具体实施方式

定义

以下定义和缩写将用于解释本公开。

如本文和所附权利要求中所使用，除非上下文另有明确规定，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数所指对象。因此，例如，提及“一种酶”包括多个这样的酶以及提及“该微生物”包括提及一个或多个微生物等。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包括(comprising)”、“含有(include)”、“含(including)”、“具有(has)”、“有(having)”、“涵盖(contain)”、“包涵(containing)”或其任何其它变体旨在涵盖非排它性包含。包含一系列元素的组合物、混合物、过程、方法、物品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的其它元素或此类组合物、混合物、过程、方法、物品或设备所固有的元素。此外，除非另有明确说明，否则“或”指的是包含性的“或”，而不是排它性的“或”。

在此用于修饰数值的术语“约(about)”和“大约(around)”表示围绕该明确值的接近范围。如果“X”是这个值，“约X”和“大约X”将指从0.9X到1.1X的值，或在一些实施方案中，从0.95X到1.05X的值。对“约X”或“大约X”的任何提及至少明确表示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、和1.05X。因此，“约X”和“大约X”旨在教导和为例如“0.98X”的权利要求限制提供书面描述支持。

如本文所用，术语“微生物(microbial)”、“微生物有机体(microbial organism)”和“微生物体(microorganism)”包括作为微观细胞存在的任何生物体，其包含在古细菌、细菌或真核生物范围内，所述真核生物包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻或高等原生生物。因此，该术语旨在涵盖具有微观尺寸的原核细胞、或真核细胞、或生物体，以及包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物，例如酵母和真菌。还包括可以被培养以用于生产化学品的任何物种的细胞培养物。

如本文所述，在一些实施方案中，所述重组微生物是原核微生物。一些实施方案中，所述原核微生物是细菌。“细菌(Bacteria)“或“真细菌(eubacteria)”指的是原核生物范围。细菌至少包括以下十一个不同的组：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中主要有两大亚组(subdivisions)：(1)高G+C组(放线菌、分枝杆菌、微球菌等)、(2)低G+C组(芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、乳杆菌、葡萄球菌、链球菌、支原体)；(2)变形菌，例如紫色光合+非光合革兰氏阴性菌(包括大多数“常见”革兰氏阴性菌)；(3)蓝藻菌，例如含氧光养生物；(4)螺旋体及相关物种；(5)浮霉状菌(Planctomyces)；(6)拟杆菌、黄杆菌；(7)衣原体；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光养生物)；(10)抗辐射微球菌及其相关；(11)栖热袍菌(Thermotoga)和热虹吸管嗜热菌(Thermosipho thermophiles)。

“革兰氏阴性菌”包括球菌、非肠杆菌和肠杆菌。革兰氏阴性菌的属包括，例如奈瑟氏菌属、螺旋菌属、巴氏杆菌属、布鲁氏菌属、耶尔森氏菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、拟杆菌属、醋杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、农杆菌属、固氮菌属、螺旋菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、根瘤菌属、衣原体属、立克次体属、密螺旋体属和梭杆菌属。

“革兰氏阳性菌”包括球菌、非孢子杆菌和孢子杆菌。革兰氏阳性菌的属包括，例如放线菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属、丹毒杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、分枝杆菌属、粘球菌属、诺卡氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。

术语“重组微生物(recombinant microorganism)”和“重组宿主细胞(recombinant host cell)”在本文中可互换地使用以及指已经经过基因修饰用以表达或过表达内源酶、用以表达异源酶的微生物，例如在载体中、在整合构建体中包含的那些酶，或内源基因的表达改变的那些酶。“改变”是指基因的表达、或编码一种或多种多肽或多肽亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种多肽或多肽亚基的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在没有改变的情况下所观察到的。应理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅指特定的重组微生物，而且指此类微生物的后代或可能后代。

与基因序列相关的术语“表达”是指基因的转录，以及在适当情况下将所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，从上下文可以清楚地看出，蛋白质的表达是由开放阅读框序列的转录和翻译所得。可基于细胞中存在的相应mRNA的量、或由所选序列编码的所需产物的量来确定宿主细胞中所需产物的表达水平。例如，从选择的序列转录的mRNA可以通过qRT-PCR或Northern杂交进行定量(参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。可以通过各种方法定量由选择的序列编码的蛋白质，例如通过ELISA、通过测定蛋白质的生物活性、或通过使用不依赖于这种活性的测定，例如，蛋白质印迹或放射免疫测定，使用识别并结合蛋白质的抗体。参见Sambrook等人，1989，同上。

术语“减少(decreasing)”或“降低(reducing)”基因的表达水平或酶活性是指部分或完全抑制基因的表达或酶活性。这种表达或活性的抑制可以是抑制基因表达、删除基因表达所需的全部或部分启动子区域、删除基因编码区域、或由较弱的天然或合成启动子取代野生启动子。例如，可以完全删除基因以及可以用选择标记物基因取代基因，以促进鉴定、分离和纯化根据本发明的菌株。或者，可以敲除或删除内源基因以有利于新的代谢途径。在又一个实施方案中，可以通过使用弱启动子或通过引入某些突变来降低或减少基因的表达。

如本文所用，术语“非天然存在的”当用于指本公开的微生物体或酶活性时，旨在表示该微生物体或酶具有在参考物种中天然存在的菌株(包括参考物种的野生型菌株)中的不常发现的至少一种基因改变。基因改变包括，例如引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸添加、核酸删除和/或微生物遗传物质的其它功能破坏。此类修饰包括，例如，用于参考物种的异源、同源或异源和同源多肽的编码区及其功能片段。其它的修饰包括，例如，非编码调控区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性的非天然存在的微生物或酶活性包括上述羟基化活性。

如本文所用的关于各种分子(例如多核苷酸、多肽、酶等)的术语“外源的”是指不是在自然界中给定的酵母、细菌、生物体、微生物或细胞中通常或天然存在的分子和/或由其产生的分子。

另一方面，如本文所用的关于各种分子，例如多核苷酸、多肽、酶等的术语“内源的”或“天然的”是指是在自然界中给定的酵母、细菌、生物体、微生物或细胞中通常或天然存在的分子和/或由其生产的分子。

本文在修饰宿主细胞的上下文中使用的术语“异源的”是指各种分子，例如多核苷酸、多肽、酶等，其中以下的至少一项是正确的：(a)分子对于宿主细胞而言是外来的(“外源的”)(即，不是天然存在于宿主细胞中)；(b)分子天然存在(例如，“内源性”)于给定的宿主微生物或宿主细胞中，但在细胞中非天然位置产生或在细胞中以非天然的量产生；和/或(c)分子在核苷酸或氨基酸序列上与内源性核苷酸或氨基酸序列不同，使得与内源性核苷酸或氨基酸在核苷酸或氨基酸序列上不同的分子在细胞中以非天然的(例如，大于天然存在的)量产生。多核苷酸的异源表达可通过以下实现：将一种或多种包含目的基因的载体(例如，质粒、粘粒、病毒载体等)引入宿主微生物、或通过将包含目的基因的构建体整合到宿主微生物的基因组中。

如本文所用的术语，关于第一科或种的原始酶或基因的“同源物”是指第二科或种的不同酶或基因，通过功能、结构或基因组分析确定其为与第一科或种的原始酶或基因相对应的第二科或种的酶或基因。同源物通常具有功能、结构或基因组相似性。使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物的技术是已知的。可以使用基因的功能测定和/或基因组作图来确认克隆序列与同源物的同一性。

如果基因编码的氨基酸序列与第二个基因所编码的氨基酸序列具有相似的氨基酸序列，则该蛋白质与第二个蛋白质具有“同源性”或与第二个蛋白是“同源的”。或者，如果两个蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则蛋白质与第二个蛋白质具有同源性。因此，术语“同源蛋白质”旨在表示两个蛋白质具有相似的氨基酸序列。在某些情况下，两个蛋白质之间的同源性表明其具有与进化相关的共同祖先。术语“同源序列”或“同源物”被认为、相信或已知在功能上是相关的。功能关系可以通过多种方式中的任何一种来表示，包括但不限于：(a)序列同一性的程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，指(a)和(b)两者。序列同一性的程度可以变化，但在一个实施方案中，(当使用本领域已知的标准序列比对程序时)序列同一性是至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少98.5％、或至少约99％、或至少99.5％、或至少99.8％、或至少99.9％。可以使用本领域中容易获得的软件程序来确定同源性，例如在Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编，1987)增刊30，节7.718，表7.71中讨论的那些。一些比对程序是MacVector(Oxford Molecular Ltd,牛津，英国)和ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,宾夕法尼亚州)。其它非限制性比对程序包括Sequencher(Gene Codes,安娜堡，密歇根)、AlignX、和Vector NTI(Invitrogen,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)。相似的生物学功能可包括、但不限于：催化相同或相似的酶促反应；对底物或辅因子具有相同或相似的选择性；具有相同或相似的稳定性；对各种发酵条件(温度、pH值等)具有相同或相似的耐受性；和/或对各种代谢底物、产物、副产物、中间体等具有相同或相似的耐受性。生物学功能的相似程度可以变化，但在一个实施方案中，根据本领域技术人员已知的用于确定给定生物学功能的一种或多种测定，生物学功能的相似程度为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少98.5％、至少约99％、或至少99.5％、或至少99.8％、或至少99.9％。

术语“变体”指本文所述的任何多肽或酶。变体还包括多聚体的一个或多个组分、包含单独组分的多聚体、包含多个单独组分的多聚体(例如，参考分子的多聚体)、化学分解产物和生物分解产物。在具体的非限制性实施方案中，由于编码参考酶的多肽序列的任何部分的改变，酶可以是相对于参考酶的“变体”。在用于测量参考酶制剂的酶活性的标准测定中，参考酶的变体可具有至少10％、至少30％、至少50％、至少80％、至少90％、至少100％、至少105％、至少110％、至少120％、至少130％或更多的酶活性。在一些实施方案中，变体还可以指与本公开的全长、或未加工的酶具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，变体还可以指与本公开的成熟、或加工过的酶具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

如本文所用，术语“产率潜力”是指来自生物合成途径的产物的产率。在一个实施方案中，产率潜力可以表示为每重量的起始化合物的终产物重量的百分比。

如本文所用，术语“热力学最大产率”是指基于产物与原料相比的能量值，从发酵给定原料(如葡萄糖)获得的产物的最大产率。例如，在正常发酵中，如果不使用额外的能量来源(例如光、氢气、或甲烷、或电力)，产物所含的能量不会超过原料。热力学最大产率表示来自原料的所有能量和质量都转化为产物的产物产率。可以计算该产率并且该产率与特定途径无关。如果产物的特定途径的产率低于热力学最大产率，则该特定途径会损失质量，并且很可能该特定途径被改进或被替换为更有效的产物途径。

术语“氧化还原平衡”是指在一组给定的反应中氧化还原辅因子的总量。氧化还原辅因子短缺时，因为需要燃烧原料来满足辅因子需求，所以氧化还原平衡为负，这种途径的产率将是不现实的。当氧化还原辅因子过剩时，氧化还原平衡被认为是正的，这种途径的产率低于最大产率(Dugar等人，“Relative potential of biosynthetic pathways forbiofuels and bio-based products”Nature biotechnology 29.12(2011):1074)。此外，当该途径生产的与其消耗的氧化还原辅因子数量相同时，所述氧化还原平衡为零，可以将该途径称为“氧化还原平衡”。与不平衡的途径相比，设计的代谢途径和工程化的生物体使得氧化还原辅因子平衡或接近平衡通常会导致所需化合物更有效、更高产率的生产。因为两个半反应(一个是氧化反应，另一个是还原反应)同时发生，所以氧化还原反应总是同时发生。在氧化还原过程中，还原剂将电子转移给氧化剂。因此，在反应中，还原剂或还原试剂失去电子被氧化，氧化剂或氧化试剂获得电子被还原。在一个实施方案中，氧化还原反应发生在生物系统中。术语氧化还原状态通常用于描述生物系统(例如，微生物细胞)中天然或非天然代谢途径的NAD+/NADH和NADP+/NADPH的平衡。氧化还原状态反映在几组代谢物(例如，乳酸和丙酮酸、β-羟基丁酸和乙酰乙酸)的平衡中，其相互转化取决于这些比率。在一个实施方案中，外部氢或电子源与能够将氢转化为NAD(P)H的氢化酶组合使用或不组合使用时，可能有益于增加具有负氧化还原平衡(即当氧化还原辅因子(例如NAD(P)H)短缺时)的代谢途径中的产物产率。

背景介绍

乙醛酸支路(GS)(也称为乙醛酸循环)是三羧酸循环(TCA循环)的一种变异，是一种在植物、细菌、原生生物和真菌中发生的合成代谢途径。TCA循环与乙醛酸支路的不同之处在于，在乙醛酸支路中，异柠檬酸被异柠檬酸裂解酶切割(cleave)为乙醛酸和琥珀酸，而不是脱羧和脱氢为α-酮戊二酸。这绕过在TCA循环中发生的两个脱羧步骤，允许乙酰辅酶A转化为TCA循环中间体而没有碳损失。乙醛酸通过并入乙酰辅酶A分子转化为苹果酸。

美国专利号9,034,615中描述了使用乙醛酸支路(GS)途径生产乙醇酸，通过引用该专利整体并入本文。该专利公开通过减弱乙醛酸消耗途径并增加NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶的活性来生产GA。美国专利第8,945,888号；美国授权前公布号2014/0295510；和PCT公开号WO 2016/193540也公开乙醛酸支路途径用于生产乙醇酸的用途，这些专利全部内容通过引用并入本文。然而，乙醛酸支路途径具有0.84g_GA/g_葡萄糖的减少的总产率潜力，而葡萄糖→GA转化的热力学最大产率为1.70g/g。该途径也不是氧化还原平衡的，并且对于每摩尔消耗的葡萄糖具有高度过量的4mol NADH和2mol醌醇，所有这些都需要重新氧化才能使细胞存活。该途径的整体化学计量和产率潜力可概括如下：葡萄糖->2GA+2CO₂+4NADH+2醌醇+2ATP；y＝0.84g/g，Y(max)＝1.70g/g，y是Y(max)的49％。

通过基于戊糖衍生物到乙醇醛的途径生产GA的描述见于PCT公开号WO 2017/059236和WO 2016/79440、以及美国授权前公开号US 2016/0076061和US 2015/0147794，其全部内容通过引用并入本文。然而，这些途径还具有减少的总产率潜力。例如，使用木糖作为来源的GA生产具有1.01g_GA/g_木糖的降低的产率潜力，而木糖→GA转化的热力学最大产率为1.71g/g。基于木糖途径的整体化学计量和产率潜力可概括如下：木糖->2GA+1CO₂+3NADH+1醌醇+0ATP；y＝1.01g/g、Y(max)＝1.71g/g、y是Y(max)的59％。从该等式可以看出，基于木糖的途径还生产过量的NADH和CO₂。

PCT公开号WO 2015/181074(整体通过引用并入本文)公开了一种生产D-赤藓糖和随后将D-赤藓糖转化为乙醇醛的方法。乙醇醛可以进一步转化为乙醇酸和/或甘氨酸。该途径具有1.27g_GA/g_葡萄糖的降低的产率潜力，而热力学最大产率为1.70g/g。基于赤藓糖途径的整体化学计量和产率潜力可概括如下：葡萄糖->3GA+2NADH+1醌醇-1ATP、y＝1.27g/g、Y(max)＝1.70g/g、y是Y(max)的75％。该途径也不是氧化还原平衡的，并且对于每摩尔消耗的葡萄糖具有高度过量的2mol NADH和1mol醌醇，所有这些都需要重新氧化才能使细胞存活。

美国专利号8,911,978中描述丝氨酸/羟基丙酮酸途径用于GA生产，该专利全部内容通过引用并入本文。

所有这些途径生产过量的NADH和释放过量的CO₂，即这些途径并没有达到热力学上可能的最大产率。它们通常将比所需多的糖碳氧化成CO₂，从而降低产品产率。

本申请涉及生产乙醛酸的重组微生物，其具有一种或多种生物合成途径以用于生产乙醇酸(GA)和/或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的生产乙醛酸的重组微生物包括基于逆向乙醛酸支路的路线(route)，所述路线增加了GA和甘氨酸的产率。在另一个实施方案中，本发明的生产乙醛酸的重组微生物包括之前描述的用于生产GA和/或甘氨酸的代谢途径和修饰、以及进一步增加GA和甘氨酸产率的基于逆向乙醛酸支路的路线。术语“乙醇酸(glycolic acid)”和“乙醇酸(glycolate)”在本公开的全文中可互换的使用。

某些专利文件公开了逆向乙醛酸支路途径。例如，美国专利号9,410,131公开了用于生产草酰乙酸和丙二酰辅酶A的逆向乙醛酸支路途径。美国授权前公开号2016/369292公开了用于生产异柠檬酸和乙酰辅酶A的逆向乙醛酸支路的用途。EP专利号2738247B1公开了用于生产乙酰辅酶A的逆向乙醛酸支路的用途。然而，这些专利文件都没有公开用于增加乙醛酸的生产并随后增加乙醇酸和/或甘氨酸的生产的逆向乙醛酸支路。此外，这些专利文件都没有公开一种逆向乙醛酸支路，其中由苹果酰辅酶A裂解酶的活性生成的乙酰辅酶A被重新并入代谢途径中(例如，通过在乙醛酸支路中与草酰乙酸组合生产柠檬酸)，用于增加乙醇酸和/或甘氨酸的生产。

本公开首次提供用于GA或甘氨酸生产的碳固定路线，使其成为适用于大多数当前具有CO₂和NADH过量的GA和甘氨酸途径的共同途径。通过提供合适的共同途径，本公开解决迄今为止描述的所有乙醇酸(GA)和甘氨酸途径中NADH过量的问题，并且能够实现比之前描述的单独途径(包括最近公布的使用木糖的高产率途径)更高的GA和甘氨酸产率。

本公开首次提供利用羧化反应用以生产GA和甘氨酸的逆向乙醛酸支路途径。迄今为止所描述的GA或甘氨酸生产途径都没有利用羧化反应来合成GA或甘氨酸。

在某些实施方案中，本公开的基于羧化的逆向乙醛酸支路途径可以与已知的GA或甘氨酸生产途径协同使用。

本公开内容包括使用本文所述的基因、和/或由这些基因编码的酶的同源物、以及天然变体、或工程化的变体。

本发明的微生物、途径和方法

在一个实施方案中，本发明提供一种生产乙醛酸的重组微生物，其使用逆向乙醛酸支路途径从乙醛酸生产乙醇酸和/或甘氨酸。逆向乙醛酸支路途径的表达增加作为中间体的乙醛酸的生产以及增加终产物乙醇酸和甘氨酸的生产。在一些实施方案中，本发明的生产乙醛酸的重组微生物共同生产乙醇酸和甘氨酸。在另一个实施方案中，本发明的生产乙醛酸的重组微生物共同生产乙醇酸和另一种副产品，例如，但不限于琥珀酸或乳酸。在又一个实施方案中，本发明的生产乙醛酸的重组微生物共同生产甘氨酸和另一种副产品，例如，但不限于琥珀酸或乳酸。

