酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
阅读说明：本技术 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺 (Process for preparing 2,4-diaminobutyric acid by enzyme catalysis method ) 是由 于铁妹 樊卫 林立峰 何平 潘俊锋 刘建 于 2019-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生化技术领域,公开了突酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺。本发明以L-天冬氨酸为起始,通过一系列的酶促反应生成天冬氨酸-4-磷酸、天冬氨酸半醛中间体,最后转化成目标产物2,4-二氨基丁酸；整个反应体系还可增加四种辅酶再生体系,降低ATP、NADPH、NADH以及丙氨酸的用量,有效推动该反应至高转化率。本发明反应体系多种酶催化反应相互不干扰,反应操作简便,其最终产品转化率高,如采用固定化酶方式则可进一步提高其工业应用可行性。(The invention relates to the technical field of biochemistry, and discloses a process for preparing 2,4-diaminobutyric acid by a mutase catalytic method. The method takes L-aspartic acid as an initial, generates an intermediate of aspartic acid-4-phosphoric acid and aspartic acid semialdehyde through a series of enzymatic reactions, and finally converts the intermediate into a target product of 2,4-diaminobutyric acid; the whole reaction system can also increase four coenzyme regeneration systems, reduce the dosage of ATP, NADPH, NADH and alanine, and effectively push the reaction to high conversion rate. The invention has the advantages of non-interference of a plurality of enzyme catalytic reactions of the reaction system, simple and convenient reaction operation, high conversion rate of the final product, and capability of further improving the industrial application feasibility of the product by adopting an immobilized enzyme mode.)
技术领域
本发明涉及生化技术领域，具体涉及酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺。
背景技术
2,4-二氨基丁酸是一种自然界中存在的一种非天然氨基酸，它是类似赖氨酸、鸟氨酸的二氨基氨基酸；其分子式为C4H10N2O2，分子量为118，CAS No:305-62-4。2,4-二氨基丁酸大量分布在植物，花、酵母及部分细菌中，它虽然不是蛋白质的基本组成，但其广泛参与多种天然多肽抗菌素的生物合成，如圈杆菌素(polypeptin)、柯密菌素(Comirin)、多黏菌素(Polymyxin)等等。2,4-二氨基丁酸同时也具有较高的工业应用价值，譬如它是生产蛇毒肽的基本原料(蛇毒肽是毒蛇蛇腺分泌的一种物质，具有镇痛、止血、抑制血栓形成及抗肿瘤等药理作用；蛇毒肽现被广泛应用在医美行业，是一种祛皱抗皱有效成份)，因而开发一种更为简便的、能批量生产2,4-二氨基丁酸的方法以降低其成本变得比较重要。
2,4-二氨基丁酸常用的制备方法有分离法及化学合成法。虽然自然界2,4-二氨基丁酸分布较广，但由于其丰度低、分子量小、水溶性大等特征导致其分离纯化非常困难；市面上大部分销售的2,4-二氨基丁酸是通过化学合成的方法制备的，比较经典的制备工艺利用L-天冬氨酸在叠氮化钠、浓硫酸及氯仿条件下直接转化成2,4-二氨基丁酸(最高收率能到90％，G.I.Tesser and J.W.Van Nispen,“NOTE ON THE PREPARATION Of L-2,4-DIAMINOBUTYRIC ACID,Synthetic communication,1971,1,285-287)，该工艺延续至今，然而由于该反应涉及多个有毒、易爆化学品，因而其规模化生产的安全风险非常大。在当今提倡安全、绿色生产的大环境下，寻找一种廉价的、环保的2,4-二氨基丁酸生产方法变得比较迫切。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，使得所述工艺转化收率高、目标产物浓度高、产物杂质残留低，纯化工艺简单。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，反应原料L-天冬氨酸、ATP或其盐、磷酸吡哆醛、丙氨酸、NADPH或其盐在pH值6.0-9.0的反应介质中，与天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH及转氨酶AMT进行酶催化反应，生成2,4-二氨基丁酸。
