一种利用大蒜种植及加工废弃物发酵制备蒜氨酸的方法
阅读说明：本技术 一种利用大蒜种植及加工废弃物发酵制备蒜氨酸的方法 (Method for preparing alliin by fermenting garlic planting and processing wastes ) 是由 蔡俊 戴慧敏 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用大蒜种植及加工过程中的废弃物来发酵制备蒜氨酸的方法,以大蒜叶、杆、茎、蒂、须等为原料,将大蒜种植及加工废弃物加热使蒜酶失活,粉碎后用纤维素酶酶解处理,在水解液中接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCCG进行发酵,菌体破壁后即可提取蒜氨酸。该方法利用大蒜种植及加工过程中的废弃物通过微生物合成法制备蒜氨酸,实现了变废为宝的目的,反应条件温和,并且避免了蒜酶对蒜氨酸的分解作用。(The invention discloses a method for preparing alliin by fermentation by using wastes in garlic planting and processing processes, which takes garlic leaves, stems, stalks, whiskers and the like as raw materials, heats the wastes in garlic planting and processing to inactivate allinase, pulverizes the wastes, uses cellulase for enzymolysis, inoculates saccharomyces cerevisiae (yeast) Saccharomyces cerevisiae ) CCCG is fermented, and alliin can be extracted after cell wall breaking. The method utilizes the waste in the garlic planting and processing process to prepare the alliin by a microbial synthesis method, realizes the purpose of changing waste into valuable, has mild reaction conditions, and avoids the decomposition effect of alliinase on the alliin.)
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种能利用大蒜种植及加工过程中的废弃物来发酵合成蒜氨酸的方法。
背景技术
蒜氨酸是一种存在于百合科葱属植物鳞芽中的较稳定的非蛋白质类含硫氨基酸，无臭无味，易溶于水但不溶于乙醇，有降低胆固醇，预防肥胖和抗肿瘤等功能，能抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Eschrichia coli)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的生长，抑制黄曲霉的产毒作用，并且对人体无毒害，可作为良好的食品防腐剂，来延长果蔬的保鲜期，也可以被开发成为药制剂，具有很好的应用前景。
目前蒜氨酸的生产方法主要包括化学合成法、组织培养法和植物提取法。目前被大众广泛接受的是化学合成法和植物提取法。化学合成法以烯丙基卤化物，半胱氨酸，碱和氧化剂作为原料，在一定条件下反应得到蒜氨酸，如CN103483231A以半胱氨酸、烯丙基氯、氢氧化钠和双氧水为原料，在低温高压环境下持续搅拌合成蒜氨酸。植物提取法以大蒜作为原料，经过破碎、萃取、过柱分离得到，包括有机溶剂提取和水提取。由于蒜酶的存在会导致蒜氨酸的分解，在提取过程中通常需要排除蒜氨酸酶的影响。如CN112028798A利用微波高火灭酶装置，在提取过程中利用微波使蒜氨酸酶失活；CN108164611A将大蒜原料和水混合进行热提取，利用高温使蒜氨酸酶失活，再依次进行水提、盐提、碱提、醇提、吸附剂吸附及真空冷冻浓缩处理，得到结晶蒜氨酸；CN110615748A利用乙醇迅速使蒜氨酸酶失活，通过减压蒸馏浓缩和离子交换柱交替处理，得蒜氨酸粗品；CN110963949A以质量百分数3％～10％的氢氧化钠、3％～10％的氢氧化钙、3％～10％的氢氧化钾、3％～10％的碳酸钾、25％～45％的醋酸、25％～45％的盐酸、25％～45％的氢溴酸、25％～45％的磷酸中的任意一种作为蒜氨酸酶破坏液，与大蒜原料混合，在惰性气体保护下粉碎提取，后经有机溶剂萃取得到。由此可见，现存蒜氨酸的生产方法中，化学合成法反应条件严苛，反应收率低，污染环境，后处理麻烦，植物提取法中提取工艺复杂，且需要降低蒜氨酸酶对蒜氨酸分解作用的影响，进一步增加了成本。