在一些实施方案中，本公开提供用于合成乙醇酸和/或甘氨酸的生产乙醛酸的重组微生物，其中所述微生物包含：(a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；(b)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；和(c)编码苹果酰辅酶A裂解酶的基因，该酶催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A，其中由苹果酰辅酶A裂解酶生产的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物合成。

在一些实施方案中，本公开提供用于合成乙醇酸和/或甘氨酸的生产乙醛酸的重组微生物，其中所述微生物包含：(a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；(b)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶生产的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物合成。在这些实施方案中，该重组微生物具有降低的磷酸葡萄糖异构酶活性，或更优选地不通过酶磷酸葡萄糖异构酶催化葡萄糖-6-磷酸向果糖-6-磷酸转化。此外，该重组微生物可以包含、或不包含过表达的内源性或外源性酶：柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶和/或乙醛酸还原酶。通过降低磷酸葡萄糖异构酶的活性，或更优选地通过删除编码磷酸葡萄糖异构酶的基因(例如，大肠杆菌中的基因pgi)，该酶催化葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸，碳源可以至少部分转向戊糖-磷酸途径(PPP)，以提供乙醛酸最佳转化为乙醇酸可能所需的额外NADPH。在一些实施方案中，通过使用本文所建议的羧化酶和羧激酶，有可能重新并入通过PPP路线生成的CO₂。

在一个实施方案中，本公开的基于逆向乙醛酸支路的途径包括将丙酮酸羧化为苹果酸；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(CoA)以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。因此，在一个实施方案中，本文提供一种重组微生物，其包含编码将丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因、编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、和编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。在一个实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的基因编码修饰的苹果酸脱氢酶，该酶催化丙酮酸向苹果酸的转化，但不催化苹果酸向丙酮酸的逆向反应或显示苹果酸向丙酮酸的转化降低。在一些实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的基因可包含删除或功能丧失突变。修饰的苹果酸脱氢酶可以是天然存在的变体、或工程化的变体。

在另一个实施方案中，本公开的基于逆向乙醛酸支路的途径包括将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和/或丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)；将OAA转化为苹果酸；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(辅酶A)、以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。因此，在一个实施方案中，本文提供一种重组微生物，其包含以下基因：编码将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因与编码苹果酸脱氢酶(该酶催化将OAA转化为苹果酸)的基因组合、编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、和编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。

在另一个实施方案中，本公开的基于逆向乙醛酸支路的途径包括将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)、和/或将丙酮酸羧化为苹果酸；将OAA转化为苹果酸；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(辅酶A)、以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。因此，在一个实施方案中，本文提供一种重组微生物，其包含以下基因：编码将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；和/或编码催化将丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶基因；和/或编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶基因；编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；和编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。在一个实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的基因编码修饰的苹果酸脱氢酶，该酶催化丙酮酸向苹果酸、或OAA向苹果酸的转化，但不催化苹果酸向丙酮酸、或苹果酸向OAA的逆反应，或显示苹果酸向丙酮酸或苹果酸向OAA的转化降低。修饰的苹果酸脱氢酶可以是天然存在的变体、或工程化的变体。

在另一个实施方案中，本公开的基于逆向乙醛酸支路的途径包括将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和/或丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(辅酶A)以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A；其中逆向乙醛酸支路途径不包括将OAA转化为苹果酸。因此，在一个实施方案中，本文提供一种重组微生物，其包含以下基因：编码将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因，和编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中该微生物不包含编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，或者在编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因中包含功能丧失突变。

在另一个实施方案中，本公开的基于逆向乙醛酸支路的途径包括将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和/或丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)；将丙酮酸羧化为苹果酸；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(辅酶A)以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A；其中逆向乙醛酸支路途径不包含将OAA转化为苹果酸。因此，在一个实施方案中，本文提供一种重组微生物，其包含以下基因：编码将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码催化将丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶基因；编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因，和编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中该微生物不包含编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，或者在编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因中包含功能丧失突变。

逆向乙醛酸支路和其它途径生产的乙醛酸可以转化为乙醇酸和/或甘氨酸。为了增加GA的生产，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可包含编码NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶的基因，该酶催化乙醛酸转化成乙醇酸。在一个实施方案中，重组微生物可以过表达NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶以增加GA的产率。在另一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可包含在编码NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶的基因中的功能获得性突变，以使得NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶活性与缺少该突变的微生物相比是增加的。

本文所用的术语“NAD(P)H依赖性的”包括NADH依赖性的以及NADPH依赖性的酶活性。

为了增加甘氨酸的生产，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可包含一种或多种编码催化乙醛酸向甘氨酸转化的酶的基因。例如，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可包含以下基因：编码丙氨酸-乙醛酸转氨酶的基因、编码甘氨酸脱氢酶的基因、编码甘氨酸转氨酶的基因、编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因、和/或编码甘氨酸氧化酶的基因。在一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可过表达这些基因中的一种或多种以增加甘氨酸的产率。在另一个实施方案中，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可包含在一种或多种上述编码生产甘氨酸的酶的基因中的功能获得性突变，以使得这些基因的活性与缺少该突变的微生物相比是增加的。

在一个实施方案中，本公开的重组微生物不通过rGS途径产生丙二酰辅酶A。

本发明的重组微生物包含编码苹果酸脱氢酶的基因，该酶催化丙酮酸羧化为苹果酸和/或催化将OAA还原为苹果酸。在一个实施方案中，催化OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶来自但不限于酶类(E.C.)1.1.1.37。在另一个实施方案中，催化苹果酸转化为OAA的苹果酸脱氢酶来自EC 1.1.5.4。催化苹果酸转化为OAA的苹果酸脱氢酶也称为苹果酸：醌醇氧化还原酶。在某些实施方案中，催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶来自但不限于酶类(E.C.)1.1.1.38、E.C.1.1.1.39、或E.C.1.1.1.40。

在一个实施方案中，本公开的重组微生物可包含编码苹果酸脱氢酶的基因，其中该苹果酸脱氢酶可以催化丙酮酸转化为苹果酸和/或催化将OAA转化为苹果酸，但是并不催化苹果酸转化为丙酮酸或将苹果酸转化为OAA的逆反应，或催化该逆反应但具有降低的效果。在一个实施方案中，本公开的重组微生物包含编码苹果酸脱氢酶的基因，其中该苹果酸脱氢酶可以催化草酰乙酸转化为苹果酸，而不是丙酮酸转化为苹果酸、或苹果酸转化为丙酮酸。在一个实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的基因可包含导致苹果酸脱氢酶活性的部分或全部抑制的突变，所述苹果酸脱氢酶活性催化草酰乙酸向苹果酸转化、或苹果酸向草酰乙酸转化、或丙酮酸向苹果酸转化、或苹果酸向丙酮酸转化。

在一个示例性实施方案中，编码催化丙酮酸羧化成苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因来自，但不限于，细菌如埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因maeA或maeB)、假单胞菌、芽孢杆菌(例如，来自枯草芽孢杆菌的基因maeA)、根瘤菌(例如，来自苜蓿根瘤菌(R.melilote)的基因dme)、分枝杆菌(例如，来自结核分支杆菌的基因mez)、沙门氏菌(例如，基因maeB来自；或来自酵母例如(如来自酿酒酵母的基因mae1)；或来自植物(例如，来自拟南芥的基因nad-me1、或nad-me2、或nad-me3、或nadp-me1、或nadp-me2)。

在一个示例性实施方案中，编码催化草酰乙酸转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因来自，但不限于，细菌如埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因mdh)、棒状杆菌、链霉菌(例如，来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的基因mdh)；或来自酵母，例如酵母(例如，来自酿酒酵母的基因mdh1/2/3)；或来自植物，例如拟南芥。在另一个实施方案中，编码催化苹果酸转化成草酰乙酸的苹果酸脱氢酶的基因(也称为苹果酸：醌醇氧化还原酶)来自，但不限于埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因mqo)、假单胞菌(例如，来自恶臭假单胞菌(P.putida)的基因mqo)或芽孢杆菌属。

通过苹果酸硫激酶活性(也称为苹果酸辅酶A连接酶或苹果酰辅酶A合成酶)、或通过琥珀酰辅酶A连接酶活性(也称为琥珀酰辅酶A合成酶)将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。在一个实施方案中，该苹果酸硫激酶来自，但不限于EC6.2.1.4、EC 6.2.1.5、EC 6.2.1.9或EC6.2.1.-。在一个示例性的实施方案中，编码苹果酸硫激酶或琥珀酰辅酶A连接酶的基因来自细菌，例如埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因sucCD-2)、嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)、克鲁维梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、甲烷球菌(Methanocaldococcus)(例如来自詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)的基因mtkAB或sucCD)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)、假单胞菌、甲基球菌属(Methylococcussp.)、甲基杆菌(例如，来自扭脱甲基杆菌(M.extorquens)的基因mtkAB或sucCD)、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)、贝塞斯登颗粒杆菌(Granulibacter bethesdensis)、日本根瘤菌(Mesorhizobium japonicum)、食腐菌生丝微菌(Hyphomicrobiummethylovorum)、反硝化生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、红细菌科细菌(Rhodobacteraceae bacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。在一个实施方案中，苹果酸硫激酶或琥珀酰辅酶A连接酶对苹果酸具有高活性和/或高特异性，而对其它化合物如琥珀酸具有低活性和/或低特异性。这可以通过酶工程实现。

苹果酰辅酶A被苹果酰辅酶A裂解酶转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。在一个实施方案中，苹果酰辅酶A裂解酶来自、但不限于EC 4.1.3.24或EC 4.1.3.25。在一个示例性实施方案中，编码苹果酰辅酶A裂解酶的基因来自于甲基杆菌(例如，来自扭脱甲基杆菌的基因mclA)、扭脱甲基杆菌、Thalassobius activus、红细菌(例如来自类球红细菌(R.sphaeroides)的基因mcl1)、海滨玫瑰杆菌(Roseobacter litoralis)、链霉菌、链球菌、分枝杆菌((例如，来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的基因mcl1)、食腐菌生丝微菌(Hyphomicrobium methylovorum)、玫瑰杆菌(Roseobacter)(例如，海滨玫瑰杆菌(R.litoralis)的基因mcl1)、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)、杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、绿丝菌(Chloroflexus)(例如，来自嗜热光全绿丝菌(C.aurantiacus)的基因mcl)、Nereida(例如来自N.ignava的基因mcl1)、反硝化生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)、带化红球菌(Rhodococcus fascians)。

由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶将PEP羧化为草酰乙酸。在一个实施方案中，PEP羧化酶来自，但不限于EC 4.1.1.31。在一个示例性实施方案中，编码PEP羧化酶的基因来自，但不限于细菌、例如埃希氏杆菌属(例如，来自大肠杆菌的基因ppc)、红嗜热盐菌(Rhodothermus)(例如，来自海洋红嗜热盐菌(R.marinus)的基因ppc或pepC)、棒状杆菌、沙门氏菌、生丝微菌(Hyphomicrobium)、链球菌、链霉菌、泛菌(Pantoea)、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、假单胞菌、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、甲烷热杆菌(Methanothermobacter)(例如，来自热自养甲烷热杆菌的基因ppcA)；植物，例如杂交甘蔗(Saccharum hybrid)、大豆(glycine)(例如来自大豆(G.max)的基因ppc)、红花烟草(Nicotiana tabacum)、籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)、普通小麦(Triticumaestivum)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、玉米(Zea mays)(例如，基因pep1)或拟南芥(例如，来自拟南芥(A.thaliana)的基因ppc1或ppc2或ppc3)；古细菌或酵母。在一个实施方案中，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶来自，但不限于EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49。在一个示例性实施方案中，编码PEP羧激酶来自，但不限于细菌，例如埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因pck或pckA)、硒单胞菌(Selenomonas)(例如，来自反刍硒单胞菌(S.ruminantium)的基因pckA)、沙门氏菌(例如，来自鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的基因pckA)、分枝杆菌、假单胞菌、红假单胞菌、梭状芽孢杆菌、栖热球菌(Thermococcus)、链球菌(例如，来自牛链球菌(S.bovis)的基因pck或pckA)、瘤胃球菌(Ruminococcus)(例如，来自白色瘤胃球菌(R.albus)和黄色瘤胃球菌(R.flavefaciens)的基因pck或pckA)、放线杆菌(Actinobacillus)(例如，来自产琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)的基因pckA)、芽孢杆菌、热纤瘤胃梭状芽孢杆菌(Ruminiclostridium thermocellum)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、栖热菌(Thermus)；酵母，例如酵母(Saccharomyces)(例如，来自酿酒酵母的基因pck1或pepc或ppc1)；或锥虫(Trypanosoma)(例如，来自布氏锥虫(T.brucei)的基因)。

由丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化为草酰乙酸。在一个实施方案中，丙酮酸羧化酶来自，但不限于EC 6.4.1.1。在一个示例性实施方案中，编码丙酮酸羧化酶的基因来自细菌，例如芽孢杆菌(例如，来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的基因pyc)、念珠菌(例如，来自光滑念珠菌(C.glabrata)的基因pyc1)、贪铜菌(Cupriavidus)(例如，来自杀虫贪铜菌(C.necator)的基因pyc1)、分枝杆菌(例如，来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的基因pyc)、棒状杆菌(Corynebacterium)(例如，来自嗜甘氨酸棒状杆菌(C.glyciniphilum)的基因pyc)、诺卡氏菌(例如，来自新星诺卡氏菌(N.nova)的基因pyc1)；或酵母，例如酵母(Saccharomyces)(例如，来自酿酒酵母的基因pyc1和pyc2)、毕赤酵母(Pichia)(例如，来自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的pyc)；或隐杆线虫(Caenorhabditis)(例如，来自秀丽隐杆线虫(C.elegans)的pyc)；或来自智人(Homo sapiens)。

NADH乙醛酸还原酶或NADPH乙醛酸还原酶可将乙醛酸还原生产乙醇酸。在一个实施方案中，NADH乙醛酸还原酶来自EC 1.1.1.26。在一个实施方案中，NADPH乙醛酸还原酶来自EC 1.1.1.79。在一个示例性实施方案，编码NADH或NADPH依赖性的乙醛酸还原酶活性的基因是大肠杆菌中的基因“ycdW/ghrA”和/或“yiaE”、来自拟南芥的基因“GLYR1”、来自酿酒酵母的基因“GOR1”、以及来自海滨栖热球菌(Thermococcus litoralis)的“gyaR”。在一些实施方案中，可以通过酶工程改变酶的辅因子偏好(NADH或NADPH)。在一些实施方案，由来自大肠杆菌的基因“ycdW/ghrA”或“yiaE”、或来自拟南芥的“GLYR1”编码的酶NADPH依赖性的乙醛酸还原酶，经工程化以成为NADH依赖性的乙醛酸还原酶，所述酶接受NADH以及天然酶接受的辅因子NADPH，并且其仍然显示出相同的乙醛酸到乙醇酸的转化性能(即，转换辅因子但不损害其在所需反应中的动力学参数)。

在一个实施方案中，可以通过共同利用rGS途径与乙醛酸支路(GS)途径而增加乙醛酸的生产以及最终乙醇酸和/或甘氨酸的生产。例如，在rGS途径中生产的乙酰辅酶A(即由苹果酰辅酶A裂解酶对苹果酰辅酶A的活性生产的乙酰辅酶A)可以重新并入代谢途径以进一步增加乙醛酸的生产：即，通过进入GS途径与OAA组合生产柠檬酸，柠檬酸转化为异柠檬酸，异柠檬酸转化为琥珀酸和乙醛酸。GS途径生产的琥珀酸可以经延胡索酸转化为苹果酸，通过该途径生产的苹果酸可以进入rGS途径，在那里转化为苹果酰辅酶A，苹果酰辅酶A进一步被转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。

在本发明的重组微生物中，可以先运行rGS途径接着是GS途径，或者先运行GS途径接着是rGS途径。

在共同利用rGS和GS途径的一个实施方案中，PEP可以转化为OAA(PEP羧化酶或PEP羧激酶)和/或丙酮酸可以转化为OAA(丙酮酸羧化酶)或转化为苹果酸(苹果酸脱氢酶)；OAA可以转化为苹果酸(苹果酸脱氢酶)；苹果酸可以转化为苹果酰辅酶A(苹果酸硫激酶)；苹果酰辅酶A可以转化为乙醛酸和乙酰辅酶A(苹果酰辅酶A裂解酶)；乙酰辅酶A可与OAA组合形成柠檬酸(柠檬酸合酶)；柠檬酸可以转化为顺乌头酸(柠檬酸水解酶)；顺乌头酸可以转化为异柠檬酸(D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶)；异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸(异柠檬酸裂解酶)；琥珀酸可以转化为延胡索酸(琥珀酸脱氢酶)；以及延胡索酸可转化为苹果酸(延胡索酸酶)。苹果酸可以重新进入rGS途径并可以转化为苹果酰辅酶A。

在共同利用rGS和GS途径的另一实施方案中，PEP可以转化为OAA(PEP羧化酶或PEP羧激酶)和/或丙酮酸可以转化为OAA(丙酮酸羧化酶)或转化为苹果酸(苹果酸脱氢酶)；OAA可以通过与乙酰辅酶A组合转化为柠檬酸(柠檬酸合酶)；柠檬酸可以转化为顺乌头酸(柠檬酸水解酶)；顺乌头酸可以转化为异柠檬酸(D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶)；异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸(异柠檬酸裂解酶)；琥珀酸可以转化为延胡索酸(琥珀酸脱氢酶)；延胡索酸可转化为苹果酸(延胡索酸酶)；以及苹果酸可以转化为苹果酰辅酶A(苹果酸硫激酶)，和苹果酰辅酶A可以转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。在该实施方案中，OAA可以排它性地与乙酰辅酶A组合以形成柠檬酸(即通过阻断OAA向苹果酸的转化，例如失活催化OAA向苹果酸转化的苹果酸脱氢酶)、或它的一部分可以被转化苹果酸。

本文公开的任一实施方案中的重组微生物可包含编码参与GS途径的酶的基因。在一个实施方案中，该重组微生物包含(a)编码将乙酰辅酶A和OAA转化为柠檬酸的柠檬酸合酶的基因；(b)编码将柠檬酸转化为顺乌头酸的柠檬酸水解酶的基因；(c)编码将顺乌头酸转化为异柠檬酸的D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶的基因；(d)编码将异柠檬酸转化为琥珀酸和乙醛酸的异柠檬酸裂解酶的基因；(e)编码将琥珀酸转化为延胡索酸的琥珀酸脱氢酶的基因；以及(f)编码将延胡索酸转化为苹果酸的延胡索酸酶的基因。

