阅读说明：本技术 一种利用大肠杆菌发酵生产l-茶氨酸的方法 (Method for producing L-theanine by using escherichia coli fermentation ) 是由 曹华杰 谢沛 李静 张孟涛 封浪 刘晓东 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法,属于生物工程技术领域,所述方法是在发酵培养过程中,将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时,向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h,合成L-茶氨酸。发酵周期短、产酸效率高、菌体密度高；底物转化率高；而且工艺简单,环境污染低,降低了L~茶氨酸的生产成本,有利于工业化生产的推广和应用。(the invention relates to a method for producing L ~ theanine by fermenting escherichia coli, which belongs to the technical field of bioengineering, and the method comprises the steps of culturing escherichia coli in a fermentation tank until OD is 20 ~ 30 in the fermentation culture process, adding D ~ xylose into the fermentation tank to enable the concentration of the D ~ xylose to be 5 ~ 20g/L, adjusting the temperature to 28 ~ 35 ℃, inducing for 4 ~ 5 hours, then supplementing 40 ~ 80% of ethylamine solution at a constant flow rate with the volume ratio of fermentation liquor to ethylamine solution being 100 ~ 300:1, continuously fermenting and culturing for 20 ~ 30 hours under the conditions of pH6.5 ~ 7.5, temperature being 35 ~ 40 ℃ and dissolved oxygen being 10 ~ 40%, and synthesizing the L ~ theanine.)

一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法。。

背景技术

L~茶氨酸(L~theanine)，是存在于茶叶中的一种氨基酸。其可促进大脑表皮 α 波的形成而让人感觉放松，可降低人体内 5~羟色胺的浓度起到降血压的作用，并在肿瘤治疗和神经保护等方面也有广泛的应用。美国食品与药物管理局(FDA)已确认 L~茶氨酸是一种公认安全(GRAS)的产品。

γ~谷氨酰基转肽酶 ( γ~glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是谷胱甘肽代谢途径中的关键酶，是由大、小亚基组成的异源二聚体，其催化的反应有2种类型：一种是催化γ~谷氨酰基化合物的水解反应，另外一种是催化γ~谷氨酰基化合物中的γ~谷氨酰基转移到氨基酸或多肽等物质上的转肽反应。Suzuki 等首先报道了E.coli K~12 SH642来源的GGT能够催化L~谷氨酰胺与乙胺生成L~茶氨酸。该反应无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程不需要ATP的参与，因此利用GGT来催化合成L~茶氨酸已成为目前研究的热点。王丽鸳等利用大肠杆菌 E.coli BL21 (DE3) /pET32a~GGT催化L~谷氨酰胺与乙胺合成L~茶氨酸，该工程菌在pH9.5，32~37 ℃下能催化合成的产量为20.9 g/L。帅玉英等利用Bacillus subtilis SK11．004来源的GGT在 pH10.0，37 ℃下，以20 mmol/L L~谷氨酰胺为底物，摩尔转化率可达95%。ShrutiBindal 等利用Bacillus licheniformis ER~15来源的rBLGGT，80 mmol/L L~谷氨酰胺为初始底物，经3次补加后可催化合成L~茶氨酸35.2 g/L。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种利用大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的方法，所述方法是在发酵阶段加入D-木糖低温诱导，然后加入乙胺，在一定的发酵条件下进行产酸发酵，周期较短，L-产氨酸的产量和得率较高。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法，所述方法是在发酵培养过程中，将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时，向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h；然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，合成 L-茶氨酸。

作为对上述方案的进一步优化，所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵培养；

所述种子培养是将活化菌种接种到种子培养基中进行培养，培养条件为：温度35~40℃、摇床转速200rmp、培养至OD为10-20；

所述发酵培养是将菌种以5-15%的接种量接种至发酵培养基后进行产酸发酵，培养条件为：初始发酵温度35~40℃，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.5-7.5之间，摇床转速200rmp。

作为对上述方案的更进一步优化，所述种子培养基的配方为：葡萄糖20~30g/L，K₂HPO₄ 10-20g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5~3.0g/L，KH₂PO₄ 10-20g/L，酵母粉0.5-5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5.0~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，pH6.7。

作为对上述方案的更进一步优化，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖20~30g/L，K₂HPO₄ 10-20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5~3.0g/L，酵母粉0.5-3.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5.0~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，初始pH7.0。

有益效果：

1、本发明所述方法采用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸，该菌株发酵为好氧发酵，菌体生长快；在产酸发酵阶段，首先采用D-木糖低温诱导，然后加入乙胺提供L-茶氨酸的合成原料，茶氨酸合成酶具有高度专一性，只能催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸；然后在整个发酵系统的调控下，使得L-茶氨酸的产量显著增高。

2、采用本发明所述发酵方法，发酵周期短，菌体密度大。 L~茶氨酸的产量和得率高、糖酸转化率高的优点，代谢副产物较少，生产成本降低，方便提取。

具体实施方式

一种利用大肠杆菌菌株发酵法生产 L~茶氨酸的方法。具体步骤如下：

1、大肠杆菌菌株发酵法生产 L~茶氨酸

斜面培养：大肠杆菌原始菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱35~40℃培养12-20h。