本发明针对目前的化学合成法的诸多缺陷，利用酶促反应技术提供了另外一种从L-天冬氨酸开始合成2,4-二氨基丁酸的工艺。L-天冬氨酸激酶(ASK,EC 2.7.2.4)，它能磷酸化L-天冬氨酸成L-天冬氨酸-4-磷酸；而天冬氨酸半醛氧化酶(ASADH,EC 1.2.1.11)则能在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH存在下将L-天冬氨酸-4-磷酸转化成L-天冬氨酸半醛；最后非专一性
其中，所述各酶以表达各酶的宿主细胞、各酶的酶液或各酶的固定化酶形式参与酶催化反应。
在本发明
具体实施方式
中，所述表达各酶的宿主细胞为含有表达各酶的载体的大肠杆菌；其具体的制备过程如下：
以提取的大肠杆菌(Escherichia coliK12)、斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)染色体、ATCC购买的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2 155,ATCC700084)、伯克霍尔德菌(Burkholderia multivorans,ATCC 17616)等染色体为模板，用各酶引物PCR扩增出ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH基因片段，然后进行相应酶切、酶连接到载体质粒上；
通过基因测序验证正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株中,于LB培养液中进行培养，然后IPTG条件下诱导表达,收集各酶的湿细胞。
更为具体地，所述载体质粒为市售的pET28a质粒，各酶扩增引物见表1：
表1
通过基因测序验证正确的质粒进而转入E.coli BL21(DE3)菌株中,在37℃、5ml含50uM卡那霉素(Kanamycin)的LB培养液中进行小量培养，当细胞生长至OD 0.5-0.8加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导蛋白表达4小时,最后收集细胞、冻融法进行细胞破碎、高速离心，收集到的上清液再利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达。蛋白表达正确的菌株逐级培养至5升发酵罐，在0.5mM IPTG条件下37℃诱导表达6小时,收集各酶的湿细胞。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾，1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
在本发明具体实施方式中，所述天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH及转氨酶AMT的序列依次如SEQ ID NO.1-3所示。
在本发明具体实施方式中，所述各酶的酶液为从表达各酶的宿主细胞中提取的酶液；方法为将所收集的湿细胞经过高压破碎、高速离心收集含粗蛋白的上清液，即为含酶的酶液，也可以对上清液进一步纯化。
作为优选，本发明还包括2,4-二氨基丁酸的纯化步骤：
过色谱柱除盐，然后阴离子交换树酯除去溶液中磷酸化合物，最后收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后重结晶。其中，所述色谱柱为G25色谱柱，去离子水做洗脱液；所述阴离子交换树酯为D201阴离子交换树酯；所述重结晶采用乙醇水溶液，乙醇和水的体积比优选为3:1。
作为优选，所述反应介质为三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)，更优选为100mMpH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)。同时，在酶催化反应过程中维持体系pH值为6-9，优选为6.5-8.5。
本发明反应中由于要用到辅酶三磷酸腺苷(ATP)及NADPH，通过引入ATP再生酶(PPK,EC 2.7.4.1)与多聚磷酸，NADP再生酶(PDH,EC 1.20.11.1)与亚磷酸就可以实现其循环利用，大大降低其使用量。转氨基酶(AMT)反应为平衡反应，通过在体系中引入甲酸铵、丙氨酸脱氢酶(ADH,EC 1.4.1.1)以及甲酸脱氢酶(FDH,EC 1.17.1.9)，在催化剂量的还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下可以循环再生丙氨酸，这不仅可以降低丙氨酸的用量，使其只需要催化剂量即可，还可以有效推动该转氨反应至高转化率。与此同时，通过将本发明所涉及的酶一次性或多次性进行固定化应用则可进一步提高其稳定性及规模化生产的可操作性。
因此，本发明所述工艺还包括向反应原料中添加多聚磷酸、亚磷酸或其盐、甲酸铵、氯化钾、氯化镁(氯化钾和氯化镁参与ATP再生酶PPK的反应)、NADH或其盐，以及添加ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH进行酶催化反应；本发明整体的反应原理示意图见图1。
在本发明中，所述ATP的盐为ATP钠盐，如三磷酸腺苷二钠盐；所述NADPH盐为NADPH钠盐，如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐；所述NADH盐为NADH钠盐，如还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐；所述亚磷酸盐为亚磷酸钠盐，如亚磷酸钠；各物质的盐均可提供ATP、NADPH、NADH以及亚磷酸。