GS和rGS途径生产的乙醛酸可以通过苹果酸合酶转化为苹果酸。然而，该反应会减少乙醛酸的产率，从而减少GA和甘氨酸的生产。因此，在一个实施方案中，本文所述的重组微生物中可包含在编码苹果酸合酶的基因中的功能丧失突变。如本文所指的功能丧失突变可导致功能的完全或部分丧失。功能丧失突变还可包括目的基因的完全删除。在一个示例性实施方案中，可根据本公开失活的编码苹果酸合酶的基因包括大肠杆菌中的aceB和/或glcB或酿酒酵母中的DAL7和MLS1。

在一个实施方案中，根据在给定途径中过量的NADH的量，调整共同利用的rGS和GS的通量比率(flux ratio)以获得对应于最佳产率的最低可能的净NADH生产。

本文公开的一种或多种编码目的酶的基因可以是内源存在的，可以插入微生物的基因组中和/或通过引入到微生物中的一种或多种载体(例如，质粒、粘粒、病毒载体等)表达。可以通过在基因组上使用或插入一个或几个基因的拷贝获得高水平的酶活性，该一个或几个基因的拷贝可以通过本领域普通技术人员已知的重组方法引入基因组上。为了通过载体进行表达，可以使用不同类型的载体，例如复制起点不同和因此在细胞中拷贝数不同的质粒。用于表达目的基因的示例性质粒包括但不限于pSK bluescript II、pSC101、RK2、pACYC、pRSF1010等)。可以使用具有不同强度的启动子表达编码酶促多肽的基因，所述不同强度的启动子可能会或可能不会被诱导分子诱导。启动子的实例包括Ptrc、Ptac、Plac、λ启动子cI或本领域普通技术人员已知的其它启动子。也可以通过稳定相应信使RNA的元件(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白质(例如，GST标签，Amersham Biosciences)来增强基因的表达。

在一个实施方案中，重组微生物中的内源性乙醛酸支路(GS)途径和/或其它中心代谢途径可以被修饰，例如，通过避免竞争性路线或副产物形成、以及绕过碳损失反应以使碳最大化流入到通过逆向乙醛酸支路到乙醇酸和/或甘氨酸的生物合成。例如，在一个实施方案中，可以修饰包含rGS途径的重组微生物以删除或减弱至少一种编码选自以下的酶的基因的表达：

(a)苹果酸合酶(例如，大肠杆菌中的基因aceB和/或glcB或酿酒酵母中的基因DAL7和MLS1)；

(b)异柠檬酸脱氢酶(例如，大肠杆菌中的基因icd或酿酒酵母中的基因IDP2和IDH1/2)；

(c)丙酮酸脱氢酶(例如，大肠杆菌中的基因pdhc和/或lpd)、丙酮酸氧化酶(例如，大肠杆菌中的基因poxB)和/或丙酮酸甲酸裂解酶(例如，大肠杆菌中的基因pfl)；以及

(d)丙酮酸激酶(例如，大肠杆菌中的基因pykA和/或pykF)。

在一些实施方案中，可以删除或减弱包含rGS途径的重组微生物中的内源乙醛酸消耗路线以进一步增加乙醇酸和/或甘氨酸的产率。例如，在一个实施方案中，修饰包含rGS途径的重组微生物以删除或减弱至少一种基因的表达、或抑制其活性，所述基因选自：

(a)编码乙醛酸醛连接酶(carboligase)的基因(例如，大肠杆菌中的基因gcl)；

(b)编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因(例如，大肠杆菌中的edA)；

(c)编码乙醇醛还原酶的基因(例如，大肠杆菌中的基因fucO和/或gldA)；

(d)编码乙醇酸氧化酶的基因(例如，大肠杆菌中的基因glcD、glcE、glcF和glcG)；

(e)编码异柠檬酸裂解酶阻遏物的基因(例如，大肠杆菌中的基因iclR)；以及

(f)编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因(例如，大肠杆菌中的基因pgi)。

可以通过将降低相应酶活性的突变引入基因中、或通过用低强度启动子替换天然启动子、或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定的试剂来减弱基因表达、或抑制由该基因编码的酶的活性。可以通过使用本领域已知的技术从微生物中删除相应基因来减弱基因表达、或抑制由该基因编码的酶的活性。

在一个实施方案中，本公开的重组微生物表达一组基因，所述基因编码：

(a)催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

(b)催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶；以及

(c)催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶；

(d)任选地催化PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和/或催化PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，和/或催化丙酮酸转化为草酰乙酸的丙酮酸羧化酶；

以及包含至少一种修饰，其选自以下：

(a)删除或减弱编码苹果酸合酶的基因；

(b)删除或减弱编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(d)删除或减弱编码苹果酸脱氢酶的基因，所述苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸转化成苹果酸、或苹果酸转化成草酰乙酸(苹果酸：醌醇氧化还原酶)；以及

(e)删除或减弱编码丙酮酸激酶的基因。

在另一个实施方案中，本公开的重组微生物表达一组基因，所述基因编码：

(a)催化PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和/或催化PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，和/或催化丙酮酸转化为草酰乙酸的丙酮酸羧化酶、和/或催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

(b)苹果酸硫激酶；

(c)苹果酰辅酶A裂解酶；以及

(d)任选地，催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

以及包含至少一种修饰，其选自以下：

(a)删除或减弱编码苹果酸合酶的基因；

(b)删除或减弱编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(d)删除或减弱编码催化苹果酸转化成丙酮酸的苹果酸脱氢酶的基因；以及

(e)删除或减弱编码丙酮酸激酶的基因。

在一个实施方案中，包含rGS途径的重组微生物表达一组基因，所述基因编码：

(a)催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

(b)催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶；以及

(c)催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶；

(d)任选地催化PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和/或催化PEP转化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，和/或催化丙酮酸转化为草酰乙酸的丙酮酸羧化酶；

以及包含至少一种修饰，其选自以下：

(a)删除或减弱编码苹果酸合酶的基因；

(b)删除或减弱编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(d)删除或减弱编码苹果酸脱氢酶的基因，所述苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸转化成苹果酸、或苹果酸转化成草酰乙酸；

(e)删除或减弱编码丙酮酸激酶的基因；

(f)删除或减弱编码乙醛酸醛连接酶的基因；

(g)删除或减弱编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因；

(h)删除或减弱编码乙醇醛还原酶的基因；

(i)删除或减弱编码乙醇酸氧化酶的基因；以及

(j)删除或减弱编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因。

在一个实施方案中，使用rGS途径和/或在上述一种或多种基因中的修饰所生产的乙醇酸的总化学计量是：葡萄糖+2CO₂->2GA+2乙酰辅酶A-2NAD(P)H-2ATP。在另一个实施方案中，使用rGS途径和/或在上述一种或多种基因中的修饰生产的乙醇酸的总化学计量是：葡萄糖+2CO₂+2NAD(P)H+2ATP->4GA+2醌醇。

氧化还原平衡对微调代谢途径以实现最大的产物产率潜力而言很重要。氧化还原状态的不平衡(例如细胞内汇集(pool)的NADPH和NADH辅因子的不平衡、不平衡的净ATP、和/或缺少还原剂)，可导致较低的产物产率和产生不想要的副产品。本公开包括氧化还原平衡得到微调的重组微生物及其使用方法。例如，本文公开的任一实施方案中的重组微生物可包含编码转氢酶和/或NAD激酶的基因以增加细胞内的NADH和/或NADPH浓度，从而实现产物产率增加。在示例性实施方案中，本文公开的任一实施方案中的重组微生物可包含编码转氢酶的基因(例如，来自大肠杆菌的“pntAB”和/或“udhA”)、和/或编码NAD激酶的基因(例如，来自大肠杆菌的“yfjB”)。这些基因的表达可以，例如，增加细胞内NADPH的浓度从而增加NADPH依赖性的乙醛酸还原酶的活性以促进乙醛酸转化为乙醇酸。

使用转氢酶(例如，大肠杆菌中的基因pntAB和/或udhA)、和/或NAD激酶(例如，大肠杆菌中的基因yfjB)来增加细胞内NADH或NADPH的浓度，已经描述在US20140335578,Cui等人，Microbial Cell Factories 2014,13:21,和Shi等人，Metabolic Engineering16(2013)1-10；其全部内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，可以将还原剂例如含硫化合物(例如，亚硫酸盐、二氧化硫和半胱氨酸(cystein))和/或氢添加到培养基中作为额外的还原动力源以调节代谢途径中的氧化还原平衡从而提高产物的产率。在另一个实施方案中，可以将外源氢源或其它额外的电子/NAD(P)H源添加到培养基中，用于具有NADH或NADPH负平衡的代谢途径。

在某些实施方案中，通过在包含逆向GS途径的重组微生物中删除或减弱而失活编码苹果酸：醌醇氧化还原酶(也称为苹果酸脱氢酶)的基因。

本公开的rGS途径可以与已知的GA和甘氨酸生产途径组合。目前已知的GA和/或甘氨酸生产途径包括丝氨酸/羟基丙酮酸途径，描述见于美国专利号8,911,978；乙醛酸支路(GS)途径，描述见于美国专利号9,034,615和8,945,888、PCT公开号WO 2016/193540和美国授权前公开号2014/0295510；基于D-赤藓糖的途径描述见于PCT公开号WO 2015/181074；基于戊糖衍生物到乙醇醛的途径描述见于PCT公开号WO 2017/059236和WO 2016/79440和美国授权前公开号US 2016/0076061和US 2015/0147794。所有这些途径生成过量的NADH和释放过量的CO2，即这些途径并没有达到热力学可能的最大产率。通过将这些已知的产生GA和甘氨酸途径与本公开的rGS途径组合，GA和/或甘氨酸的产率可以显著增加。

使用一些之前公布的途径的GA产率：

·丝氨酸/羟基丙酮酸途径：

1葡萄糖->->2GA+2CO₂+6NADH+0ATP；y＝0.84g/g，Y(max)＝1.70g/g，y是Y(max)的49％

·GS途径：

葡萄糖->2GA+2CO₂+4NADH+2醌醇+2ATP；y＝0.84g/g，Y(max)＝1.70g/g，y是Y(max)的49％

·使用GS的戊糖衍生物途径：

木糖->2GA+1CO₂+3NADH+1醌醇+0ATP；y＝1.01g/g，Y(max)＝1.71g/g，y是Y(max)的59％

·赤藓糖途径：

葡萄糖->3GA+2NADH+1醌醇-1ATP，y＝1.27g/g，Y(max)＝1.70g/g，y是Y(max)的75％。

通过将上述途径与本发明的rGS途径组合或共利用，GA的产率可以显著增加。例如，在某些实施方案中，共利用已知的GA生产途径与本发明的rGS途径可以提供增加的GA产率如下：

·GS和rGS途径：

葡萄糖+2/3CO2+2/3ATP->10/3GA+2醌醇；y＝1.41g/g，Y(max)＝1.69g/g，y是Y(max)的83％

·GS和rGS途径(在苹果酸脱氢酶上没有通量)：

葡萄糖+2CO2+2NAD(P)H->4GA+2醌醇；y＝1.69g/g，Y(max)＝1.69g/g，y是Y(max)的100％

·使用GS和rGS的戊糖衍生物途径：

木糖+CO2+1ATP->3GA+1醌醇；y＝1.52g/g，Y(max)＝1.69g/g，y是Y(max)的90％

·丝氨酸、GS和rGS途径：

葡萄糖+CO2+1.5ATP->3.5GA+1.5醌醇；y＝1.48g/g，Y(max)＝1.69g/g，y是Y(max)的88％。

在一个实施方案中，本发明的逆向乙醛酸支路途径利用由其它乙醇酸甘氨酸生产途径和/或乙醇醛产生途径产生的NADH和CO₂，和/或外源提供的CO₂和/或HCO3^-和/或其它碳源，从而增加产率潜力。例如，在一个实施方案中，本公开的逆向乙醛酸支路途径利用美国专利号8,911,978中描述的基于丝氨酸/羟基丙酮酸的途径产生的NADH和CO₂。在另一个实施方案中，逆向乙醛酸支路途径利用乙醛酸支路途径产生的NADH和CO₂，所述乙醛酸支路途径描述见美国专利号9,034,615和8,945,888、PCT公开号WO 2016/193540和美国授权前公开号2014/0295510。在又一个实施方案中，逆向乙醛酸支路途径利用基于D-赤藓糖和戊糖衍生物到乙醇醛的途径产生的NADH和CO₂，其描述见于PCT公开号WO 2015/181074、WO2017/059236、和WO 2016/79440和U.S授权前公开号US 2016/0076061和US 2015/0147794。

本公开的重组微生物包括细菌、酵母或真菌。在某些实施方案中，微生物选自，但不限于肠杆菌科、梭状芽孢杆菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科、棒状杆菌科和酵母科。在一个实施方案中，微生物是埃希氏杆菌、梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌、克雷伯氏菌、泛菌、沙门氏菌、乳杆菌、棒状杆菌或酵母菌的种。在一个实施方案中，微生物是大肠杆菌、或谷氨酸棒状杆菌、或丙酮丁醇梭状芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌、或酿酒酵母。

甘氨酸生产

可以使用各种酶将使用上述任何一种途径产生的乙醛酸转化为甘氨酸。例如，可以通过丙氨酸的转氨作用，例如通过丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(EC 2.6.1.44)，从乙醛酸生产甘氨酸。通常，天然途径在另一个转氨反应中利用谷氨酸作为氨基供体，通过丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.2)催化丙酮酸以补充丙氨酸。可以通过将常见的氮源NH₃固定在所得的2-氧化戊二酸中来补充谷氨酸自身，这需要NAD(P)H谷氨酸合酶(EC 1.4.1.13、EC1.4.1.14)。总化学计量是乙醛酸+NH3+1NAD(P)H->甘氨酸。其它可以促进乙醛酸转化为甘氨酸的酶包括甘氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.10)、甘氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.4)、丝氨酸-乙醛酸转氨酶(E.C.2.6.1.45)和甘氨酸氧化酶(E.C.1.4.3.19)。因此，本文公开的任一实施方案中的重组微生物可包含一种或多种选自以下基因：编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(EC2.6.1.44)的基因、编码甘氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.10)的基因、编码甘氨酸转氨酶(E.C.2.6.1.4)的基因、编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶(E.C.2.6.1.45)的基因和/或编码甘氨酸氧化酶(E.C.1.4.3.19)的基因。

在一个示例性实施方案中，编码甘氨酸脱氢酶(E.C.1.4.1.10)的基因可以来自分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌)、假单胞菌属、黄杆菌属(Xanthobactersp.)或芽孢杆菌属。

在一个示例性实施方案中，编码甘氨酸转氨酶(EC 2.6.1.4)的基因可以来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)、大鼠属(Rattus sp.)或红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)。

使用之前公开的或天然途径的甘氨酸的产率：

·使用乙醛酸支路的乙醛酸(glyoxylic acid)：

葡萄糖->2乙醛酸+6NADH+2醌醇+2ATP；y＝0.82g/g，Y(max)＝2.51g/g，y是Y(max)的33％

·通过乙醛酸转氨作用的甘氨酸：

葡萄糖+2NH₃->2甘氨酸+4NADH+2醌醇+2ATP；y＝0.701g/g(葡萄糖+2NH₃)，Y(max)＝1.20g/g，y是Y(max)的58％

·通过丝氨酸脱羧作用的甘氨酸：

葡萄糖+2THF+2NH₃->2甘氨酸+2M-THF+2NADH+0ATP；y＝0.701g/g(葡萄糖+2NH₃)。

通过共同利用已知途径与本发明的rGS途径的甘氨酸产率：

·戊糖衍生物途径、GS和rGS，使用乙醛酸转氨作用：

木糖+3NH₃+CO₂+1ATP->3甘氨酸+1醌醇；y＝1.12g/g(木糖+3NH₃)，Y(max)＝1.25g/g，y是Y(max)的90％

·GS和rGS，使用乙醛酸转氨作用：

葡萄糖+10/3NH₃+2/3CO₂+2/3ATP->10/3甘氨酸+2醌醇；y＝1.06g/g(葡萄糖+10/3NH₃)，Y(max)＝1.24g/g，y是Y(max)的85％

·GS和rGS途径，使用乙醛酸转氨作用(在苹果酸脱氢酶上没有通量)：

葡萄糖+4NH₃+2CO2+2NAD(P)H->4甘氨酸+2醌醇；y＝1.24g/g，Y(max)＝1.24g/g，y是Y(max)的100％

·丝氨酸、GS和rGS途径：

葡萄糖+3.5NH₃+CO₂+1.5ATP->3.5甘氨酸+1.5醌醇；y＝1.10g/g(葡萄糖+3.5NH₃)，Y(max)＝1.24g，y是Y(max)的89％。

在一个实施方案中，增加在包含rGS途径的重组微生物中的至少一种基因的表达水平以增加甘氨酸的产量，所述基因选自：

(a)编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因；

(b)编码甘氨酸脱氢酶的基因；

(c)编码甘氨酸转氨酶的基因；

(d)编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因；

(e)编码甘氨酸氧化酶的基因；

(f)编码丙氨酸转氨酶的基因；以及

(g)编码NAD(P)H依赖性谷氨酸合酶的基因。在另一个实施方案中，这些基因中的一种或多种可包含功能获得性突变，其增加由这些基因编码的酶的活性。

本发明的生产乙醛酸的重组微生物还可共同生产乙醇酸和甘氨酸。

在一些实施方案中，本发明的微生物不产生异丙醇。在一个实施方案中，本发明的微生物不通过逆向乙醛酸支路途径产生丝氨酸和/或谷氨酸。在一些实施方案中，本发明的微生物可以不包含一种或多种将甘氨酸转化为丝氨酸的酶。例如，在一个实施方案中，本发明的微生物可包含在编码丝氨酸羟甲基转移酶的基因中的功能丧失突变。在另一个实施方案中，所述微生物可以不包含甘氨酸消耗途径。

包含逆向乙醛酸途径的微生物表现出乙醇酸和甘氨酸的产量增加。在一个实施方案中，本公开的微生物缺少将乙醇酸和/或甘氨酸转化为其它产物或中间体的途径。

rGS途径和其它乙醇酸生产途径的共同利用

在某些实施方案中，包含逆向乙醛酸支路途径的重组微生物利用由其它乙醇酸和/或甘氨酸生成途径和/或外源提供的其它碳源(CO₂和/或HCO₃ ^-和/或其它碳酸)生成的NADH和CO₂。例如，在一个实施方案中，可以共同利用本发明的rGS途径与WO 2017/059236、US 2016/0076061、US 2015/0147794和WO 2016/079440中描述的基于戊糖衍生物到乙醇醛的途径。

因此，在一个实施方案中，包含rGS途径的重组微生物还可包含这些文件中描述的途径和/或修饰。例如，包含rGS途径的重组微生物可能具有降低的或去除的木酮糖激酶活性、或者降低的或去除的木酮糖激酶的表达，可重组表达将木酮糖相互转化为核酮糖的酶，可重组表达D-核酮糖-磷酸醛缩酶(例如，来自大肠杆菌的fucA基因)，可重组表达D-核酮糖激酶(例如，来自大肠杆菌的基因fucK)，和/或重组表达乙醇醛脱氢酶，例如醛脱氢酶A(例如，来自大肠杆菌的基因aldA)。