大蒜种植及加工的废弃物，包括叶、杆、茎、蒂、须等，含有蒜氨酸及烯丙基硫醇等蒜氨酸合成的前体物质，每年在大蒜的种植及加工基地会产生大量的大蒜废弃物，既污染环境又造成了资源的浪费。
发明内容
本发明是为了弥补上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种利用大蒜种植或加工过程中的废弃物，包括大蒜叶、杆、茎、蒂、须等来发酵制备蒜氨酸的方法。本发明以蒜氨酸的生物合成途径为参考，以大蒜废弃物作为原料，以实验室来源的酿酒酵母CCCG(CCTCC NO：M2012215)为生产菌，从其发酵液中提取分离获得蒜氨酸。该微生物合成法反应条件温和，绿色高效，并且避免了蒜酶对蒜氨酸的分解作用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用大蒜种植及加工废弃物发酵制备蒜氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)将大蒜种植及加工废弃物加热处理使蒜酶失活，粉碎后用纤维素酶酶解处理，收集水解液；
(2)在上述水解液中接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCCG进行发酵，菌体破壁后即可提取蒜氨酸。
进一步地，所述的大蒜种植及加工废弃物包括大蒜的叶、杆、茎、蒂、须。
进一步地，步骤(1)中大蒜种植及加工废弃物用60-70℃干热处理使蒜酶失活。
进一步地，步骤(1)中纤维素酶的处理温度为30～40℃，pH 4.5-7.5。
进一步地，步骤(2)中发酵培养基中还含有葡萄糖，酵母粉，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4。
与现有技术相比，本发明的优势体现在：
1、本发明利用大蒜秸秆废弃物来制备蒜氨酸，实现了变废为宝的目的，成本低廉，具有明显的社会经济效益。
2、与化学合成法相比较，整个反应过程在常温常压下进行，且不需要烯丙基溴等有毒物质作为原料，能耗小，对环境污染小，后处理简单。
3、使用酿酒酵母作为生产菌株，保证了产物的安全性，为其工业化规模生产奠定了理论基础。
4、采用微生物法合成蒜氨酸，避免了蒜酶对蒜氨酸的分解作用，相较于提取法，蒜氨酸的产量有明显提升，并且降低了生产成本，得到的蒜氨酸性质稳定，易于分离纯化。
附图说明
图1是蒜氨酸电喷雾电离源-质谱图，(a)、(b)分别是蒜氨酸标品和酿酒酵母破壁后的样品的准分子离子流图，(c)是酿酒酵母破壁后的样品的质谱图。
图2是蒜氨酸高效液相色谱图，(a)是蒜氨酸标品，(b)是酿酒酵母破壁后的样品。
图3是蒜氨酸的标准曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：原料制备
采集1-2kg大蒜种植及加工废弃物，包括大蒜叶、杆、茎、蒂、须等，用60-70℃干热处理使蒜酶失活后，晒干粉碎。由于大蒜叶、杆、茎、蒂、须等组织细胞内含有蒜氨酸及蒜氨酸合成的前体物质，将上述粉碎后的颗粒物用纤维素酶处理，破坏大蒜叶、杆、茎、蒂、须等组织细胞的细胞壁，使更多的内容物进入提取液中。酶解处理条件：料液比1:6-1:10，温度30～40℃，pH4.5-7.5，酶用量0.1-0.5％(W/W)，酶解时间1～2h，然后将水解液离心，洗涤，收集上清液，后将滤渣于30-50℃水中浸泡1～2h后过滤，收集滤液与上述上清液混合后定容至1L备用。
实施例2：发酵液的制备
(1)菌株
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCCG，保藏编号CCTCC NO：M2012215
(2)培养基制备
固体PDA培养基的制备(以1L计)：将20g葡萄糖、20g蛋白胨、10g酵母浸粉及20g琼脂混合均匀后调pH 6.0，于115℃下灭菌30min后备用。