在本发明具体实施方式中，所述ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH的序列依次如SEQ ID NO.4-7所示。
按照本发明工艺制备2,4-二氨基丁酸，纯品最终收率可达70％以上，最高可达到87％，接近化学合成方法的收率，但相比经典的化学合成方法更加安全、环保和低成本。
由以上技术方案可知，本发明以L-天冬氨酸为起始，通过一系列的酶促反应生成天冬氨酸-4-磷酸、天冬氨酸半醛中间体，最后转化成目标产物2,4-二氨基丁酸；整个反应体系还可增加四种辅酶再生体系，降低ATP、NADPH、NADH以及丙氨酸的用量，有效推动该反应至高转化率。本发明反应体系多种酶催化反应相互不干扰，反应操作简便，其最终产品转化率高，如采用固定化酶方式则可进一步提高其工业应用可行性。
附图说明
图1所示为本发明反应原理示意图。
具体实施方式
本发明公开了酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明工艺已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文工艺进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述工艺的步骤旨在清楚的描述核心的反应路线，并不限制整个反应采用一步法还是多步法进行。
本发明所采用的各酶可以根据序列进行人工合成，也可按照本发明提供的方法通过质粒载体搭载各酶表达基因，借助宿主细胞诱导表达。
在进行固定化时，可参照本领域常规的固定化酶制备方式，在本发明具体实施方式中，本发明利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH、FDH粗酶以活力比1：2.2:4.5:2.5:4.0:6.0:5.0进行一次性混合固定，其固定方法如下:2000-4000U混合酶溶解在1L25mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入25-65mM苯氧乙酸以及300-500克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液,室温搅拌4-8小时后过滤出固定化酶,最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温保存待用；固定化混合酶分别具有液体酶的30-70％的活性。
依照本发明工艺的反应路线，各反应物质的用量可以根据实际情况调整，为了最大效率化，本发明提供了如下各反应物质的摩尔比：
L-天冬氨酸、多聚磷酸、ATP、丙氨酸、亚磷酸、氯化镁、氯化钾、甲酸铵、NADPH、ASK、ASADH、AMT、NADH、PPK、PDH、ADH、FDH、PLP＝1:(1.1)：(0.02):(0.02):(1.1):2:5:(1.1):(0.02):(0.0002):(0.0003):(0.0005):(0.02):(0.001):(0.0005):(0.001):(0.0015):(0.00005)；
在本发明具体实施方式中，各酶以湿细胞方式参与酶催化反应时，按照12克:24克：48克：24克:48克:60克:48克的比例加入过量表达ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶的湿细胞；
各酶以含酶液方式加参与酶催化反应时，ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶液以1:2:4:2:4:6:4体积比混合后一次性加入；
各酶以固定化酶方式加参与酶催化反应时，参照上述固定化方法中的比例。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：湿细胞一锅法催化生产2,4-二氨基丁酸
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入6.65克L-天冬氨酸(50mM),1.1克三磷酸腺苷二钠盐ATP(2mM)、5.7克多聚磷酸(Sigma,25聚,55mM单磷酸)、0.9克氯化镁(10mM)、0.75克氯化钾(10mM)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐0.76克(1.0mM)、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐0.71克(1.0mM)、亚磷酸钠6.8克(55mM)、甲酸氨3.8克(60mM)、丙氨酸89毫克(1mM)、磷酸吡哆醛0.7毫克(0.0025mM),待pH值调节到8.0后，以12克:24克：48克：24克:48克:60克:48克的比例加入过量表达ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶的湿细胞。反应过程中通过加入低浓度的HCl及NaOH水溶液维持反应体系pH 6.0-9.0之间，30℃轻微搅拌6小时后直接离心(8000rpm,12min)除去含酶细胞，反应清液通过G25色谱柱除盐(去离子水做洗脱液)，D201阴离子交换树酯(晶祥化工)除去溶液中含磷酸化合物(各种腺苷,NAD及NADP),最后收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后用乙醇及水重结晶(3:1v/v)得白色固体4.9克纯2,4-二氨基丁酸钠(最终收率70％)。
纯化后2,4-二氨基丁酸在600M Varian D2O溶液中核磁谱图结果数据：
1H-NMR:2.04(m,2.0H),2.65(t,2.0H),3.49(t,1.0H)；
13C-NMR:174.7(COOH),52.9(CH),37.5(CH2),28.9(CH2).