包含rGS途径的重组微生物可具有降低的或去除的木酮糖激酶活性，或者降低的或去除的木酮糖激酶的表达，重组表达将将D-木酮糖转化为D-木酮糖-1P的酶(例如，来自智人的khk-C)，重组表达D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶(例如，来自智人的基因aldoB)以及重组表达乙醇醛脱氢酶，例如醛脱氢酶A(例如，来自大肠杆菌的基因aldA)。包含rGS途径的重组微生物可能具有降低的或去除的将木糖相互转化为D-木酮糖的酶(例如，来自大肠杆菌的基因xylA)的活性、或所述酶的降低的或去除的表达，重组表达将木糖转化为D-木糖酸的酶，重组表达将D-木糖酸转化为2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸(2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate，DPP)的酶(例如，来自大肠杆菌的基因yagF)，重组地表达2-酮-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶(例如来自大肠杆菌的基因yagE)，以及重组地表达乙醇醛脱氢酶，例如醛脱氢酶A(例如，来自大肠杆菌的基因aldA)。

在一些实施方案中，包含rGS途径的重组微生物可包括编码木酮糖激酶的基因(例如，来自大肠杆菌的基因xylB)的删除。在一些实施方案中，将木酮糖和核酮糖相互转化的酶是D-塔格糖3-差向异构酶(例如，来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的基因dte)。在某些实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由来自菊苣假单胞菌(P.Cichorii)的dte基因编码，其针对大肠杆菌或酿酒酵母进行密码子优化。在一些实施方案中，包含rGS途径的重组微生物可以具有降低或去除的乙醇醛还原酶活性，或者降低的或去除的所述酶的表达。例如，重组微生物可以包含删除编码乙醇醛还原酶的基因(例如，基因fucO)。

在另一个实施方案中，本发明的rGS途径可以与美国专利号8,911,978中描述的丝氨酸/羟基丙酮酸途径共同利用。因此，在一个实施方案中，包含rGS途径的重组微生物可以表现出增加的丙酮酸脱羧酶(例如，由来自酵母的基因Pdc1、Pdc5、Pdc6编码的丙酮酸脱羧酶)、醛脱氢酶(例如，由基因aldA、aldB、aldH和gabD编码的醛脱氢酶)、丝氨酸转氨酶和/或丝氨酸氧化酶的表达水平。

在另一个实施方案中，包含rGS途径的重组微生物还可包含以下描述的基因修饰：美国专利号9,034,615、和8,945,888；PCT公开号WO 2016/193540和WO 2015/181074；以及美国授权前公开号2014/0295510。

方法

本发明提供使用本文所述的任何一种重组微生物生产乙醇酸和甘氨酸的方法。

在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因、编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、和编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。编码苹果酸脱氢酶的基因可编码苹果酸脱氢酶，所述苹果酸脱氢酶催化丙酮酸转化为苹果酸和/或催化OAA转化为苹果酸，但优选不催化(或催化效率较低)从苹果酸到丙酮酸或从苹果酸到OAA的逆反应。

在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因，组合编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。

在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因，组合编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物合成。在同一实施方案中，重组微生物可以具有、或可以不具有下调或删除葡萄糖-6-磷酸异构酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶和/或苹果酸脱氢酶。

在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因，组合编码催化OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因、编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。编码苹果酸脱氢酶的基因可编码苹果酸脱氢酶，所述苹果酸脱氢酶催化丙酮酸转化为苹果酸和/或催化OAA转化为苹果酸，但优选不催化(或催化效率较低)从苹果酸到丙酮酸或从苹果酸到OAA的逆反应。

在另一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；编码催化OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。在一个实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的基因编码修饰的苹果酸脱氢酶，所述修饰的苹果酸脱氢酶催化丙酮酸转化为苹果酸或OAA转化为苹果酸，但不催化从苹果酸到丙酮酸、或从苹果酸到OAA的逆反应，或显示从苹果酸到丙酮酸、或从苹果酸到OAA的转化减少。

在另一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因，以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中，该微生物不包含编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，或者在编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因中包含删除或功能丧失突变。

在另一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因，以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中该微生物不包含编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，或者在编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因中包含功能丧失突变。

在一个实施方案中，乙醛酸被重组微生物表达的NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶还原为乙醇酸。

在一个实施方案中，使用由重组微生物表达的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶、甘氨酸脱氢酶、甘氨酸转氨酶、丝氨酸-乙醛酸转氨酶、和/或甘氨酸氧化酶将乙醛酸转化为甘氨酸。

在本公开的方法中使用的合适的培养基包含可发酵的碳源。在一个实施方案中，碳源选自糖、甘油、醇、有机酸、烷烃、脂肪酸、木质纤维素、蛋白质、二氧化碳和一氧化碳。在示例性实施方案中，碳源是糖。在另一示例性的实施方案中，碳源是己糖和/或戊糖。在另一实施方案中，该碳源是葡萄糖或葡萄糖的寡聚物，或该碳源包含含有半纤维素的生物质水解物。在另一个实施方案中，碳源是单糖(例如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖和甘露糖)、二糖(例如，蔗糖、乳糖和麦芽糖)、寡糖(例如，半乳糖)或多糖(例如，纤维素)。

在另一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培养表达一组基因的重组微生物，所述基因编码：

(a)催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

(b)催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶；以及

(c)催化苹果酰辅酶A分解为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶；

(d)任选地磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、和/或丙酮酸羧化酶；

以及包含至少一种修饰，其选自以下：

(a)删除或减弱编码苹果酸合酶的基因；

(b)删除或减弱编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(d)删除或减弱编码催化草酰乙酸转化成苹果酸、或苹果酸转化成草酰乙酸的苹果酸脱氢酶的基因；以及

(e)删除或减弱编码丙酮酸激酶的基因。

在另一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培养表达一组基因的重组微生物，所述基因编码：

(a)催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

(b)催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶；以及

(c)催化苹果酰辅酶A分解为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶；

以及包含：

(a)减弱编码催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因、或催化苹果酸转化为草酰乙酸的苹果酸脱氢酶的基因，或减弱/突变编码催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，使得其显示减少的苹果酸向丙酮酸的转化；以及

(b)删除或减弱编码苹果酸合酶的基因(例如，大肠杆菌中的aceB和/或glcB基因、或酿酒酵母中的基因DAL7和MLS1)。

在另一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培养表达一组基因的重组微生物，所述基因编码：

(a)催化PEP羧化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和/或催化PEP羧化为草酰乙酸的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，和/或催化丙酮酸羧化为草酰乙酸的丙酮酸羧化酶、和/或催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶；

(b)催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶；以及

(c)催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶；

(d)以及任选的，催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶，

以及；

其中该微生物包含至少一种修饰，其选自以下：

(a)删除或减弱编码苹果酸合酶的基因；

(b)删除或减弱编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(d)删除或减弱编码催化苹果酸转化成丙酮酸的苹果酸脱氢酶的基因，或删除或减弱编码催化苹果酸转化成草酰乙酸的苹果酸脱氢酶的基因；

(e)删除或减弱编码丙酮酸激酶的基因；

(f)删除或减弱编码乙醛酸醛连接酶的基因；

(g)删除或减弱编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因；

(h)删除或减弱编码乙醇醛还原酶的基因；

(i)删除或减弱编码乙醇酸氧化酶的基因；以及

(j)删除或减弱编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因。

在又一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表现出一种或多种酶的增加的表达水平、或增加的活性(即，对于所需反应的增强的动力学参数)、或更高的特异性(即，工程化的酶与野生型酶相比，对靶底物的特异性>5x、>10¹x、>10²x、>10³x、10⁴x、或优选>10⁵；或新的同源酶)，所述酶选自：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、NADH依赖性的乙醛酸还原酶、和NADPH依赖性的乙醛酸还原酶。

在另一些实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物显示至少一种选自以下的酶的表达水平减少：苹果酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸激酶、乙醛酸醛连接酶、2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、乙醇醛还原酶、和乙醇酸氧化酶。

在另一实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法可包括删除或修饰，其减少丙酮酸脱氢酶的活性、防止或至少减少从丙酮酸转化为乙酰辅酶A中的主要碳损失，并有利于通过本文提出的酶候选物的羧化活性将碳从丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸改路线。

在另一实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法可包括删除或修饰，其减少丙酮酸激酶的活性，并有利于通过本文提出的酶候选物的羧化活性从磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸中的碳固定。

本公开的方法可以提供在每克碳源约1.1g乙醇酸至约2.0g/g范围内的乙醇酸的产率，包括其间的值和范围。例如，乙醇酸的产率可以约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或约2.0g/g。乙醇酸的产率可以从约1.1至约1.8g/g、约1.2至约1.8g/g、约1.3至约1.8g/g、约1.4至1.8g/g、约1.4至1.7g/g、或约1.4至1.6g/g。

本公开的方法可以提供在每克碳源约1.0g甘氨酸至约1.5g/g范围内的甘氨酸的产率，包括其间的值和范围。例如，甘氨酸的产率可以约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、或1.5g/g。甘氨酸的产率范围可以从约1.0至约1.4g/g、约1.0至约1.3g/g、约1.0至约1.2g/g、约1.1至1.5g/g、约1.1至1.4g/g、或约1.1至1.3g/g、或约1.2至1.4g/g。

聚乙醇酸(PGA)的生产

本公开还包括生产聚乙醇酸(PGA)的方法。本公开的重组微生物生产的乙醇酸可用于生产PGA。PGA可以通过体内聚合反应或化学聚合反应从GA生产。

在一个实施方案中，在美国授权前公开号2011/0118434A1中描述使用体内聚合路线生产PGA，通过引用该公开整体将其并入本文。在这条路线中，一旦生成GA，两类的酶-辅酶A转移酶/合酶和PHA合酶可用于在细胞内产生PGA。因此，在一个实施方案中，本文公开的任一实施方案中的重组微生物可包含编码聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)(PHA)合酶的基因。

已知四种主要的PHA合酶类别(Rhem,B.,2003)。I类和II类PHA合酶包含仅由一型的亚基(PhaC)组成的酶。根据它们的体内和体外特异性，I类PHA合酶(例如，在真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)中)优先利用包含3至5个碳原子的各种羟基脂肪酸的辅酶A-硫酯，而II类PHA合酶(例如，在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中)优先利用包含6至14个碳原子的各种羟基脂肪酸的辅酶A-硫酯。III类合酶(例如，在葡萄异色菌(Allochromatium vinosum)中)包含由两种不同类型的亚基：PhaC和PhaE亚基组成的酶。这些PHA合酶优选包含3至5个碳原子的羟基脂肪酸的辅酶A-硫酯。IV类PHA合酶(例如，在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中)类似III类PHA合酶，但PhaE被PhaR代替。

在一个实施方案中，编码PHA合酶的基因是phaC、phaEC和/或phaCR。

在一个实施方案中，乙醇酸通过一种或多种选自以下的酶转化为乙醇酰辅酶A：酰基辅酶A合成酶、酰基辅酶A转移酶和与丁酸激酶相关的磷酸转丁酰酶(phosphotransbutyrylase)。

在示例性实施方案中，将乙醇酸转化为乙醇酰辅酶A的酶来自肠杆菌科物种。在一个示例性的实施方案中，本文所述的任一实施方案中的重组微生物可包含编码来自大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Thyphimurium)的丙酰辅酶A合成酶的基因prpE、来自大肠杆菌的编码乙酰辅酶A转移酶的基因acs、编码磷酸转丁酰酶的基因ptb和/或编码丁酸激酶的基因buk。

如果不通过体内聚合，本领域已知有化学聚合方法：具有高分子量PGA的来自Kureha的开环聚合(附文献)、以及实现低分子量PGA的直接缩聚(Singh&Tiwari，2010)。

或者，可以通过化学聚合路线制备PGA，例如环二酯的开环聚合或2-羟基羧酸的缩聚。在示例性实施方案中，可以使用由Yamane等人(Polymer Journal，2014年8月，1-7页)描述的开环聚合方法生产PGA以获得高分子量的PGA。在另一个示例性实施方案中，可以通过直接缩聚产生PGA以获得低分子量的PGA(Singh&Tiwari，International Journal ofPolymer Science，2010卷，652719条，23页，doi：10.1155/2010/652719)。

本公开还提供生产重组微生物的方法，所述重组微生物能够使用逆向乙醛酸支路从乙醛酸生产乙醇酸和/或甘氨酸。在一个实施方案中，用于生产重组微生物的方法包括将选自以下的一种或多种基因引入微生物、或将功能获得性突变引入选自以下的一种或多种基因：

(a)编码将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因；

(b)编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因；

(c)编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；

(d)编码将OAA转化为苹果酸和/或将丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；

(e)编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；

(f)编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因；

(g)编码将乙醛酸转化为乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的基因；以及

(h)编码将乙醛酸转化为乙醇酸的NADPH依赖性的乙醛酸还原酶的基因。

编码上述多肽的基因的核苷酸序列是本领域已知的并且是可公开获得的(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。将所需核酸序列并入微生物基因组中或并入表达载体中的方法也是已知的。例如，通过引用并入本文的美国专利号9,034,615公开了将基因ycdW(编码NADPH依赖性的乙醛酸还原酶)并入表达载体的方法。

在某些实施方案中，重组微生物包括删除或修饰，其减弱内源基因的表达。用于产生这些微生物的示例性方法包括删除基因、或通过用低强度启动子取代天然启动子、或通过将导致酶活性减少的突变引入基因中而减弱基因的表达。

在一些实施方案中，用于生产重组微生物的方法包括向微生物中引入删除或修饰，其减弱至少一种内源基因编码的酶的表达、或抑制其活性，所述内源基因选自以下：

(a)编码苹果酸合酶的基因；

(b)编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(c)编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(d)编码丙酮酸激酶的基因；

(e)编码苹果酸脱氢酶的基因；

(f)编码乙醛酸醛连接酶的基因；

(g)编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因；

(h)编码乙醇醛还原酶的基因；

(i)编码乙醇酸氧化酶的基因；

(j)编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因；以及

(l)编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因。

用于生产重组微生物的方法还可包括(a)将减弱编码苹果酸：醌醇氧化还原酶的基因表达的删除或修饰引入微生物，和/或(b)将功能获得性突变引入编码苹果酸脱氢酶的基因、编码丙酮酸羧化酶的基因、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因、编码苹果酸硫激酶的基因、编码苹果酰辅酶A裂解酶的基因、编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因；甘氨酸脱氢酶的基因；编码甘氨酸转氨酶的基因；编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因；编码甘氨酸氧化酶的基因；编码丙氨酸转氨酶的基因和/或编码NADPH依赖性谷氨酸合酶的基因。

因为修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，所以给出上述详细描述只用于清楚理解，而不应因此视为不必要的限制。

虽然已经结合本公开的特定实施方案描述了本公开，但应当理解，本公开能够进一步修改并且本申请旨在涵盖本公开的任何变化、使用或改编，通常遵循本公开的原理并包括与本公开内容的这种偏离属于本公开内容所属领域内的已知或惯常做法，并且可应用于上文所述的基本特征以及所附权利要求的范围内的下述基本特征。

实施例

实施例1：

计算机模拟分析通过大肠杆菌中的逆向乙醛酸支路活性生物合成和改善的乙醇 酸生产

进行通量平衡分析(FBA)以模拟在各种情况下本文所述的基因修饰对乙醇酸的生产产率的影响(图3和图4)。为此，对包含所有已知的大肠杆菌代谢反应的基因组规模的代谢模型iJO1366(Orth JD.等人(2011)A comprehensive genome-scale reconstructionof Escherichia coli metabolism—2011.Mol Syst Biol.7:535)进行修饰，用于模拟使用乙醛酸(GS)和逆向乙醛酸(rGS)支路组合的乙醇酸(GA)生产。修饰该模型以包括其它反应和相应的代谢物，包括苹果酸硫激酶反应(EC 6.2.1.9)、苹果酰辅酶A连接酶反应(EC4.1.3.24)和丙酮酸羧化酶反应(EC6.4.1.1)。

使用OptFlux软件(Rocha L.(2010)OptFlux:an open-source softwareplatform for in silico metabolic engineering.BMC Syst Biol.4:45)进行模拟。在示例性实施方案中，进行简约通量平衡分析以评估通过GS/rGS工程所得的GA的最大理论生产产率。根据示例性实施方案，所使用的转运系统是己糖激酶HXK(E.C.2.7.1.1)、或磷酸转移酶系统(PTS)，而用于进入TCA循环的羧化酶是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)(E.C.4.1.1.32)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)(E.C.4.1.1.31)、或丙酮酸羧化酶PPC(EC6.4.1.1)。

通过应用在大肠杆菌菌株体内培养条件下容易重现的一组限制(constraint)来进行模拟，其中葡萄糖是碳底物以及在有氧条件下。葡萄糖底物通量任意设定为10μmole.gCDW-1.h-1。没有设置关于最少生物质产率或细胞维护成本的限制。描述GA最大理论生产的模拟结果如表1所示。

表1.描述GA的最大理论生产的模拟结果

在图3和图4中描述模拟通量图。模拟显示，根据所使用的葡萄糖转运系统和羧化酶，通过GS/rGS从葡萄糖生产GA的理论生产产率可以达到0.83到1.43g_GA/g_葡萄糖之间。依赖PEPCK或PPC作为羧化酶的菌株在PTS+菌株中性能较差。这可能是由于PTS系统和PEPCK/PPC之间对其共同底物磷酸烯醇丙酮酸的竞争。然而，在PTS缺陷菌株中(其中葡萄糖大多通过己糖激酶HXK转运)，所述菌株的性能可提高。如通量图所描绘(图3和图4)，只有将来自葡萄糖的碳通量的86％至100％转向戊糖磷酸途径，用于为最终的乙醛酸还原酶反应(E.C.1.1.1.26)提供氧化还原辅因子，才能实现最大产率。这种朝向戊糖磷酸途径的碳流视为替代方案，以提供NADPH依赖性的乙醛酸还原酶所需的NADPH辅因子。

实施例2：

通过将大肠杆菌中的逆向乙醛酸支路活性与通过丙酮酸羧化酶活性的羧化作用 进行组合，对乙醇酸生产的体内生物合成和改善

如前所述(Alkim C.(2016)the synthetic xylulose-1phosphate pathwayincreases production of glycolic acid from xylose-rich sugarmixtures.Biotechnol Biofuels,9:201)，可以通过失活所有消耗乙醛酸的注释反应，即，由aceB(GenBank Gene ID：948512)和glcB(GenBank Gene ID：948857)编码的苹果酸合酶、由gcl(GenBank Gene ID：945394)编码的乙醛酸醛连接酶、和由eda(GenBank Gene ID:946367)编码的2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶，来增强大肠杆菌中乙醇酸(GA)的生产。通过删除编码乙醇酸氧化酶的glcDEFG操纵子(GenBank Gene ID：947353、2847718、2847717、947473)可以进一步防止GA的再氧化。

