阅读说明：本技术 一种利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的方法 (Method for producing amino acid by hydrolyzing feather with keratinase ) 是由 张娟 彭政 陈坚 堵国成 冒鑫哲 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的方法,属于酶工程技术领域。本发明通过额外添加亚硫酸钠大大提高了利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率,利用本发明的方法,将角蛋白酶和亚硫酸钠同时加入含有羽毛的反应体系中进行反应,反应4h,即可使反应液中氨基酸的含量高达56.6g/L、氨基酸转化率高达56.6％。(The invention discloses a method for producing amino acid by hydrolyzing feathers with keratinase, belonging to the technical field of enzyme engineering. According to the method, the hydrolysis efficiency of producing amino acid by hydrolyzing feathers with keratinase is greatly improved by additionally adding sodium sulfite, and the keratinase and the sodium sulfite are simultaneously added into a reaction system containing feathers for reaction for 4 hours, so that the content of the amino acid in a reaction solution can reach 56.6g/L, and the conversion rate of the amino acid can reach 56.6%.)

一种利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

角蛋白存在于许多脊椎动物的外骨骼结构中，如羽毛、头发、鳞片、蹄、角和爪等，是一种坚韧的不溶性蛋白。并且，角蛋白在各种脊椎动物的外骨骼结构中含量较高，高达80％左右。

我国拥有丰富的角蛋白资源，尤其在现在农业中，大规模的家禽养殖产生了大量角蛋白废物，这些角蛋白废物主要是禽类的羽毛，它们大多未被充分利用，有的甚至污染环境，造成公害。若将这些角蛋白废物加以处理，可以使之转化成很好的资源。

角蛋白酶是一种能够水解角蛋白的特异性蛋白酶，其可将角蛋白水解为应用广泛的氨基酸和多肽。因此，利用角蛋白酶水解角蛋白是一种很好的实现角蛋白资源化的方法。

但是，野生角蛋白酶的性能拙劣，利用这些野生角蛋白酶水解角蛋白的水解效率十分低下(具体可见参考文献：W.H.Lo,J.R.Too,J.Y.Wu,Production of keratinolyticenzyme by an indigenous feather-degrading strain Bacillus cereus Wu2,J BiosciBioeng,114(2012)640-647.)，远远不能满足工业化生产的要求。

因此，急需找到一种提高角蛋白酶水解角蛋白的水解效率的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种水解效率高的利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法为先将角蛋白酶和亚硫酸钠同时加入含有羽毛的反应体系中进行反应，得到反应液，然后将反应液进行提取，获得氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶在反应体系中的添加量为4000～40000U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶在反应体系中的添加量为40000U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述亚硫酸钠在反应体系中的添加量为0.05～3g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述亚硫酸钠在反应体系中的添加量为1g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，羽毛的浓度为100～250g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，羽毛的浓度为100g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为40～70℃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为60℃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的pH为6～11。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的pH为7。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的转速为200～250rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的转速为220rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶的生产方法为先将重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液，然后将发酵液进行离心，获得发酵上清液，最后将发酵上清液进行提取，获得角蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pP43NMK质粒为表达载体、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主表达编码角蛋白酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码角蛋白酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了上述方法在生产氨基酸方面的应用。

[有益效果]

本发明通过额外添加亚硫酸钠大大提高了利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率，利用本发明的方法，将角蛋白酶和亚硫酸钠同时加入含有羽毛的反应体系中进行反应，反应4h，即可使反应液中氨基酸的含量高达56.6g/L、氨基酸转化率高达56.6％。

附图说明

图1-3：不同处理方式下羽毛的水解程度。

图4：不同处理方式下羽毛的扫描电镜图；其中，(a)和(f)为未经处理的羽毛，(b)和(g)为4000U/mL角蛋白酶处理4h的羽毛，(c)和(h)为1％的亚硫酸钠处理4h的羽毛，(d)和(i)为40000U/mL角蛋白酶处理4h的羽毛，(e)和(j)为4000U/mL角蛋白酶和1％的亚硫酸钠协同处理4h的羽毛。

图5：还原剂添加量对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响。

图6：pH对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响。

图7：温度对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响。

图8：羽毛添加量对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自北纳生物；下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自丰晖生物；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600记载于公开号为CN102492645A的专利申请文本中；下述实施例中涉及的羽毛购自菜市场；下述实施例中涉及的亚硫酸钠、β-巯基乙醇、亚硫苏糖醇(DTT)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

下述实施例中涉及的培养基为：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、卡那霉素100mg·L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g/L、卡那霉素50mg·L^-1。

种子培养基：酵母粉5g·L^-1、蛋白胨10g·L^-1、NaCl 5g·L^-1。

发酵培养基：蛋白胨20g·L^-1、酵母粉10g·L^-1、蔗糖20g·L^-1、KH₂PO₄3 g·L^-1、Na₂HPO₄6g·L^-1、MgSO₄0.3 g·L^-1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

