殖的植株数量/观察群体的植株总数]×100％，发生珠芽繁殖的植株是指单个植株上形成1个以上的珠芽。单个植株的珠芽繁殖后代平均数量＝发生珠芽繁殖植株的后代总数/发生珠芽繁殖的植株总数。

(5)垫状卷柏野外植株繁殖效果见表3。

表3垫状卷柏野外植株繁殖效果