因此，下述实验在大肠杆菌K12菌株MG1655ΔaceBΔglcDEFGBΔgclΔedd-eda中进行。该菌株称为SGK_rGS_00，是来自Alkim等人的礼物(Alkim C.(2016)The syntheticxylulose-1phosphate pathway increases production of glycolic acid fromxylose-rich sugar mixtures.Biotechnol Biofuels,9:201)。

删除编码磷酸葡萄糖异构酶的pgi基因座

为了构建具有增强的戊糖磷酸活性和NADPH汇集的菌株，根据标准程序通过CRISPR-Cas9(Jiang Y.等人(2015)Multigene editing in the Escherichia coligenome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol,81:2506-2514)来删除编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi(GenBank基因ID：948535)。含有向导RNA的质粒pTargetF(pMB1 aadA sgRNA-cadA)、和含有cas9基因和λ-Red重组酶的pCas(repA101-Ts kan Pcas-cas9 ParaB-Red lacIq Ptrc-sgRNA-pMB1)是从AddGene(分别为Addgene质粒#62226和#62225；Addgene,剑桥，美国)获得。

使用在表2中描述的引物Pgi_N20_FW和Pgi_N20_RV通过重叠PCR获得pTargetFpMB1 aadA sgRNA-pgi，其表达向导RNA，具有靶向pgi基因座的N20序列。使用引物Pgi_H1_FW、Pgi_H1_RV、Pgi_H2_FW和Pgi_H2_RV(参见表2)通过重叠PCR扩增pgi基因座上游500bp和下游500bp，并将其组合获得PCR片段，以PCR片段提供供体DNA/破坏盒。

表2.用于通过CRISPR-Cas9破坏pgi的寡核苷酸。结合区域加下划线。对pgi特异的N20序列以斜体表示。

通过调整来自(Jiang Y.等人(2015)Multigene editing in the Escherichiacoli genome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol,81:2506-2514)的操作方案进行基因组编辑。首先使用标准程序(Woodall CA.(2003)PlasmidVectors.Methods in Molecular Biology.235)通过电穿孔使用pCAS质粒转化菌株SGK_rGS_00。制备含有pCAS的菌株SGK_rGS_00的感受态细胞，同时用阿拉伯糖(10mM终浓度)诱导λ-Red重组酶，如之前所述(Jiang Y.等人(2015)Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol,81:2506-2514)。然后，将50μl感受态细胞与100ng的pTargetF质粒、以及400ng的供体DNA混合。在2-mm电穿孔比色皿(VWR)中以2.5kV进行电穿孔，并将产物立即悬浮在1ml的LB介质(在30℃下预热)中。细胞在30℃下恢复过夜，然后接种到含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LB琼脂上，并在30℃下孵育过夜。通过菌落PCR和测序用于鉴定转化体。所得菌株称为SGK_rGS_01：MG1655ΔaceBΔglcDEFGBΔgclΔedd-edaΔpgi。

删除编码丙酮酸脱氢酶的亚基E1的aceE基因座

根据标准程序(Thomasson LC.(2007)E.coli Genome Manipulation byP1Transduction.Curr Protoc Mol Biol.79:1.17)，使用从Keio单基因删除合集(Baba T.等人(2006)Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Mol Syst Biol.2:2006.0008)中获得的MG1655Δpgi::KanR菌株JW0110，在菌株SGK_rGS_01中删除丙酮酸脱氢酶亚基E1 aceE，从而构建积累丙酮酸的菌株，以增强使用羧化酶(例如，丙酮酸羧化酶)进入Krebs循环。在补充有100μg/ml的卡那霉素的LB琼脂上选择转化体，并通过菌落PCR和测序进行鉴定。使用Flp重组，通过FTR区域的特异性重组进一步去除抗生素标志物，如之前在文献(Datsenko KA.等人(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci USA.97(12):6640-5)中所述。所得的菌株称为SGK_rGS_02:MG1655ΔaceBΔglcDEFGBΔgclΔedd-edaΔpgiΔaceE。

表达丙酮酸羧化酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶和乙醛酸还原酶以增强碳固定、 乙醛酸支路活性和乙醇酸合成

通过(莱比锡，德国)合成来自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)菌株CFN42的丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO:20)(Uniprot登录号：Q2K340)。使用表3中的引物从大肠杆菌MG1655的基因组中通过PCR扩增天然异柠檬酸裂解酶aceA(SEQ ID NO:21)(GeneBank GeneID:948517)和乙醛酸还原酶ghrA(SEQ ID NO:23)(GeneBank Gene ID:946431)的基因。如Trichez等人所述(Trichez D.(2018)Engineering of Escherichia coli for Krebscycle-dependent production of malic acid.Microb Cell Fact.17:113)，通过PCR从质粒pACT3w-ppc_K620S-gltA_R163L中回收NADH不敏感型柠檬酸合酶突变体gltA_R163L(SEQ ID NO:22)。

为表达这些作为合成的操纵子的基因，首先用J23119组成型启动子(SEQ ID NO:19)(http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Anderson)替代P_A1lacO-1启动子对pZS13-Luc质粒(Expressys)进行修饰，并引入多克隆位点。获得由(莱比锡，德国)合成的J23119启动子作为合成的基因片段。随后，通过限制性克隆将其克隆到pZS13-Luc质粒中，克隆在限制性位点AatII和KpnI之间。通过用KpnI和AvrII消化从pZA21-MCS质粒(Expressys)回收多克隆位点，并通过在所述限制性位点KpnI和AvrII之间的限制性克隆将所述多克隆位点并入质粒中。所得质粒称为pZS1-J23119-MCS。

使用表3中描述的引物通过PCR扩增所有基因。根据制造商的操作方案，使用EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit(BioBasic)在凝胶上纯化PCR片段。随后，根据制造商的操作方案，通过使用HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New EnglandBiolabs)，将纯化的片段克隆到通过KpnI和HindIII的限制性消化进行线性化的pZS1-J23119-MCS质粒中。通过PCR和测序确认构建。所得合成的操纵子称为J23119-pyc-aceA-gltA_R163L-ghrA(SEQ ID NO:24)，以及质粒称为pZS1-pyc(参见表4)。

表3.用于构建合成操纵子J23119-pyc-aceA-gltAR164L-ghrA的寡核苷酸。结合区域加下划线。使用HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New England Biolabs)用突出端来组装克隆。

表4.用于构建合成操纵子PTac-sucCD-mcl的寡核苷酸。结合区域加下划线。使用HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New England Biolabs)用突出端来组装克隆。

为引入逆向乙醛酸支路活性的苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A连接酶的表达

来自荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)菌株Bath的编码苹果酸硫激酶的sucC2-sucD2操纵子(SEQ ID NO:26)(Uniprot Q607L9和Q607L8)，以及来自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)AM1的编码苹果酰辅酶A裂解酶和mcl基因(SEQ ID NO:27)(Uniprot C5B113)，作为合成基因从(莱比锡，德国)订购。为表达这些作为合成的操纵子的基因，首先用从标准pACT3质粒中回收的P_Tac诱导型启动子(SEQ ID NO:25)取代P_LtetO-1启动子从而对pZS13-MCS质粒(Expressys)进行修饰，然后通过限制性位点AatII和KpnI之间的限制性克隆进行克隆。所得质粒称为pZA3-P_Tac-MCS。

使用表4中描述的引物通过PCR扩增所有基因。根据制造商的操作方案，使用EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit(BioBasic)在凝胶上纯化PCR片段。随后，根据制造商的操作方案，通过使用HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New EnglandBiolabs)，将纯化的片段作为合成的操纵子克隆到通过EcoRI和MluI的限制性消化进行线性化的pZA3-P_Tac-MCS质粒中。通过PCR和测序确认构建。所得合成的操纵子称为P_Tac-sucCD-mcl(SEQ ID NO:28)，以及质粒称为pZA3-rGS(参见表5)。

测定乙醇酸生产

测试三种大肠杆菌菌株用于测定GA生产。测试(i)不含质粒作为阴性对照、(ii)仅含有质粒pZS1-pyc、(ii)含有质粒pZA3-rGS、(iv)含有两种质粒的野生型菌株MG1655和工程化的菌株SGK_rGS_01和SGK_rGS_02。使用标准程序(Woodall CA.(2003)PlasmidVectors.Methods in Molecular Biology.235)通过电穿孔使用相应的质粒转化所有菌株。质粒和菌株的基因型见表5。

表5.用于乙醇酸生产测定的质粒和菌株的基因型。

菌株在补充有15mM乙酸和1g/L酪蛋白氨基酸的M9葡萄糖介质(20g/L葡萄糖)中生长约50小时。添加氨苄青霉素和氯霉素使得终浓度分别为100μg/mL和25μg/mL(即对于携带pZS1-pyc的菌株为氨苄青霉素，对于携带pZA3-rGS的菌株为氯霉素)。当培养物的OD600达到约0.6-0.8时，用IPTG(终浓度0.5mM)诱导培养物。通过OD₆₀₀监测生长。在生长至稳定期过程中取样。然后，通过HPLC-UV/RI(Dionex Ultimate 3000,Thermo Fisher Scientific)，用Rezex ROA-Organic Acid柱(Phenomenex)在80℃下使用H₂SO₄ 0.5mM作为流动相(0.5mL/分钟)分析葡萄糖消耗和代谢物生产。24小时后的GA滴度和GA产率在表6中显示。

如表6所示，在没有质粒或只有质粒pZS1-pyc或pZA3-RGS的MG1655野生型对照菌株中未检测到显著的乙醇酸生产。这在预料之中，因为在野生型菌株中所有主要的竞争途径(即乙醛酸和乙醇酸降解途径)仍然有活性。有趣的是，当在MG1655野生型菌株中表达pZS1-pyc质粒和pZA3-rGS时可以检测到有限量的GA。GA的滴度达到0.11g/L，这是GS/rGS途径的组合即使在野生型菌株中对GA的生产也具有积极影响的第一个指征。

对于工程化的菌株SGK_rGS_01，在空白对照菌株或仅具有pZA3-rGS的菌株中未检测到显著的GA生产。然而，当使用质粒pZS1-pyc增强乙醛酸支路活性和乙醛酸还原酶活性时，可以检测到高达约0.18g/L滴度的GA生产。在菌株中加入pZA3-rGS质粒后，改善GA滴度910％，达到1.91g/L。22.5小时后生产产率达到0.24g_GA/g_葡萄糖，与没有经rGS工程化的生产产率相比显示出2400％的改善。

对于经工程化的菌株SGK_rGS_02，在仅具有单一质粒的对照菌株中未检测到显著的GA生产。仅在两种质粒的组合时检测到GA生产，滴度高达约0.28g/L。

表6.在生长24小时后的乙醇酸生产测定期间评估GA的滴度和产率

实施例3：

通过将大肠杆菌中的逆向乙醛酸支路活性与通过pep羧化酶活性中的羧化作用组 合生物合成和改善乙醇酸的生产

下述实验在大肠杆菌K12菌株MG1655ΔaceBΔglcDEFGBΔgclΔedd-eda中进行。该菌株称为SGK_rGS_00，是Alkim等人的礼物(Alkim C.等人(2016)The SyntheticXylulose-1phosphate pathway increases production of glycolic acid fromxylose-rich sugar mixtures.Biotechnol Biofuels,9:201)。

删除编码磷酸葡萄糖异构酶的pgi基因座

为了构建具有增强的戊糖磷酸活性和NADPH汇集的菌株，根据标准程序(Jiang Y.等人(2015)Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol,81:2506-2514)通过CRISPR-Cas9删除编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi(GenBank Gene ID:948535)。如之前在实施例2中所述破坏菌株，并将其称为SGK_rGS_01(表5)。

删除编码丙酮酸激酶I的pykF基因座

使用从Keio单基因删除合集(Baba T.等人(2006)Construction of Escherichiacoli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol SystBiol.2:2006.0008)中获得的MG1655Δpgi::KanR菌株JW1666，根据标准程序进行转导(Thomasson LC.(2007)E.coli Genome Manipulation by P1 Transduction.Curr ProtocMol Biol.79:1.17)，在菌株SGK_rGS_01中删除丙酮酸激酶I pykF(GenBank Gene ID:946179)，从而构建积累磷酸烯醇丙酮酸的菌株，以增强使用羧化酶(例如，pep羧化酶)进入Krebs循环。在补充有100μg/ml的卡那霉素的LB琼脂上选择转化体，并通过菌落PCR和测序进行鉴定。使用Flp重组，如之前在文献中所述，通过FTR区域的特异性重组进一步去除抗生素标志物(Datsenko KA.等人(2000)One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA.97(12):6640-5)。所得菌株称为SGK_rGS_03MG1655ΔaceBΔglcDEFGBΔgclΔedd-edaΔpgiΔpykF。

表达pep羧化酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶和乙醛酸还原酶以增强碳固定、乙醛酸支路活性和乙醇酸合成

质粒pACT3w-ppc_K620S-gltA_R163L获自Trichez等人(Trichez D.(2018)Engineeringof Escherichia coli for Krebs cycle-dependent production of malic acid.MicrobCell Fact.17:113)。所述质粒包含在诱导型P_Tac启动子控制下的苹果酸不敏感的pep羧化酶突变体ppc_K620S和NADH不敏感的柠檬酸合酶突变体gltA_R163L。如下所述对其进行进一步修饰，并用作构建合成的操纵子的骨架。分别使用表7中所述的引物aceA_FW/aceA_RV和ghrA_FW/ghrA_RV，从大肠杆菌MG1655的基因组中通过PCR扩增编码天然异柠檬酸裂解酶aceA的基因(GeneBank Gene ID:948517)和编码乙醛酸还原酶ghrA的基因(GeneBank Gene ID:946431)。使用质粒pACT3w-ppc_K620S-gltA_R163L作为模板，以及在表7中所述的引物pACT3_FW/ppc_RV，将基因ppc_K620S(SEQ ID NO:29)与质粒骨架pACT3一起通过PCR扩增。最后，使用质粒pACT3w-ppc_K620S-gltA_R163L作为模板，以及在表7中所述的引物gltA_FW/gltA_RV，通过PCR扩增基因gltA_R163L。

表7.用于构建合成的操纵子J23119-pyc-aceA-gltAR164L-ghrA的寡核苷酸。结合区域加下划线。使用HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New EnglandBiolabs)用突出端来组装克隆。

根据制造商的操作方案，使用EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit(BioBasic)在凝胶上纯化PCR片段。随后，根据制造商的操作方案，通过使用HiFi DNA Assembly Cloning Kit(New England Biolabs)，将纯化的片段组装。通过PCR和测序确认构建。所得合成的操纵子称为P_tac-ppc_K620S-aceA-gltA_R163L-ghrA(SEQ ID NO:30)，以及质粒称为pACT3-ppc。

为引入逆向乙醛酸支路活性而表达苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A连接酶

如实施例2中所述，来自荚膜甲基球菌菌株Bath的编码苹果酸硫激酶的sucC2-sucD2操纵子(SEQ ID NO:26)(Uniprot Q607L9和Q607L8)、以及来自扭脱甲基杆菌AM1的编码苹果酰辅酶A裂解酶的mcl基因(Uniprot C5B113)作为合成基因从(莱比锡，德国)订购。如实施例2中所述，获得含有合成的操纵子P_Tac-sucCD-mcl(SEQ ID NO:28)的质粒pZA3-rGS。为在与质粒pACT3-ppc兼容的背景中表达P_Tac-sucCD-mcl，通过在限制性位点AvrII和BglII之间的限制性克隆，将P_Tac-sucCD-mcl进一步转移到pZE23-MCS质粒(Expressys)中。所得质粒称为pZE2-rGS。

测定乙醇酸生产

测试两种菌株用于GA生产测定。测试(i)仅含有质粒pACT3-ppc、(ii)仅含有质粒pZE2-rGS、以及(iii)含有两种质粒的野生型MG1655和工程化的菌株SGK_rGS_03。使用标准程序(Woodall CA.(2003)Plasmid Vectors.Methods in Molecular Biology.235)通过电穿孔使相应的质粒转化所有菌株。质粒和菌株的基因型见表8。

表8.用于乙醇酸生产测定的质粒和菌株的基因型。

菌株在补充有15mM乙酸和1g/L酪蛋白氨基酸的M9葡萄糖介质(20g/L葡萄糖)中生长约50小时。添加氯霉素和卡那霉素使得终浓度分别为25μg/mL和50μg/mL(即，对于携带pACT3-ppc的菌株为氯霉素，以及对于携带pZE2-rGS的菌株为卡那霉素)。当培养物的OD600达到约0.6-0.8时，用IPTG(终0.5mM)诱导培养物。通过OD₆₀₀监测生长。在生长至稳定期过程中取样。然后，通过HPLC-UV/RI(Dionex Ultimate 3000,Thermo Fisher Scientific)，用Rezex ROA-Organic Acid柱(Phenomenex)在80℃下使用H₂SO₄ 0.5mM作为流动相(0.5mL/分钟)分析葡萄糖消耗和代谢物生产。在表9中显示葡萄糖滴度、GA滴度和GA产率。

如表9所示，当表达pACT3-ppc和pZE2-rGS、以及pACT3-ppc没有pZE2-rGS时，可以在野生型对照中检测到GA的生产，但最大产率仅为0.02g_GA/g_葡萄糖；而在仅具有质粒pZE2-rGS的SGK_rGS_03菌株中没有检测到乙醇酸的生产。然而，当使用质粒pACT3-ppc增强碳固定、乙醛酸支路活性和乙醛酸还原酶活性时，可以在该菌株中检测到高达约0.8g/L滴度的GA生产。向SGK_rGS_03中添加pZE2-rGS质粒不会改善GA滴度。46小时后生产产率达到0.21g_GA/g_葡萄糖，与表达pACT3-ppc的菌株相比显示出525％的改善，与表达两种质粒的野生型菌株相比显示出1050％的改善。

表9.在46小时后的乙醇酸生产测定期间评估GA滴度和产率

列举的实施方案

1.一种生产乙醛酸的重组微生物，其用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸，其包含：

(a)编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；

(b)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及

(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。

2.一种生产乙醛酸的重组微生物，其用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸，其包含：

(a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；

(b)编码催化OAA转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；

(c)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及

(d)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物合成。

3.一种生产乙醛酸的重组微生物，其用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸，其包含：

(a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；

(b)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及

(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中所述重组微生物并不催化草酰乙酸转化为苹果酸。

4.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述重组微生物不通过苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A产生异丙醇、乙醇、丙酮、柠檬酸、衣康酸、乙酸、丁酸、(聚)3-羟基丁酸、3-羟基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-羟基异丁酸、甲基丙烯酸、(聚)谷氨酸、谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、或脯氨酸。

5.任一前述实施方案中的重组微生物，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物合成。

6.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物在编码苹果酸脱氢酶的基因中包含突变，其中所述突变导致部分或完全抑制苹果酸脱氢酶的活性，所述苹果酸脱氢酶的活性催化草酰乙酸转化为苹果酸、苹果酸转化为丙酮酸和/或苹果酸转化草酰乙酸。