角蛋白酶酶活的检测方法如下：

取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL 50mM的Gly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后于40℃下反应20min；加入200μL 4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r/min离心3min。取上清200μL，加入1mL 4％(w/v)的Na₂CO₃和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上；

酶活的定义：在该条件下每分钟转化角蛋白底物产生1μmol酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位(1U)。

氨基酸含量以及氨基酸转化率的检测方法如下：

在反应液中按照体积比1:1的比例加入磺基水杨酸进行沉淀，沉淀4h后，将反应液于12000g下离心10min，保留上清液；将上清液用浓度为0.02M的盐酸将稀释至氨基酸的浓度为0.1mM，得到稀释液；用氨基酸分析仪(日立L-8900，东京，日本)检测稀释液中的氨基酸氨基酸含量；

氨基酸转化率的计算公式如下：

转化率(％)＝(氨基酸含量/羽毛干重)×100。

下述实施例中涉及的角蛋白酶的生产方法如下：

化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码角蛋白酶的基因(蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；并使用同源重组试剂盒(Clonexpress II One Step CloningKit)将获得的基因与pP43NMK质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，在LB固体培养基上挑取5个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-ker；将验证正确的重组质粒pP43NMK-ker转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得含有编码角蛋白酶的基因的枯草芽孢杆菌工程菌。

将获得的含有编码角蛋白酶的基因的枯草芽孢杆菌工程菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入种子培养基，于37℃、220rpm培养14h，获得种子液；将种子液按照5％(v/v)的接种量接入发酵体培养基，于37℃、220rpm培养28h，得到发酵液；将发酵液于4℃、12000rpm离心20min后，获得发酵上清液。此发酵上清液中的酶活为：40000U/mL。

实施例1：不同还原剂对角蛋白酶水解羽毛的水解程度的影响

具体步骤如下：

将含有2g/L羽毛以及40000U/mL角蛋白酶的反应体系于温度为60℃、pH为7、转速为220rpm的条件下反应4h，得到反应液A；分别将亚硫酸钠、β-巯基乙醇、亚硫苏糖醇(DTT)以1g/L的添加量添加至仅含有2g/L羽毛的反应体系中，于温度为60℃、pH为7、转速为220rpm的条件下反应4h，得到反应液B；分别将亚硫酸钠、β-巯基乙醇、亚硫苏糖醇(DTT)以1g/L的添加量添加至含有2g/L羽毛以及40000U/mL角蛋白酶的反应体系中，于温度为60℃、pH为7、转速为220rpm的条件下反应4h，得到反应液C。

通过肉眼和扫描电镜观察检测结果见图1、4。

反应前后反应液A、B、C中羽毛的水解程度，

将含有10g/L羽毛以及40000U/mL角蛋白酶的反应体系于温度为60℃、pH为7、转速为220rpm的条件下反应12h，得到反应液D；将亚硫酸钠以1g/L的添加量添加至仅含有10g/L羽毛以及40000U/mL角蛋白酶的反应体系中，于温度为60℃、pH为7、转速为220rpm的条件下反应12h，得到反应液E。

通过肉眼和扫描电镜观察反应前后反应液D、E中羽毛的水解程度，检测结果见图2-4。

由图1-4可知，亚硫酸钠、β-巯基乙醇、亚硫苏糖醇(DTT)单独作用时，不具备水解羽毛的能力；角蛋白酶单独作用时能够部分水解羽毛；添加有亚硫酸钠的反应液中的羽毛被完全水解；添加有β-巯基乙醇的反应液中的羽毛被水解为碎片，此水解程度略高于角蛋白酶单独作用时；添加有亚硫苏糖醇(DTT)的反应液中的羽毛部分水解，此水解程度也略高于角蛋白酶单独作用时。可见，仅有亚硫酸钠可提高角蛋白酶水解角蛋白的能力。

实施例2：还原剂添加量对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响

具体步骤如下：

将亚硫酸钠分别以0.05、0.1、0.5、1、2、3g/L的添加量添加至含有3g/L羽毛以及40000U/mL角蛋白酶的反应体系中，于温度为60℃、pH为7、转速为220rpm的条件下反应4h，得到反应液。

检测各反应液中氨基酸的含量，检测结果见图5。

由图5可知，添加有0.05g/L亚硫酸钠的反应液中氨基酸含量为0.95g/L；添加有0.1g/L亚硫酸钠醇的反应液中氨基酸含量为1.07g/L；添加有0.5g/L亚硫酸钠醇的反应液中氨基酸含量为1.39g/L；添加有1g/L亚硫酸钠醇的反应液中氨基酸含量为1.76g/L；添加有2g/L亚硫酸钠醇的反应液中氨基酸含量为1.417g/L；添加有3g/L亚硫酸钠醇的反应液中氨基酸含量为1.35g/L。可见，亚硫酸钠的添加量为1g/L时，提高利用角蛋白酶水解角蛋白生产氨基酸的水解效率的效果最高。