种子培养：挑取单菌落接种到种子培养基中，培养条件：温度35~40℃、摇床转速200rmp，培养OD值长到10.0~20.0。

发酵培养：接种到发酵培养基中，接种量：5~~15%，培养条件：初始发酵温度35-40℃，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.5-7.5之间，摇床转速200rmp，当培养OD值达到20~30，添加D~木糖使得D~木糖的浓度为5~20g/L，并降温至28~35℃诱导4~5h后，开始以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃，溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，发酵结束后得含有L-茶氨酸的发酵液。

所述种子培养基，其各组分的含量为：葡萄糖20~30g/L，K₂HPO₄10~20g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5~3.0g/L，KH₂PO₄ 10~20g/L， 酵母粉0.5~5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，pH 6.7。

所述发酵培养基，其各组分的含量为：葡萄糖20~30g/L，K₂HPO₄ 10~20g/L,MgSO₄·7H₂O 0.5~3.0g/L， 酵母粉0.5~3.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 5~10.0g/L，微量元素5~10.0mL/L，初始pH 7.0。

2、从大肠杆菌发酵液中提取 L~茶氨酸的方法

将上述所得发酵液加热到40~60℃，用2mo1/L盐酸调节pH至2~5范围内，加入无水亚硫酸氢钠，过30nm陶瓷膜微滤，纯化水清洗2~3次，得到上清液；取上清液过1000~5000分子量的中空纤维束膜，此时 L~茶氨酸回收率为92.3~95.4%。将上清液过强酸性阳离子交换柱，条件为静态吸附：按20%体积比加入阳离子树脂，搅拌吸附1h；动态吸附：按15%体积装柱树脂，流速按2BV/h进料，末期用0.5~1BV水冲柱；收集上清液。将上清液按体积比0.5~1%加入活性炭60℃脱色0.5~2h，过滤除炭。收集得到 L~茶氨酸上清液进行真空浓缩，按照下列条件进行：真空度~0.1MPa，旋转速度100~200rpm，温度50℃~80℃浓缩。将 L~茶氨酸浓缩液进行降温结晶。提取收率为70.0~88.5%。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

接种大肠杆菌原始菌株到斜面，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于完全培养基（LB）上，挑取单个菌落分别接种到斜面上，生化培养箱35~40℃培养20h。挑取单菌落接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度35~40℃、摇床转速200rmp培养OD值长到10.0。

接种到发酵培养基中，接种量：7%，培养条件：初始发酵温度35-40℃，摇床转速200rmp，当培养OD值达到20，添加D~木糖使得D~木糖的浓度为5g/L，并降温至28~35℃诱导4~5h后，开始以发酵液与乙胺溶液体积比为100:1的恒定流速补加体积浓度为40%的乙胺溶液，继续在pH7.0~7.2、温度35~40℃，溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，发酵结束后检测 L~茶氨酸含量为38.37g/L。

作为对照，采用相同的发酵方法，在发酵阶段补加相同浓度的乙胺盐酸盐溶液，检测 L~茶氨酸含量为25.65g/L。采用本发明所述方法，相比对照，产量提高了49.95%。

实施例2

从新鲜斜面上挑取一环大肠杆菌接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度35~40℃、摇床转速200rmp，当OD值长到15.0时，将摇瓶种子以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中进行二级种子培养。培养温度35~40℃，罐压0.01~0.05MPa，空气流量1~8L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~50%，pH值控制在6.5~7.5之间，培养时间为5~8h。

将二级种子以10%接种量接入装有18L发酵培养基的30L全自动发酵罐中进行产酸发酵。发酵初始温度35~40℃，罐压0.01~0.15MPa，空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.5~7.5之间，摇床转速200rmp，当培养OD值达到25，添加D~木糖使得D~木糖的浓度为15g/L，并降温至28~35℃诱导4~5h后，开始以发酵液与乙胺溶液体积比为300:1的恒定流速补加体积浓度为70%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.2、温度35~40℃，溶氧10~50%的条件下发酵培养20-30h，发酵结束后检测L-茶氨酸含量为120.33g/L。作为对照，采用相同的方法，在发酵阶段补加相同浓度的乙胺盐酸盐溶液，检测L~茶氨酸含量为67.24g/L。采用本发明所述方法，相比对照，产量提高了78.96%。

实施例3

从新鲜斜面上挑取一环大肠杆菌接种到500mL种子瓶中，培养条件：温度35~40℃、摇床转速200rmp，当OD值长到20.0左右时，将摇瓶种子接入装有0.6m³发酵培养基的2m³发酵罐中进行二级种子培养。培养温度35~40℃，罐压0.01~0.05MPa，空气流量0.1~0.6m³/min和搅拌速度100~300r/min使溶氧维持在10~50%，pH值控制在6.5~7.5之间，培养时间为5~8h。

将二级种子以10%接种量分别接入装有6 m³发酵培养基的10 m³发酵罐中进行产酸发酵。发酵初始温度35~40℃，罐压0.01~0.15MPa，使溶氧维持在10~40%，发酵pH值控制在6.5~7.5之间，摇床转速200rmp，当培养OD值达到30，添加D~木糖使得D~木糖的浓度为20g/L，并降温至28~35℃诱导4~5h后，开始以发酵液与乙胺溶液体积比为200:1的恒定流速补加体积浓度为80%的乙胺溶液，继续在pH6.5~7.2、温度35~40℃，溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h，发酵结束后检测L-茶氨酸含量为117.86g/L。作为对照，采用相同的方法，在发酵阶段补加相同浓度的乙胺盐酸盐溶液，检测 L~茶氨酸含量为61.25g/L。采用本发明所述方法，相比对照，产量提高了91.42%。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。