7.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物包含编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的基因、或编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的NADPH依赖性的乙醛酸还原酶的基因。

8.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物包含编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因、编码甘氨酸脱氢酶的基因、编码甘氨酸转氨酶的基因、编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因、和/或编码催化乙醛酸转化成甘氨酸的甘氨酸氧化酶的基因。

9.任一前述实施方案中的重组微生物，其中催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶来自酶分类(E.C.)1.1.1.38、E.C.1.1.1.39、或E.C.1.1.1.40。

10.任一前述实施方案中的重组微生物，其中催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶来自酶分类(E.C.)1.1.1.37。

11.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因选自：maeA、maeB、dme、mez、mae1、nad-me1和nad-me2或其同源物。

12.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述基因maeA来自大肠杆菌、假单胞菌、或芽孢杆菌；所述基因maeB来自大肠杆菌或沙门氏菌；所述基因dme来自根瘤菌；所述基因mez来自分枝杆菌；所述基因mae1来自酿酒酵母；以及所述基因nad-me1或nad-me2来自拟南芥。

13.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述基因maeA来自枯草芽孢杆菌；所述基因dme来自苜蓿根瘤菌；或者所述基因mez来自结核分枝杆菌。

14.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因选自：来自大肠杆菌、棒状杆菌、链霉菌、酵母和拟南芥的基因mdh或其同源物。

15.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述基因mdh来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或基因mdh1/2/3来自酿酒酵母。

16.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码苹果酸硫激酶的基因是来自甲基杆菌属、扭脱甲基杆菌、大肠杆菌、嗜热栖热菌、生丝微菌属(Hyphomicrobium sp.)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、热自养甲烷热杆菌、根瘤菌、荚膜甲基球菌、或假单孢菌(Pseudomonas)的sucCD和/或SucCD-2和/或mtkAB或其同源物。

17.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码苹果酰辅酶A裂解酶的基因是来自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、链霉菌、嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulans)、Nereida ignava、食腐菌生丝微菌(Hyphomicrobium methylovorum)、活性深海菌(Thalassobius activus)、海滨玫瑰杆菌(Roseobacter litoralis)、反硝化生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)、类球红细菌、耻垢分歧杆菌(Mycobacterium smegmatis)或带化红球菌(Rhodococcus fascians)的mcl和/或Mcl1和/或mclA或其同源物。

18.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码丙酮酸羧化酶的基因是来自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的pyc、来自酵母的PYC1或PYC2、或来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的pyc或其同源物。

19.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因是来自大肠杆菌的ppc、海洋红嗜热盐菌(R.Marinus)的ppc或pepC、来自热自养甲烷热杆菌(M.thermautotrophicus)的ppcA、来自玉米(Z.mays)的pep1、来自拟南芥(A.thaliana)的ppc1/2/3、来自大豆(G.max)的ppc、或者是来自红嗜热盐菌(Rhodothermus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、链球菌(Streptococcus)和链霉菌(Streptomyces)、泛菌(Pantoea)、芽孢杆菌(Bacillus)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、假单孢菌(Pseudomonas)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、红花烟草(Nicotiana tabacum)、籽粒苋(Amaranthushy pochondriacus)、普通小麦(Triticumaestivum)或紫花苜蓿(Medicago sativa)；或其同源物。

20.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因是来自大肠杆菌的pck或pckA、来自反刍硒单胞菌(Selenomonas ruminantium)的pckA、来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的pckA、来自克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)的pckA、来自栖热菌属(Thermus sp)的pckA、来自白瘤胃球菌(Ruminococcus albus)和黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的pck或pckA、来自产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的pckA、来自牛链球菌(Streptococcus bovis)的pck或pckA，或者来自芽孢杆菌、热纤瘤胃梭状芽孢杆菌(Ruminiclostridium thermocellum)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、分枝杆菌(Mycobacterium)；或其同源物。

21.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物包含：

(a)编码柠檬酸合酶的基因，所述柠檬酸合酶将苹果酰辅酶A裂解酶产生的OAA和乙酰辅酶A转化为柠檬酸；

(b)编码将柠檬酸转化为顺乌头酸的柠檬酸水解酶的基因；

(c)编码将顺乌头酸转化为异柠檬酸的D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶的基因；

(d)编码将异柠檬酸转化为琥珀酸和乙醛酸的异柠檬酸裂解酶的基因；

(e)编码将琥珀酸转化为延胡索酸的琥珀酸脱氢酶的基因；以及

(f)编码将延胡索酸转化为苹果酸的延胡索酸酶的基因。

22.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物包含编码苹果酸合酶的基因的功能丧失突变、或所述基因的删除。

23.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码乙醛酸还原酶活性的基因选自：来自大肠杆菌的ycdW和/或yiaE、来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的GOR1、来自海滨栖热球菌(Thermococcus litoralis)的gyaR和/或来自拟南芥(A.thaliana)的GLYR1。

24.任一前述实施方案中的重组微生物，其中将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶来自酶分类系统号E.C.6.4.1.1；将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来自E.C.4.1.1.31；将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶来自E.C.4.1.1.32和E.C.4.1.1.49。

25.任一前述实施方案中的重组微生物，其中将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶来自酶分类系统号E.C.6.2.1.4、E.C.6.2.1.5、E.C.6.2.1.9、或E.C.6.2.1.-；和/或将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶来自E.C.4.3.1.24或E.C.4.3.1.25。

26.任一前述实施方案中的重组微生物，其中一种或多种基因异源表达。

27.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物包括删除或修饰，其减少一种或多种选自以下的内源基因的活性：

(a)编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(b)编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(c)编码丙酮酸激酶的基因；以及

(d)编码乙醇酸氧化酶的基因。

28.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述编码苹果酸合酶的基因是来自大肠杆菌的aceB和/或glcB、或来自酵母的DAL7和/或MLS1。

29.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因是来自大肠杆菌的icd、或来自酵母的IDP2和/或IDH1/2。

30.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述编码丙酮酸脱氢酶的基因是来自大肠杆菌的aceE和/或aceF。

31.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述编码丙酮酸激酶的基因是来自大肠杆菌的pykA和/或pykF。

32.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述编码乙醇酸氧化酶的基因是来自大肠杆菌的glcD、glcE、glcF和/或glcG。

33.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述酵母是酿酒酵母。

34.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物包括删除或修饰，其减少一种或多种选自以下的内源基因的活性：

(a)编码乙醛酸醛连接酶的基因；

(b)编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因；

(c)编码乙醇醛还原酶的基因；以及

(d)编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因。

35.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述编码乙醛酸醛连接酶的基因是gcl；编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因是edA；编码乙醇醛还原酶的基因是fucO和/或gldA；以及编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因是iclR。

36.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因、编码甘氨酸脱氢酶的基因、编码甘氨酸转氨酶的基因、编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因、和/或编码甘氨酸氧化酶的基因的表达水平升高。

37.任一前述实施方案中的重组微生物，其中编码丙氨酸转氨酶的基因、和/或编码NADPH依赖性谷氨酸合酶的基因的表达水平升高。

38.任一前述实施方案中的重组微生物，其中在由苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A裂解酶催化的反应中，所述微生物可以利用由其它乙醇酸和/或甘氨酸生产途径产生的NADH和CO₂。

39.任一前述实施方案中的重组微生物，其中在由苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A裂解酶催化的反应中，所述微生物可以利用外源加入的CO₂、碳酸、和/或还原剂。

40.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述还原剂是氢、电子和/或NAD(P)H。

41.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述还原剂来自外部来源。

42.任一前述实施方案中的重组微生物，其中在由苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A裂解酶催化的反应中，所述微生物利用基于丝氨酸/羟基丙酮酸途径产生的NADH和CO₂。

43.任一前述实施方案中的重组微生物，其中在由苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A裂解酶催化的反应中，所述微生物利用由乙醛酸支路途径产生的NADH和CO₂。

44.任一前述实施方案中的重组微生物，其中在由苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A裂解酶催化的反应中，所述微生物利用基于D-赤藓糖至乙醇醛的途径产生的NADH和CO₂。

45.任一前述实施方案中的重组微生物，其中在由苹果酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶A裂解酶催化的反应中，所述微生物利用基于戊糖衍生物到乙醇醛的途径产生的NADH和CO₂。

46.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物选自细菌、酵母和真菌。

47.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物是选自肠杆菌科、梭状芽孢杆菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科和棒状杆菌科的细菌。

48.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物是埃希氏杆菌、梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌、克雷伯氏菌、泛菌、沙门氏菌、乳杆菌或棒状杆菌的种。

49.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物是大肠杆菌、或谷氨酸棒状杆菌、或丙酮丁醇梭状芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌。

50.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物是选自酵母科的酵母。

51.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物是酵母种。

52.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述微生物是酿酒酵母。

53.任一前述实施方案中的重组微生物，其中乙醇酸和/或甘氨酸的合成通过增加至少一种选自以下的酶的表达水平、或活性、或特异性而增加：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶、甘氨酸脱氢酶、甘氨酸转氨酶、丝氨酸-乙醛酸转氨酶、甘氨酸氧化酶、NADH依赖性的乙醛酸还原酶和NADPH依赖性的乙醛酸还原酶。

54.任一前述实施方案中的重组微生物，其中乙醇酸和/或甘氨酸的合成通过减少至少一种选自以下的酶的表达水平、或活性、或特异性而增加：苹果酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、乙醛酸醛连接酶、2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶、乙醇醛还原酶和乙醇酸氧化酶。

55.任一前述实施方案中的重组微生物，其中乙醇酸和/或甘氨酸的合成通过减少编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因的表达水平而增加。

56.一种使用任一前述实施方案中的重组微生物生产乙醇酸和/或甘氨酸的方法，其中所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物直到生产出乙醇酸和/或甘氨酸。

57.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳源选自：糖、甘油、醇、有机酸、烷烃、脂肪酸、半纤维素、木质纤维素、蛋白质、二氧化碳和一氧化碳。

58.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳源是己糖和/或戊糖。

59.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳源是葡萄糖。

60.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳源是蔗糖。

61.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳源包含含有半纤维素的生物质水解物。

62.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳源是CO₂或碳酸。

63.任一前述实施方案中的方法，其中所述碳酸是HCO₃ ^-。

64.一种生产重组微生物的方法，所述重组微生物从乙醛酸中生产乙醇酸和/或甘氨酸，所述方法包括向所述微生物中引入：

(a)编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；

(b)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及

(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。

65.一种生产重组微生物的方法，所述重组微生物从乙醛酸中生产乙醇酸和/或甘氨酸，所述方法包括向所述微生物中引入：

(a)编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或

编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；

(b)编码催化OAA转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；

(c)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及

(d)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物合成。

66.一种生产重组微生物的方法，所述重组微生物从乙醛酸中生产乙醇酸和/或甘氨酸，所述方法包括向所述微生物中引入：

(a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；

(b)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及

(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中所述重组微生物并不催化草酰乙酸转化为苹果酸。

67.任一前述实施方案中的方法，其中所述编码苹果酸脱氢酶的基因包含导致部分或完全抑制苹果酸脱氢酶的活性的突变，所述苹果酸脱氢酶的活性催化草酰乙酸转化为苹果酸、苹果酸转化为丙酮酸或苹果酸转化草酰乙酸。

68.任一前述实施方案中的方法，其包括向微生物中引入：

(a)编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的基因；

(b)编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的NADPH依赖性的乙醛酸还原酶的基因；或

(i)编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因、编码甘氨酸脱氢酶的基因、编码甘氨酸转氨酶的基因、编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因、和/或编码催化乙醛酸转化成甘氨酸的甘氨酸氧化酶的基因。

69.任一前述实施方案中的方法，其包括向微生物中引入编码苹果酸合酶的基因功能丧失突变、或所述基因的删除。

70.任一前述实施方案中的方法，其包括向微生物中引入删除或修饰，其减少选自以下的基因编码的一种或多种酶的活性：

(a)编码异柠檬酸脱氢酶的基因；

(b)编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基因；

(c)编码丙酮酸激酶的基因；

(d)编码乙醇酸氧化酶的基因；以及

(e)编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因。

71.任一前述实施方案中的方法，其包括向所述微生物中引入删除或修饰，其减少选自以下的基因编码的一种或多种酶的活性：

(a)编码乙醛酸醛连接酶的基因；

(b)编码2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶的基因；

(c)编码乙醇醛还原酶的基因；以及

(d)编码异柠檬酸裂解酶的阻遏物的基因。

72.任一前述实施方案中的方法，其包括向编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因、编码将乙醛酸转化为甘氨酸的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因、编码甘氨酸脱氢酶的基因、编码甘氨酸转氨酶的基因、编码丝氨酸-乙醛酸转氨酶的基因、和/或编码催化将乙醛酸转化为甘氨酸的甘氨酸氧化酶的基因中引入功能获得性突变。

73.任一前述实施方案中的方法，其包括向编码丙氨酸转氨酶的基因和/或编码NADPH依赖性谷氨酸合酶的基因中引入功能获得性突变。

74.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物选自细菌、酵母和真菌。

75.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物是选自肠杆菌科、梭状芽孢杆菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科和棒状杆菌科的细菌。

76.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物是埃希氏杆菌、梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌、克雷伯氏菌、泛菌、沙门氏菌、乳杆菌或棒状杆菌的种。

77.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物是大肠杆菌、或谷氨酸棒状杆菌、或丙酮丁醇梭状芽孢杆菌、或枯草芽孢杆菌。

78.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物是选自酵母科的酵母。

79.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物是酵母种。

80.任一前述实施方案中的方法，其中所述重组微生物是酿酒酵母。

通过引用加入

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请出于所有目的均通过引用整体并入。

然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请不是也不应被视为承认、或任何形式的暗示它们构成世界上任何国家的公知常识的有效现有技术或构成其部分。

序列表

<110> 布拉斯科公司

<120> 通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨酸的微生物和方法

<130> BRSK-010/02WO (331051-2041)

<150> 62/806,195

<151> 2019-02-15

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Pgi_N20_FW

<400> 1

gtcctaggta taatactagt ccgattatct ggggtgaacc gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Pgi_N20_RV

<400> 2

actagtatta tacctaggac tgag 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pgi_H1_FW

<400> 3

atgaaaaaca tcaatccaac gc 22

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Pgi_H1_RV

<400> 4

ggtggatcag tcggtcacca tgtatgggc 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pgi_H2_FW

<400> 5

tggtgaccga ctgatccacc agggaacca 29

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Pgi_H2_RV

<400> 6

catatcgacg atgattaacc gc 22

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pvc_FW

<400> 7

ttgtttaact ttaaggaggt ttggaggtac catgcccata tccaag 46

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pvc_RV

<400> 8

ttttcatacg gttcctcctt ctagatcatc cgccgtaaac cg 42

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物aceA_FW

<400> 9

cggatgatct agaaggagga accgtatgaa aacccgtaca caacaaat 48

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物aceA_RV

<400> 10

ttgtatcagc catcgtgtgc ctcctttaga actgcgattc ttcagtg 47

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物gltA_FW

<400> 11

atcgcagttc taaaggaggc acacgatggc tgatacaaaa gcaaaactc 49

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物gltA_RV

<400> 12

agatgatatc catcgtgtgc ctcctttaac gcttgatatc gcttttaaag tc 52

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ghrA_FW

<400> 13

tatcaagcgt taaaggaggc acacgatgga tatcatcttt tatcacccaa c 51

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ghrA_RV

<400> 14

ggctgcagga attcgatatc atagattagt agccgcgtgc gcg 43

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物sucCD_FW

<400> 15

acaatttcac acaggaaaca gaattcctat aattttgttt aactttaag 49

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物sucCD_RV

<400> 16

tatagtctag atcagaatct gattccgtg 29

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物mcl_FW

<400> 17

gaatcagatt ctgatctaga ctataatttt gtttaacttt aaggaggtt 49

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物mcl_RV

<400> 18

tagcacgcgt ttactttccg cccatcgcg 29

<210> 19

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> J23119启动子

<400> 19

gacgtccaca gctaacacca cgtcgtccct atctgctgcc ctaggtctat gagtggttgc 60

tggataactt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctaataga aataattttg 120