实施例3：pH对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响

具体步骤如下：

在实施例2的基础上，将亚硫酸钠的添加量控制为1g/L，并且，将反应的pH分别替换为6、7、8、9、10、11，得到反应液。

检测各反应液中氨基酸的含量检测结果见图6。

由图6可知，pH为6时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.43g/L；pH为7时反应得到的反应液中氨基酸的含量为2.06g/L；pH为8时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.93g/L；pH为9时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.83g/L；pH为10时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.35g/L；pH为11时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.16g/L。可见，pH为7时，利用角蛋白酶水解角蛋白生产氨基酸的水解效率最高。

实施例4：温度对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响

具体步骤如下：

在实施例2的基础上，将亚硫酸钠的添加量控制为1g/L，将反应的pH控制为7，并且，将反应的温度分别替换为40、45、50、55、60、65、70℃，得到反应液。

检测各反应液中氨基酸的含量检测结果见图7。

由图7可知，温度为40℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.07g/L；温度为45℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.23g/L；温度为50℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.56g/L；温度为55℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.68g/L；温度为60℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.78g/L；温度为65℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.55g/L；温度为70℃时反应得到的反应液中氨基酸的含量为1.42g/L。可见，温度为60℃时，利用角蛋白酶水解角蛋白生产氨基酸的水解效率最高。

实施例5：底物添加量对利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的水解效率的影响

具体步骤如下：

在实施例4的基础上，将3g/L的羽毛分别替换250g/L、200g/L、125g/L、100g/L的羽毛以及250g/L、200g/L的羽毛粉(羽毛粉碎而得)，得到反应液。

检测各反应液中氨基酸的含量和反应液中氨基酸的转化率，检测结果见图8。

由图8可知，底物添加量为100g/L且底物为羽毛时，反应液中氨基酸的含量和转化率最高，分别高达56.60g/L、56.60％。可见，应选择100g/L作为底物添加量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种利用角蛋白酶水解羽毛生产氨基酸的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 379

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Leu Met

1 5 10 15

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

35 40 45

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

50 55 60

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val

85 90 95

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

100 105 110

Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

115 120 125

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

130 135 140

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

165 170 175

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr

195 200 205

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

210 215 220

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys

225 230 235 240

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

260 265 270

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

340 345 350

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 2

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatgagga aaaagagttt ttggcttggg atgctgacgg ccttaatgct cgtgttcacg 60

atggccttca gcgattccgc gtctgctgct cagccggcga aaaatgttga aaaggattat 120

attgtcggat ttaagtcagg agtgaaaacc gcatccgtca aaaaggacat catcaaagag 180

agcggcggaa aagtggacaa gcagtttaga atcatcaacg cggcaaaagc gaagctagac 240

aaagaagcgc ttaaggaagt caaaaatgat ccggatgtcg cttatgtgga agaggatcat 300

gtggcccatg ccttggcgca aaccgttcct tacggcattc ctctcattaa agcggacaaa 360

gtgcaggctc aaggctttaa gggagcgaat gtaaaagtag ccgtcctgga tacaggaatc 420

caagcttctc atccggactt gaacgtagtc ggcggagcaa gctttgtggc tggcgaagct 480

tataacaccg acggcaacgg acacggcaca catgttgccg gtacagtagc tgcgcttgac 540

aatacaacgg gtgtattagg cgttgcgcca agcgtatcct tgtacgcggt taaagtactg 600

aattcaagcg gaagcggatc atacagcggc attgtaagcg gaatcgagtg ggcgacaaca 660

aacggcatgg atgttatcaa tatgagcctt gggggagcat caggctcgac agcgatgaaa 720

caggcagtcg acaatgcata tgcaagaggg gttgtcgttg tagctgcagc agggaacagc 780

ggatcttcag gaaacacgaa tacaattggc tatcctgcga aatacgattc tgtcatcgct 840

gttggtgcgg tagactctaa cagcaacaga gcttcatttt ccagtgtggg agcagagctt 900

gaagtcatgg ctcctggcgc aggcgtatac agcacttacc caacgaacac ttatgcaaca 960

ttgaacggaa cgtcaatggc ttctcctcat gtagcgggag cagcagcttt gatcttgtca 1020

aaacatccga acctttcagc ttcacaagtc cgcaaccgtc tctccagcac ggcgacttat 1080

ttgggaagct ccttctacta tgggaaaggt ctgatcaatg tcgaagctgc cgctcaataa 1140