实施例2：液体酶一锅法催化生产2,4-二氨基丁酸
收集的含天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH、转氨基酶AMT、ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH细胞混合在20倍体积的25mMTris pH 8.0的缓冲液(缓冲液A)里，然后经过高压破碎、高速离心(16000rpm,45min)收集含粗蛋白的上清液,该酶粗液直接进行下一步反应制备2,4-二氨基丁酸。
与实施例1类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入26.6克L-天冬氨酸(200mM),1.1克三磷酸腺苷二钠盐ATP(2mM)、22.8克多聚磷酸(Sigma,25聚,220mM单磷酸)、0.9克氯化镁(10mM)、0.75克氯化钾(10mM)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐1.5克(2.0mM)、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐1.4克(2.0mM)、亚磷酸钠27克(220mM)、甲酸氨15.5克(240mM)、丙氨酸0.35克(4mM)、磷酸吡哆醛2.8毫克(0.01mM),待pH值调节到8.0后，ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH以及FDH酶液以1:2:4:2:4:6:4混合后一次性加入，通过酸碱调节维持反应液pH值在6.5-8.5,30℃轻微搅拌4小时后直接加酸调节反应液pH值到1.5。充分搅拌、离心除去酶沉淀；调节反应清液至pH7.5,然后依据上述方法通过G25色谱柱除盐，D201阴离子交换树酯除含磷酸化合物,最后冻干结晶得24.3克白色固体(收率87％)。
纯化后2,4-二氨基丁酸在600M Varian D2O溶液中核磁谱图结果数据：
1H-NMR:2.04(m,2.0H),2.65(t,2.0H),3.49(t,1.0H)；
13C-NMR:174.7(COOH),52.9(CH),37.5(CH2),28.9(CH2).
实施例3：固定化酶一锅法催化生产2,4-二氨基丁酸
收集的含天冬氨酸激酶ASK、天冬氨酸半醛氧化酶ASADH、转氨基酶AMT、ATP再生酶PPK、NADP再生酶PDH、丙氨酸脱氢酶ADH以及甲酸脱氢酶FDH细胞混合在20倍体积的25mMTris pH 8.0的缓冲液(缓冲液A)里，然后经过高压破碎、高速离心(16000rpm,45min)收集含粗蛋白的上清液，往溶液中逐量加入硫酸铵固体直至其洗出(35％-55％,w/v硫酸铵/缓冲液)。该酶固体通过离心(10000rpm,12min)收集后慢慢溶入10倍体积的缓冲液A里,经过G25尺寸排阻色谱柱购于Sigma)除盐以DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离后得到初纯化酶液，以上ASK、ASADH、AMT、PPK、PDH、ADH、FDH粗酶以活力比1：2.2:4.5:2.5:4.0:6.0:5.0混合,然后利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行一次性混合固定,其方法如下:2000-4000U混合酶溶解在1L 25mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入25-65mM苯氧乙酸以及300-500克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液,室温搅拌4-8小时后过滤出固定化酶,最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温保存待用；固定化混合酶分别具有液体酶的30-70％的活性。
与前述实施例1和实施例2类似，在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入13.3克L-天冬氨酸(100mM),1.1克三磷酸腺苷二钠盐ATP(2mM)、11.4克多聚磷酸(Sigma,25聚,110mM单磷酸)、0.9克氯化镁(10mM)、0.75克氯化钾(10mM)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH单钠盐0.76克(1.0mM)、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH二钠盐0.71克(1.0mM)、亚磷酸钠13.5克(110mM)、甲酸氨7.6克(120mM)、丙氨酸0.17克(2mM)、磷酸吡哆醛1.4毫克(0.005mM),待pH值调节到8.0后，2000-4000U固定化混合酶启动反应，反应过程中通过HCl及NaOH水溶液维持pH 6.5-8.5之间，反应液在30℃搅拌5小时后直接过滤固定化酶终止反应，其回收的固定化酶具有40-75％初始活力,过滤的2,4-二氨基丁酸粗溶液通过G25色谱柱除盐，D201阴离子交换树酯除含磷酸杂质,收集的2,4-二氨基丁酸粗品经冻干后用重结晶得白色固体11克(最终收率79％)(活性单位U代表30℃每分钟转化1μM底物所需要的酶量)。
1H-NMR:2.04(m,2.0H),2.65(t,2.0H),3.49(t,1.0H)；
13C-NMR:174.7(COOH),52.9(CH),37.5(CH2),28.9(CH2).
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳瑞德林生物技术有限公司
<120> 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
<130> S19P2064
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 820
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile
50 55 60
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln
85 90 95
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu
290 295 300
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala
515 520 525
Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala
725 730 735
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp
785 790 795 800
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
805 810 815
Lys Leu Gly Val
820
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro
20 25 30
Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly
35 40 45
Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys
50 55 60
Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu
65 70 75 80
Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp
85 90 95
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp
100 105 110
Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg
115 120 125
Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu
130 135 140
Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr
180 185 190
Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
210 215 220
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225 230 235 240
Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser
245 250 255
Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg
260 265 270
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<211> 438
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Gly Ala Tyr Tyr Thr Asp Ala Glu Gly Arg Lys Ile Phe Asp Gly Leu
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Ala Ala Asp Thr Ser Leu Lys Met Ala Arg Ala Tyr Trp Arg Ala
115 120 125
Lys Gly Lys Gly Thr Lys Thr Arg Leu Ile Gly Arg Glu Lys Gly Tyr
130 135 140
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145 150 155 160
Arg Lys Leu Phe Gly Gln Gly Leu Asp Ala Asp Phe Leu Pro His Thr
165 170 175
Gln Leu Ala Glu Asn Lys Phe Ser Arg Gly Met Pro Glu Arg Gly Ala
180 185 190
Glu Leu Ala Asp Arg Leu Leu Asp Leu Ile Ala Leu His Asp Ala Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Ile Met Asn Phe Ala Lys Gln Val Thr Asn Gly Val Gln Pro Leu Gly
275 280 285
Gly Val Val Ala Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Thr Phe Met Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Pro Glu Tyr Met Leu Glu Phe Pro His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala
305 310 315 320
His Pro Val Ala Cys Ala Ala Gly Val Ala Ala Leu Asp Leu Leu Val
325 330 335
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340 345 350
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115 120 125
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Arg Leu Ile Ala Arg Leu Asp Asp Pro Ser Lys His Trp Lys Tyr Ser
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Arg Gly Asp Leu Ala Glu Arg Ala Tyr Trp Asp Asp Tyr Met Asp Ala
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Val Val Pro Ala Asn Lys Lys Trp Tyr Ala Arg Ile Ala Val Gln Gln
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Leu Leu Leu Asp Ala Leu Gly Gly Leu Gln Leu Asp Trp Pro Lys Ala
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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195 200 205
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225 230 235 240
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705 710 715
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