tttaacttta aggaggtttg gaggtacc 148

<210> 20

<211> 3465

<212> DNA

<213> 菜豆根瘤菌pyc

<400> 20

atgcccatat ccaagatact cgttgccaat cgctctgaaa tagccatccg cgtgttccgc 60

gcggccaacg agcttggaat aaaaacggtg gcgatctggg cggaagagga caagctggcg 120

ctgcaccgct tcaaggcgga cgagagttat caggtcggcc gcggaccgca tcttgcccgc 180

gacctcgggc cgatcgaaag ctatctgtcg atcgacgagg tgatccgcgt cgccaagctt 240

tccggtgccg acgccatcca tccgggctac ggcctcttgt cggaaagccc cgaattcgtc 300

gatgcctgca acaaggccgg catcatcttc atcggcccga aggccgatac gatgcgccag 360

cttggcaaca aggtcgcagc gcgcaacctg gcgatctcgg tcggcgtacc ggtcgtgccg 420

gcgaccgagc cactgccgga cgatatggcc gaagtggcga agatggcggc ggcgatcggc 480

tatcccgtca tgctgaaggc atcctggggc ggcggcggtc gcggcatgcg cgtcattcgt 540

tccgaggccg acctcgccaa ggaagtgacg gaagccaagc gcgaggcgat ggcggccttc 600

ggcaaggacg aggtctatct cgaaaaactg gtcgagcgcg cccgccacgt cgaaagccag 660

atcctcggcg acacccacgg caatgtcgtg catctcttcg agcgcgactg ttccgttcag 720

cgccgcaatc agaaggtcgt cgagcgcgcg cccgcaccct atctttcgga agcgcagcgc 780

caggaactcg ccgcctattc gctgaagatc gcaggggcga ccaactatat cggcgccggc 840

accgtcgaat atctgatgga tgccgatacc ggcaaatttt acttcatcga agtcaatccg 900

cgcatccagg tcgagcacac ggtgaccgaa gtcgtcaccg gcatcgatat cgtcaaggcg 960

cagatccaca tcctggacgg cgccgcgatc ggcacgccgc aatccggcgt gccgaaccag 1020

gaagacatcc gtctcaacgg tcacgccctg cagtgccgcg tgacgacgga agatccggag 1080

cacaacttca ttccggatta cggccgcatc accgcctatc gctcggcttc cggcttcggc 1140

atccggcttg acggcggcac ctcttattcc ggcgccatca tcacccgcta ttacgatccg 1200

ctgctcgtca aggtcacggc ctgggcgccg aacccgctgg aagccatttc ccgcatggac 1260

cgggcgctgc gcgaattccg catccgtggc gtcgccacca acctgacctt cctcgaagcg 1320

atcatcggcc atccgaaatt ccgcgacaac agctacacca cccgcttcat cgacacgacg 1380

ccggagctct tccagcaggt caagcgccag gaccgcgcga cgaagcttct gacctatctc 1440

gccgacgtca ccgtcaatgg ccatcccgag gccaaggaca ggccgaagcc cctcgagaat 1500

gccgccaggc cggtggtgcc ctatgccaat ggcaacgggg tgaaggacgg caccaagcag 1560

ctgctcgata cgctcggccc gaaaaaattc ggcgaatgga tgcgcaatga gaagcgcgtg 1620

cttctgaccg acaccacgat gcgcgacggc caccagtcgc tgctcgcaac ccgcatgcgt 1680

acctatgaca tcgccaggat cgccggcacc tattcgcatg cgctgccgaa cctcttgtcg 1740

ctcgaatgct ggggcggcgc caccttcgac gtctcgatgc gcttcctcac cgaagatccg 1800

tgggagcggc tggcgctgat ccgagagggg gcgccgaacc tgctcctgca gatgctgctg 1860

cgcggcgcca atggcgtcgg ttacaccaac tatcccgaca atgtcgtcaa atacttcgtc 1920

cgccaggcgg ccaaaggcgg catcgatctc ttccgcgtct tcgactgcct gaactgggtc 1980

gagaatatgc gggtgtcgat ggatgcgatt gccgaggaga acaagctctg cgaggcggcg 2040

atctgctaca ccggcgatat cctcaattcc gcccgcccga aatacgactt gaaatattac 2100

accaaccttg ccgtcgagct tgagaaggcc ggcgcccata tcattgcggt caaggatatg 2160

gcgggccttc tgaagccggc tgctgccaag gttctgttca aggcgctgcg tgaagcaacc 2220

ggcctgccga tccatttcca cacgcatgac acctcgggca ttgcggcggc aacggttctt 2280

gccgccgtcg aagccggtgt cgatgccgtc gatgcggcga tggatgcgct ctccggcaac 2340

acctcgcaac cctgtctcgg ctcgatcgtc gaggcgctct ccggctccga gcgcgatccc 2400

ggcctcgatc cggcatggat ccgccgcatc tccttctatt gggaagcggt gcgcaaccag 2460

tatgccgcct tcgaaagcga cctcaaggga ccggcatcgg aagtctatct gcatgaaatg 2520

ccgggcggcc agttcaccaa cctcaaggag caggcccgct cgctggggct ggaaacccgc 2580

tggcaccagg tggcgcaggc ctatgccgac gccaaccaga tgttcggcga tatcgtcaag 2640

gtgacgccat cctccaaggt cgtcggcgac atggcgctga tgatggtctc ccaggacctg 2700

accgtcgccg atgtcgtcag ccccgaccgc gaagtctcct tcccggaatc ggtcgtctcg 2760

atgctgaagg gcgatctcgg ccagcctccg tctggatggc cggaagcgct gcagaagaaa 2820

gcattgaagg gcgaaaagcc ctatacggtg cgccccggct cgctgctcaa ggaagccgat 2880

ctcgatgcgg aacgcaaagt catcgagaag aagcttgagc gcgaggtcag cgacttcgaa 2940

ttcgcttcct atctgatgta tccgaaggtc ttcaccgact ttgcgcttgc ctccgatacc 3000

tacggtccgg tttcggtgct gccgacgccc gcctattttt acgggttggc ggacggcgag 3060

gagctgttcg ccgacatcga gaagggcaag acgctcgtca tcgtcaatca ggcggtgagc 3120

gccaccgaca gccagggcat ggtcactgtc ttcttcgagc tcaacggcca gccgcgccgt 3180

atcaaggtgc ccgatcgggc ccacggggcg acgggagccg ccgtgcgccg caaggccgaa 3240

cccggcaatg ccgcccatgt cggtgcgccg atgccgggcg tcatcagccg tgtctttgtc 3300

tcttcaggcc aggccgtcaa tgccggcgac gtgctcgtct ccatcgaggc catgaagatg 3360

gaaaccgcga tccatgcgga aaaggacggc accattgccg aagtgctggt caaggccggc 3420

gatcagatcg atgccaagga cctgctggcg gtttacggcg gatga 3465

<210> 21

<211> 1305

<212> DNA

<213> 大肠杆菌aceA

<400> 21

atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60

gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120

cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180

tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240

gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300

ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360

gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420

gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480

ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540

gcggcagttc acttcgaaga tcagctggcg tcagtgaaga aatgcggtca catgggcggc 600

aaagttttag tgccaactca ggaagctatt cagaaactgg tcgcggcgcg tctggcagct 660

gacgtgacgg gcgttccaac cctgctggtt gcccgtaccg atgctgatgc ggcggatctg 720

atcacctccg attgcgaccc gtatgacagc gaatttatta ccggcgagcg taccagtgaa 780

ggcttcttcc gtactcatgc gggcattgag caagcgatca gccgtggcct ggcgtatgcg 840

ccatatgctg acctggtctg gtgtgaaacc tccacgccgg atctggaact ggcgcgtcgc 900

tttgcacaag ctatccacgc gaaatatccg ggcaaactgc tggcttataa ctgctcgccg 960

tcgttcaact ggcagaaaaa cctcgacgac aaaactattg ccagcttcca gcagcagctg 1020

tcggatatgg gctacaagtt ccagttcatc accctggcag gtatccacag catgtggttc 1080

aacatgtttg acctggcaaa cgcctatgcc cagggcgagg gtatgaagca ctacgttgag 1140

aaagtgcagc agccggaatt tgccgccgcg aaagatggct ataccttcgt atctcaccag 1200

caggaagtgg gtacaggtta cttcgataaa gtgacgacta ttattcaggg cggcacgtct 1260

tcagtcaccg cgctgaccgg ctccactgaa gaatcgcagt tctaa 1305

<210> 22

<211> 1284

<212> DNA

<213> 大肠杆菌gltAR163L

<400> 22

atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60

ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120

ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180

gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240

tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300

tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360

ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420

gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480

gccgcgttcc tcctgctgtc gaaaatgccg actatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540

attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600

atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660

gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720

accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780

tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840

tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900

ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960

gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1020

atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1080

aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1140

accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1200

agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1260

tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284

<210> 23

<211> 939

<212> DNA

<213> 大肠杆菌ghrA

<400> 23

atggatatca tcttttatca cccaacgttc gatacccaat ggtggattga ggcactgcgc 60

aaagctattc ctcaggcaag agtcagagca tggaaaagcg gagataatga ctctgctgat 120

tatgctttag tctggcatcc tcctgttgaa atgctggcag ggcgcgatct taaagcggtg 180

ttcgcactcg gggccggtgt tgattctatt ttgagcaagc tacaggcaca ccctgaaatg 240

ctgaaccctt ctgttccact ttttcgcctg gaagataccg gtatgggcga gcaaatgcag 300

gaatatgctg tcagtcaggt gctgcattgg tttcgacgtt ttgacgatta tcgcatccag 360

caaaatagtt cgcattggca accgctgcct gaatatcatc gggaagattt taccatcggc 420

attttgggcg caggcgtact gggcagtaaa gttgctcaga gtctgcaaac ctggcgcttt 480

ccgctgcgtt gctggagtcg aacccgtaaa tcgtggcctg gcgtgcaaag ctttgccgga 540

cgggaagaac tgtctgcatt tctgagccaa tgtcgggtat tgattaattt gttaccgaat 600

acccctgaaa ccgtcggcat tattaatcaa caattactcg aaaaattacc ggatggcgcg 660

tatctcctca acctggcgcg tggtgttcat gttgtggaag atgacctgct cgcggcgctg 720

gatagcggca aagttaaagg cgcaatgttg gatgttttta atcgtgaacc cttaccgcct 780

gaaagtccgc tctggcaaca tccacgcgtg acgataacac cacatgtcgc cgcgattacc 840

cgtcccgctg aagctgtgga gtacatttct cgcaccattg cccagctcga aaaaggggag 900

agggtctgcg ggcaagtcga ccgcgcacgc ggctactaa 939

<210> 24

<211> 7260

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> J23119-pyc-aceA-gltAR163L-ghrA合成的操纵子

<400> 24

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagctaata gaaataattt tgtttaactt 60

taaggaggtt tggaggtacc atgcccatat ccaagatact cgttgccaat cgctctgaaa 120

tagccatccg cgtgttccgc gcggccaacg agcttggaat aaaaacggtg gcgatctggg 180

cggaagagga caagctggcg ctgcaccgct tcaaggcgga cgagagttat caggtcggcc 240

gcggaccgca tcttgcccgc gacctcgggc cgatcgaaag ctatctgtcg atcgacgagg 300

tgatccgcgt cgccaagctt tccggtgccg acgccatcca tccgggctac ggcctcttgt 360

cggaaagccc cgaattcgtc gatgcctgca acaaggccgg catcatcttc atcggcccga 420

aggccgatac gatgcgccag cttggcaaca aggtcgcagc gcgcaacctg gcgatctcgg 480

tcggcgtacc ggtcgtgccg gcgaccgagc cactgccgga cgatatggcc gaagtggcga 540

agatggcggc ggcgatcggc tatcccgtca tgctgaaggc atcctggggc ggcggcggtc 600

gcggcatgcg cgtcattcgt tccgaggccg acctcgccaa ggaagtgacg gaagccaagc 660

gcgaggcgat ggcggccttc ggcaaggacg aggtctatct cgaaaaactg gtcgagcgcg 720

cccgccacgt cgaaagccag atcctcggcg acacccacgg caatgtcgtg catctcttcg 780

agcgcgactg ttccgttcag cgccgcaatc agaaggtcgt cgagcgcgcg cccgcaccct 840

atctttcgga agcgcagcgc caggaactcg ccgcctattc gctgaagatc gcaggggcga 900

ccaactatat cggcgccggc accgtcgaat atctgatgga tgccgatacc ggcaaatttt 960

acttcatcga agtcaatccg cgcatccagg tcgagcacac ggtgaccgaa gtcgtcaccg 1020

gcatcgatat cgtcaaggcg cagatccaca tcctggacgg cgccgcgatc ggcacgccgc 1080

aatccggcgt gccgaaccag gaagacatcc gtctcaacgg tcacgccctg cagtgccgcg 1140

tgacgacgga agatccggag cacaacttca ttccggatta cggccgcatc accgcctatc 1200

gctcggcttc cggcttcggc atccggcttg acggcggcac ctcttattcc ggcgccatca 1260

tcacccgcta ttacgatccg ctgctcgtca aggtcacggc ctgggcgccg aacccgctgg 1320

aagccatttc ccgcatggac cgggcgctgc gcgaattccg catccgtggc gtcgccacca 1380

acctgacctt cctcgaagcg atcatcggcc atccgaaatt ccgcgacaac agctacacca 1440

cccgcttcat cgacacgacg ccggagctct tccagcaggt caagcgccag gaccgcgcga 1500

cgaagcttct gacctatctc gccgacgtca ccgtcaatgg ccatcccgag gccaaggaca 1560

ggccgaagcc cctcgagaat gccgccaggc cggtggtgcc ctatgccaat ggcaacgggg 1620

tgaaggacgg caccaagcag ctgctcgata cgctcggccc gaaaaaattc ggcgaatgga 1680

tgcgcaatga gaagcgcgtg cttctgaccg acaccacgat gcgcgacggc caccagtcgc 1740

tgctcgcaac ccgcatgcgt acctatgaca tcgccaggat cgccggcacc tattcgcatg 1800

cgctgccgaa cctcttgtcg ctcgaatgct ggggcggcgc caccttcgac gtctcgatgc 1860

gcttcctcac cgaagatccg tgggagcggc tggcgctgat ccgagagggg gcgccgaacc 1920

tgctcctgca gatgctgctg cgcggcgcca atggcgtcgg ttacaccaac tatcccgaca 1980

atgtcgtcaa atacttcgtc cgccaggcgg ccaaaggcgg catcgatctc ttccgcgtct 2040

tcgactgcct gaactgggtc gagaatatgc gggtgtcgat ggatgcgatt gccgaggaga 2100

acaagctctg cgaggcggcg atctgctaca ccggcgatat cctcaattcc gcccgcccga 2160

aatacgactt gaaatattac accaaccttg ccgtcgagct tgagaaggcc ggcgcccata 2220

tcattgcggt caaggatatg gcgggccttc tgaagccggc tgctgccaag gttctgttca 2280

aggcgctgcg tgaagcaacc ggcctgccga tccatttcca cacgcatgac acctcgggca 2340

ttgcggcggc aacggttctt gccgccgtcg aagccggtgt cgatgccgtc gatgcggcga 2400

tggatgcgct ctccggcaac acctcgcaac cctgtctcgg ctcgatcgtc gaggcgctct 2460

ccggctccga gcgcgatccc ggcctcgatc cggcatggat ccgccgcatc tccttctatt 2520

gggaagcggt gcgcaaccag tatgccgcct tcgaaagcga cctcaaggga ccggcatcgg 2580

aagtctatct gcatgaaatg ccgggcggcc agttcaccaa cctcaaggag caggcccgct 2640

cgctggggct ggaaacccgc tggcaccagg tggcgcaggc ctatgccgac gccaaccaga 2700

tgttcggcga tatcgtcaag gtgacgccat cctccaaggt cgtcggcgac atggcgctga 2760

tgatggtctc ccaggacctg accgtcgccg atgtcgtcag ccccgaccgc gaagtctcct 2820

tcccggaatc ggtcgtctcg atgctgaagg gcgatctcgg ccagcctccg tctggatggc 2880

cggaagcgct gcagaagaaa gcattgaagg gcgaaaagcc ctatacggtg cgccccggct 2940

cgctgctcaa ggaagccgat ctcgatgcgg aacgcaaagt catcgagaag aagcttgagc 3000

gcgaggtcag cgacttcgaa ttcgcttcct atctgatgta tccgaaggtc ttcaccgact 3060

ttgcgcttgc ctccgatacc tacggtccgg tttcggtgct gccgacgccc gcctattttt 3120

acgggttggc ggacggcgag gagctgttcg ccgacatcga gaagggcaag acgctcgtca 3180

tcgtcaatca ggcggtgagc gccaccgaca gccagggcat ggtcactgtc ttcttcgagc 3240

tcaacggcca gccgcgccgt atcaaggtgc ccgatcgggc ccacggggcg acgggagccg 3300

ccgtgcgccg caaggccgaa cccggcaatg ccgcccatgt cggtgcgccg atgccgggcg 3360

tcatcagccg tgtctttgtc tcttcaggcc aggccgtcaa tgccggcgac gtgctcgtct 3420

ccatcgaggc catgaagatg gaaaccgcga tccatgcgga aaaggacggc accattgccg 3480

aagtgctggt caaggccggc gatcagatcg atgccaagga cctgctggcg gtttacggcg 3540

gatgatctag aaggaggaac cgtatgaaaa cccgtacaca acaaattgaa gaattacaga 3600

aagagtggac tcaaccgcgt tgggaaggca ttactcgccc atacagtgcg gaagatgtgg 3660

tgaaattacg cggttcagtc aatcctgaat gcacgctggc gcaactgggc gcagcgaaaa 3720

tgtggcgtct gctgcacggt gagtcgaaaa aaggctacat caacagcctc ggcgcactga 3780

ctggcggtca ggcgctgcaa caggcgaaag cgggtattga agcagtctat ctgtcgggat 3840

ggcaggtagc ggcggacgct aacctggcgg ccagcatgta tccggatcag tcgctctatc 3900

cggcaaactc ggtgccagct gtggtggagc ggatcaacaa caccttccgt cgtgccgatc 3960

agatccaatg gtccgcgggc attgagccgg gcgatccgcg ctatgtcgat tacttcctgc 4020

cgatcgttgc cgatgcggaa gccggttttg gcggtgtcct gaatgccttt gaactgatga 4080

aagcgatgat tgaagccggt gcagcggcag ttcacttcga agatcagctg gcgtcagtga 4140

agaaatgcgg tcacatgggc ggcaaagttt tagtgccaac tcaggaagct attcagaaac 4200

tggtcgcggc gcgtctggca gctgacgtga cgggcgttcc aaccctgctg gttgcccgta 4260

ccgatgctga tgcggcggat ctgatcacct ccgattgcga cccgtatgac agcgaattta 4320

ttaccggcga gcgtaccagt gaaggcttct tccgtactca tgcgggcatt gagcaagcga 4380

tcagccgtgg cctggcgtat gcgccatatg ctgacctggt ctggtgtgaa acctccacgc 4440

cggatctgga actggcgcgt cgctttgcac aagctatcca cgcgaaatat ccgggcaaac 4500

tgctggctta taactgctcg ccgtcgttca actggcagaa aaacctcgac gacaaaacta 4560

ttgccagctt ccagcagcag ctgtcggata tgggctacaa gttccagttc atcaccctgg 4620

caggtatcca cagcatgtgg ttcaacatgt ttgacctggc aaacgcctat gcccagggcg 4680

agggtatgaa gcactacgtt gagaaagtgc agcagccgga atttgccgcc gcgaaagatg 4740

gctatacctt cgtatctcac cagcaggaag tgggtacagg ttacttcgat aaagtgacga 4800

ctattattca gggcggcacg tcttcagtca ccgcgctgac cggctccact gaagaatcgc 4860

agttctaaag gaggcacacg atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata 4920

cagctgttga actggatgtg ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta 4980

ctctcggttc aaaaggtgtg ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg 5040

aatctaaaat tacttttatt gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga 5100

tcgatcagct ggcgaccgat tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg 5160

aaaaaccgac tcaggaacag tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga 5220

tccacgagca gattacccgt ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag 5280

tcatgtgtgg tattaccggc gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca 5340

atcctcgtca ccgtgaaatt gccgcgttcc tcctgctgtc gaaaatgccg actatggccg 5400

cgatgtgtta caagtattcc attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct 5460

acgccggtaa cttcctgaat atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc 5520

cgattctgga acgtgctatg gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg 5580

cctctacctc caccgtgcgt accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg 5640

cagcaggtat tgcttcactg tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga 5700

aaatgctgga agaaatcagc tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag 5760

acaaaaatga ttctttccgc ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc 5820

cgcgcgccac cgtaatgcgt gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg 5880

atgacctgct ggaagtggct atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta 5940

tcgagaagaa actgtacccg aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg 6000

gtattccgtc ttccatgttc accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg 6060

cccactggag cgaaatgcac agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata 6120

caggatatga aaaacgcgac tttaaaagcg atatcaagcg ttaaaggagg cacacgatgg 6180

atatcatctt ttatcaccca acgttcgata cccaatggtg gattgaggca ctgcgcaaag 6240

ctattcctca ggcaagagtc agagcatgga aaagcggaga taatgactct gctgattatg 6300

ctttagtctg gcatcctcct gttgaaatgc tggcagggcg cgatcttaaa gcggtgttcg 6360

cactcggggc cggtgttgat tctattttga gcaagctaca ggcacaccct gaaatgctga 6420

acccttctgt tccacttttt cgcctggaag ataccggtat gggcgagcaa atgcaggaat 6480

atgctgtcag tcaggtgctg cattggtttc gacgttttga cgattatcgc atccagcaaa 6540

atagttcgca ttggcaaccg ctgcctgaat atcatcggga agattttacc atcggcattt 6600

tgggcgcagg cgtactgggc agtaaagttg ctcagagtct gcaaacctgg cgctttccgc 6660

tgcgttgctg gagtcgaacc cgtaaatcgt ggcctggcgt gcaaagcttt gccggacggg 6720

aagaactgtc tgcatttctg agccaatgtc gggtattgat taatttgtta ccgaataccc 6780

ctgaaaccgt cggcattatt aatcaacaat tactcgaaaa attaccggat ggcgcgtatc 6840

tcctcaacct ggcgcgtggt gttcatgttg tggaagatga cctgctcgcg gcgctggata 6900

gcggcaaagt taaaggcgca atgttggatg tttttaatcg tgaaccctta ccgcctgaaa 6960

gtccgctctg gcaacatcca cgcgtgacga taacaccaca tgtcgccgcg attacccgtc 7020

ccgctgaagc tgtggagtac atttctcgca ccattgccca gctcgaaaaa ggggagaggg 7080

tctgcgggca agtcgaccgc gcacgcggct actaatctat gatatcgaat tcctgcagcc 7140

cgggggatcc catggtacgc gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 7200