种子培养基的制备(以1L计)：将20g葡萄糖、20g蛋白胨、及10g酵母浸粉混合均匀后调pH 6.0，于115℃下灭菌30min后备用。
发酵培养基的制备(以1L计)：将20g葡萄糖，10g酵母粉，8g(NH4)2SO4，3g KH2PO4，0.15g MgSO4，与实施例1中制备的原料1L混合均匀后调pH 5.0，于115℃下灭菌30min后备用。
(3)发酵液的制备
从甘油管中蘸取一环菌种，划线于新鲜固体PDA培养基上活化，置于20～35℃恒温培养箱中培养18～24h；用接种环取一环已活化的菌种于种子培养基中，在温度为20～35℃，摇床转速140～200r/min，摇瓶装量50mL/250mL条件下培养12～30h；用无菌10mL移液管吸取1～5mL上述一级种子培养液接入新的种子培养基中，在培养温度20～35℃、摇床转速140～200r/min的条件下振荡培养12～30h。用无菌的10mL移液管按2％～10％的接种量吸取上述种子液1～5mL，接入发酵培养基中后，在温度为20～35℃，摇床转速140～200r/min，摇瓶装量50mL/250mL条件下发酵12～24h后，培养结束取样。
实施例3：蒜氨酸的提取与分析检测
(1)菌体水分含量的测定
菌悬液经4500～8000r/min离心去上清液，无菌水清洗菌体三次，称取湿菌体重量M1，置于65℃烘箱烘干至恒重，称取干菌体重量M2。水分含量(％)＝(M1-M2)/M1×100％。
(2)超声法处理细胞及破壁率的计算
菌悬液经4500～8000r/min离心去上清液，无菌水洗涤3次，称取菌体湿重，重悬湿菌体定容至恒定体积。定容后取适量菌悬液稀释，于血球计数板计数，取3次平行计数结果，记为破壁前细胞数N1。采用超声破壁法，设定功率100～300W，于冰浴条件下进行超声破碎30～60min(设定工作1s，间隔1s)，取适量破壁后的菌悬液稀释，于血球计数板计数，取3次平行计数结果，记为破壁后细胞数N2。破壁率(％)＝(N1-N2)/N1×100％。
(3)蒜氨酸的ESI-MS分析
破壁后的菌悬液经8000r/min离心取上清液，将上清液用微滤膜(0.22μm)过膜后，进行质谱分析。质谱条件：离子方式：电喷雾正离子化(ESI+)，毛细管电压：3.5KV；锥孔电压：25V；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：300℃；质量范围：100-200m/z；选择离子方式检测(SIM)m/z 178。
如图1a和图1b所示，蒜氨酸标品和酿酒酵母破壁后的样品的准分子离子流图均在2.88min左右出峰，图1c中显示样品在2.887min处出现m/z＝178.00，为蒜氨酸的准分子离子[M+H]+。
(4)蒜氨酸的HPLC分析
破壁后的菌悬液经4500～8000r/min离心取上清液，将上清液用微滤膜(0.22μm)过膜后，用高效液相色谱仪进行分析。色谱条件：色谱柱，Inertsil ODS SP C18柱(4.6mmх150mm，5μm)；流动相为V(甲醇)：V(甲酸水溶液)＝5:95，紫外检测器，检测波长：214nm；柱温30℃；流速：0.8mL/min，进样量：20μL。
如图2a和图2b所示，蒜氨酸标品出峰时间为5.336min，细胞破碎液在5.36min出峰，与标品出峰时间相近，证明有产物蒜氨酸的生成。
(5)蒜氨酸标准曲线的绘制
分别配制浓度为200，400，600，800，1000μg/mL的蒜氨酸标准溶液。以不同的蒜氨酸标准溶液浓度为横坐标，以HPLC法测定的峰面积数值为纵坐标，绘图得到蒜氨酸标准曲线(见图3)；得到蒜氨酸的回归方程为：Y＝7232.5x+39674(R2＝0.9998)。
(6)胞内蒜氨酸含量的测定
破壁后的菌悬液经4500～8000r/min离心取上清液，将上清液用微滤膜(0.22μm)过膜后利用高效液相色谱法计算得到提取液中蒜氨酸的浓度，最后计算得到每g干细胞中蒜氨酸的含量
经计算，原料中蒜氨酸的含量为每1kg大蒜种植及加工废弃物中含有蒜氨酸50mg，大蒜种植及加工废弃物水解液经酿酒酵母发酵后，每g酵母干细胞中蒜氨酸的含量为102.66mg。由于大蒜叶、杆、茎、蒂、须等组织细胞内含有蒜氨酸及蒜氨酸合成的前体物质，采用热水浸提和酶解混合提取的方法，使蒜氨酸合成的前体物质从大蒜叶、杆、茎、蒂、须等组织细胞内释放出来，利用酿酒酵母发酵合成蒜氨酸。该方法生产周期短，成本低，蒜氨酸的分离纯化容易，经发酵后蒜氨酸产量得到了显著的提升。
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