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 7260

<210> 25

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自pACT3的Ptac启动子

<400> 25

cggagcttat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct 60

gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc 120

cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg 180

agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 240

tcacacagga aacagaattc 260

<210> 26

<211> 2123

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 荚膜甲基球菌菌株Bath的sucCD

<400> 26

gaattcctat aattttgttt aactttaagg aggggtacca tgaatatcca tgagtaccag 60

gccaaggagc tgctcaagac ctatggcgtg cccgtgcccg acggcgccgt tgcctattcc 120

gacgcgcagg ccgccagcgt cgccgaggag atcggcggca gccgctgggt ggtcaaggcg 180

cagatccatg ccggcggtcg cggcaaggcc gggggcgtaa aggtcgccca ctccatcgag 240

gaagtccgcc aatacgccga cgccatgctc ggcagccacc tcgtcaccca tcagaccggc 300

ccgggaggct cgctggttca gcgtctgtgg gtggaacagg ccagccatat caaaaaggaa 360

tactacctgg gcttcgtgat cgatcgcggc aatcaacgca tcaccctgat cgcctccagc 420

gagggcggca tggaaatcga ggaagtcgca aaggaaaccc cggagaaaat cgtcaaggaa 480

gtcgtcgatc cggccatagg cctgctggac ttccagtgcc gcaaggtcgc cacggcgatc 540

ggcctgaaag gcaaactgat gccccaggcc gtcaggctga tgaaggccat ctaccgctgc 600

atgcgcgaca aagatgccct gcaggccgaa atcaatcctc tggccatcgt gggcgaaagc 660

gacgaatcgc tcatggtcct ggatgccaag ttcaacttcg acgacaacgc cctgtaccgg 720

cagcgcacca tcaccgagat gcgcgacctg gccgaggaag acccgaaaga ggtcgaagcc 780

tccggccacg gtctcaatta catcgccctc gacggcaaca tcggctgcat cgtcaatggc 840

gccggcctcg ccatggcttc gctcgacgcc atcaccctgc atggcggccg tccggccaac 900

ttcctcgacg tgggcggcgg cgcctccccc gagaaggtca ccaatgcctg ccgcatcgta 960

ctggaagatc ccaacgtccg ctgcatcctg gtcaacatct ttgccggcat caaccgctgt 1020

gactggatcg ccaagggcct gatccaggcc tgcgacagcc tgcagatcaa ggtgccgctg 1080

atcgtgcgcc tggccgggac gaacgtcgac gagggccgca agatcctggc cgaatccggc 1140

ctctccttca tcaccgcgga aaatctggac gacgcggccg ccaaggccgt cgccatcgtc 1200

aagggataac agtcatgagc gtattcgtta acaagcactc caaggtcatc ttccagggct 1260

tcaccggcga gcacgccacc ttccacgcca aggacgccat gcggatgggc acccgggtgg 1320

tcggcggtgt cacccctggc aaaggcggca cccgccatcc cgatcccgaa ctcgctcatc 1380

tgccggtgtt cgacaccgtg gctgaagccg tggccgccac cggcgccgac gtctccgccg 1440

tgttcgtgcc gccgcccttc aatgcggacg cgttgatgga agccatagac gccggcatcc 1500

gggtcgccgt gaccatcgcc gacggcatcc cggtacacga catgatccga ctgcagcgct 1560

accgggtggg taaggattcc atcgtgatcg gaccgaacac ccccggcatc atcacgccgg 1620

gcgagtgcaa ggtgggcatc atgccttcgc acatttacaa gaagggcaac gtcggcatcg 1680

tgtcgcgctc cggcaccctc aattacgagg cgacggaaca gatggccgcg cttgggctgg 1740

gcatcaccac ctcggtcggt atcggcggtg accccatcaa cggaaccgat ttcgtcactg 1800

tcctgcgcgc cttcgaagcc gacccggaaa ccgagatcgt ggtgatgatc ggcgaaatcg 1860

gcggccccca ggaagtcgcc gccgcccgct gggccaagga aaacatgaca aagccggtca 1920

tcggcttcgt cgcaggcctt gccgcaccga ccggccgacg catgggccat gccggcgcca 1980

tcatctccag cgaggccgac accgccggag ccaagatgga cgccatggaa gccttggggc 2040

tgtatgtcgc ccgcaacccg gcacagatcg gccagaccgt gctacgcgcc gcgcaggaac 2100

acggaatcag attctgatct aga 2123

<210> 27

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扭脱甲基杆菌AM1的mcl

<400> 27

atgagcttca ccctgatcca gcaggccacc ccgcgcctgc accgctcgga actcgcggtt 60

cccggctcca acccgacctt catggagaag tcggccgcct cgaaggccga cgtgatcttc 120

ctcgacctcg aggacgcggt tgcgcccgac gacaaggagc aggcccgcaa gaacatcatc 180

caggccctca acgacctgga ttggggcaac aagaccatga tgatccgcat caacggtctc 240

gacacccact acatgtaccg cgacgtggtg gacatcgtgg aggcctgccc gcgcctcgac 300

atgatcctga tccccaaggt cggcgtgccg gccgacgtct acgccatcga cgtgctgacg 360

acgcagatcg agcaggccaa gaagcgcgag aagaagatcg gcttcgaggt gctgatcgag 420

accgcgctcg gcatggccaa tgtcgaggcg atcgcgacct cgtctaagcg ccttgaggcg 480

atgtccttcg gtgtcgccga ctacgccgct tccacccgcg cccgctccac cgtgatcggc 540

ggcgtcaacg ccgattacag cgtgctcacc gacaaggacg aggccggcaa ccgccagacc 600

cactggcagg atccgtggct gttcgcccag aaccgcatgc tggtcgcctg ccgcgcctac 660

ggcctgcgcc cgatcgacgg tcccttcggc gacttctccg atccggacgg ctacacctcg 720

gccgctcgcc gctgcgccgc gctcggcttc gagggcaagt gggcgatcca cccctcgcag 780

atcgatctcg ccaacgaggt cttcaccccc tccgaggccg aggtcaccaa ggcccgccgc 840

atcctggaag ccatggaaga ggccgccaag gccggccgcg gcgccgtctc gctcgacggc 900

cgtctcatcg acatcgcctc gatccgcatg gccgaggcgc tgatccagaa ggccgacgcg 960

atgggcggaa agtaa 975

<210> 28

<211> 3489

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptac_sucC_sucD_mcl合成的操纵子

<400> 28

cggagcttat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct 60

gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc 120

cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg 180

agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 240

tcacacagga aacagaattc ctataatttt gtttaacttt aaggaggggt accatgaata 300

tccatgagta ccaggccaag gagctgctca agacctatgg cgtgcccgtg cccgacggcg 360

ccgttgccta ttccgacgcg caggccgcca gcgtcgccga ggagatcggc ggcagccgct 420

gggtggtcaa ggcgcagatc catgccggcg gtcgcggcaa ggccgggggc gtaaaggtcg 480

cccactccat cgaggaagtc cgccaatacg ccgacgccat gctcggcagc cacctcgtca 540

cccatcagac cggcccggga ggctcgctgg ttcagcgtct gtgggtggaa caggccagcc 600

atatcaaaaa ggaatactac ctgggcttcg tgatcgatcg cggcaatcaa cgcatcaccc 660

tgatcgcctc cagcgagggc ggcatggaaa tcgaggaagt cgcaaaggaa accccggaga 720

aaatcgtcaa ggaagtcgtc gatccggcca taggcctgct ggacttccag tgccgcaagg 780

tcgccacggc gatcggcctg aaaggcaaac tgatgcccca ggccgtcagg ctgatgaagg 840

ccatctaccg ctgcatgcgc gacaaagatg ccctgcaggc cgaaatcaat cctctggcca 900

tcgtgggcga aagcgacgaa tcgctcatgg tcctggatgc caagttcaac ttcgacgaca 960

acgccctgta ccggcagcgc accatcaccg agatgcgcga cctggccgag gaagacccga 1020

aagaggtcga agcctccggc cacggtctca attacatcgc cctcgacggc aacatcggct 1080

gcatcgtcaa tggcgccggc ctcgccatgg cttcgctcga cgccatcacc ctgcatggcg 1140

gccgtccggc caacttcctc gacgtgggcg gcggcgcctc ccccgagaag gtcaccaatg 1200

cctgccgcat cgtactggaa gatcccaacg tccgctgcat cctggtcaac atctttgccg 1260

gcatcaaccg ctgtgactgg atcgccaagg gcctgatcca ggcctgcgac agcctgcaga 1320

tcaaggtgcc gctgatcgtg cgcctggccg ggacgaacgt cgacgagggc cgcaagatcc 1380

tggccgaatc cggcctctcc ttcatcaccg cggaaaatct ggacgacgcg gccgccaagg 1440

ccgtcgccat cgtcaaggga taacagtcat gagcgtattc gttaacaagc actccaaggt 1500

catcttccag ggcttcaccg gcgagcacgc caccttccac gccaaggacg ccatgcggat 1560

gggcacccgg gtggtcggcg gtgtcacccc tggcaaaggc ggcacccgcc atcccgatcc 1620

cgaactcgct catctgccgg tgttcgacac cgtggctgaa gccgtggccg ccaccggcgc 1680

cgacgtctcc gccgtgttcg tgccgccgcc cttcaatgcg gacgcgttga tggaagccat 1740

agacgccggc atccgggtcg ccgtgaccat cgccgacggc atcccggtac acgacatgat 1800

ccgactgcag cgctaccggg tgggtaagga ttccatcgtg atcggaccga acacccccgg 1860

catcatcacg ccgggcgagt gcaaggtggg catcatgcct tcgcacattt acaagaaggg 1920

caacgtcggc atcgtgtcgc gctccggcac cctcaattac gaggcgacgg aacagatggc 1980

cgcgcttggg ctgggcatca ccacctcggt cggtatcggc ggtgacccca tcaacggaac 2040

cgatttcgtc actgtcctgc gcgccttcga agccgacccg gaaaccgaga tcgtggtgat 2100

gatcggcgaa atcggcggcc cccaggaagt cgccgccgcc cgctgggcca aggaaaacat 2160

gacaaagccg gtcatcggct tcgtcgcagg ccttgccgca ccgaccggcc gacgcatggg 2220

ccatgccggc gccatcatct ccagcgaggc cgacaccgcc ggagccaaga tggacgccat 2280

ggaagccttg gggctgtatg tcgcccgcaa cccggcacag atcggccaga ccgtgctacg 2340

cgccgcgcag gaacacggaa tcagattctg atctagacta taattttgtt taactttaag 2400

gaggtttgga atgagcttca ccctgatcca gcaggccacc ccgcgcctgc accgctcgga 2460

actcgcggtt cccggctcca acccgacctt catggagaag tcggccgcct cgaaggccga 2520

cgtgatcttc ctcgacctcg aggacgcggt tgcgcccgac gacaaggagc aggcccgcaa 2580

gaacatcatc caggccctca acgacctgga ttggggcaac aagaccatga tgatccgcat 2640

caacggtctc gacacccact acatgtaccg cgacgtggtg gacatcgtgg aggcctgccc 2700

gcgcctcgac atgatcctga tccccaaggt cggcgtgccg gccgacgtct acgccatcga 2760

cgtgctgacg acgcagatcg agcaggccaa gaagcgcgag aagaagatcg gcttcgaggt 2820

gctgatcgag accgcgctcg gcatggccaa tgtcgaggcg atcgcgacct cgtctaagcg 2880

ccttgaggcg atgtccttcg gtgtcgccga ctacgccgct tccacccgcg cccgctccac 2940

cgtgatcggc ggcgtcaacg ccgattacag cgtgctcacc gacaaggacg aggccggcaa 3000

ccgccagacc cactggcagg atccgtggct gttcgcccag aaccgcatgc tggtcgcctg 3060

ccgcgcctac ggcctgcgcc cgatcgacgg tcccttcggc gacttctccg atccggacgg 3120

ctacacctcg gccgctcgcc gctgcgccgc gctcggcttc gagggcaagt gggcgatcca 3180

cccctcgcag atcgatctcg ccaacgaggt cttcaccccc tccgaggccg aggtcaccaa 3240

ggcccgccgc atcctggaag ccatggaaga ggccgccaag gccggccgcg gcgccgtctc 3300

gctcgacggc cgtctcatcg acatcgcctc gatccgcatg gccgaggcgc tgatccagaa 3360

ggccgacgcg atgggcggaa agtaaacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct 3420

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 3480

aggacaaat 3489

<210> 29

<211> 2652

<212> DNA

<213> 大肠杆菌ppcK620S

<400> 29

atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60

gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120

ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180

caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240

ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300

ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360

accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420

gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480

ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540

ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600

gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660

ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720

gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780

gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840

aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900

gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960

tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020

aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080

cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140

cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200

cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260

tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320

ctgccgcgca actggcaacc aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg 1380

attgccgaag caccgcaagg ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg 1440

tccgacgtac tggctgtcca cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg 1500

gttgctccgc tgtttgaaac cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag 1560

ctgctcaata ttgactggta tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc 1620

tattccgact cagcaaaaga tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca 1680

caggatgcat taatcaaaac ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt 1740

cgcggcggtt ccattggtcg cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg 1800

ccaggaagcc tgaaaggcgg cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttagc 1860

tatggtctgc cagaaatcac cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa 1920

gccaacctgc tgccaccgcc ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg 1980

tcagtcatct cctgcgatgt ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct 2040

tacttccgct ccgctacgcc ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg 2100

gcgaaacgtc gcccaaccgg cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc 2160

tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220

gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280

tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340

tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400

ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460

gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520

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gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640

aataccggct aa 2652

<210> 30

<211> 6602

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptac- ppcK620S-aceA-gltAR163L-ghrA合成的操纵子

<400> 30

cggagcttat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct 60

gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc 120

cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg 180

agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 240

tcacacagga aacagaattc gagctcggta cccgggatga acgaacaata ttccgcattg 300

cgtagtaatg tcagtatgct cggcaaagtg ctgggagaaa ccatcaagga tgcgttggga 360

gaacacattc ttgaacgcgt agaaactatc cgtaagttgt cgaaatcttc acgcgctggc 420

aatgatgcta accgccagga gttgctcacc accttacaaa atttgtcgaa cgacgagctg 480

ctgcccgttg cgcgtgcgtt tagtcagttc ctgaacctgg ccaacaccgc cgagcaatac 540

cacagcattt cgccgaaagg cgaagctgcc agcaacccgg aagtgatcgc ccgcaccctg 600

cgtaaactga aaaaccagcc ggaactgagc gaagacacca tcaaaaaagc agtggaatcg 660

ctgtcgctgg aactggtcct cacggctcac ccaaccgaaa ttacccgtcg tacactgatc 720

cacaaaatgg tggaagtgaa cgcctgttta aaacagctcg ataacaaaga tatcgctgac 780

tacgaacaca accagctgat gcgtcgcctg cgccagttga tcgcccagtc atggcatacc 840

gatgaaatcc gtaagctgcg tccaagcccg gtagatgaag ccaaatgggg ctttgccgta 900

gtggaaaaca gcctgtggca aggcgtacca aattacctgc gcgaactgaa cgaacaactg 960

gaagagaacc tcggctacaa actgcccgtc gaatttgttc cggtccgttt tacttcgtgg 1020

atgggcggcg accgcgacgg caacccgaac gtcactgccg atatcacccg ccacgtcctg 1080

ctactcagcc gctggaaagc caccgatttg ttcctgaaag atattcaggt gctggtttct 1140

gaactgtcga tggttgaagc gacccctgaa ctgctggcgc tggttggcga agaaggtgcc 1200

gcagaaccgt atcgctatct gatgaaaaac ctgcgttctc gcctgatggc gacacaggca 1260

tggctggaag cgcgcctgaa aggcgaagaa ctgccaaaac cagaaggcct gctgacacaa 1320

aacgaagaac tgtgggaacc gctctacgct tgctaccagt cacttcaggc gtgtggcatg 1380

ggtattatcg ccaacggcga tctgctcgac accctgcgcc gcgtgaaatg tttcggcgta 1440

ccgctggtcc gtattgatat ccgtcaggag agcacgcgtc ataccgaagc gctgggcgag 1500

ctgacccgct acctcggtat cggcgactac gaaagctggt cagaggccga caaacaggcg 1560

ttcctgatcc gcgaactgaa ctccaaacgt ccgcttctgc cgcgcaactg gcaaccaagc 1620

gccgaaacgc gcgaagtgct cgatacctgc caggtgattg ccgaagcacc gcaaggctcc 1680

attgccgcct acgtgatctc gatggcgaaa acgccgtccg acgtactggc tgtccacctg 1740

ctgctgaaag aagcgggtat cgggtttgcg atgccggttg ctccgctgtt tgaaaccctc 1800

gatgatctga acaacgccaa cgatgtcatg acccagctgc tcaatattga ctggtatcgt 1860

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caagaactgg gcaaactgcc gttgggttca cgtccggcga aacgtcgccc aaccggcggc 2400

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gtgttcacct ttgacccagg cttcacttca accgcatcct gcgaatctaa aattactttt 4440

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cgtgaaacct gccatgaagt gctgaaagag ctgggcacga aggatgacct gctggaagtg 5280

gctatggagc tggaaaacat cgcgctgaac gacccgtact ttatcgagaa gaaactgtac 5340

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ctgagccaat gtcgggtatt gattaatttg ttaccgaata cccctgaaac cgtcggcatt 6180

attaatcaac aattactcga aaaattaccg gatggcgcgt atctcctcaa cctggcgcgt 6240

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tt 6602

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<220>

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<211> 22

<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

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<400> 38

tccgccaaaa cagaagcttt ctagattagt agccgcgtgc gcg 43