阅读说明：本技术 感染有慢病毒的永生化dc细胞及其在杀伤表达mage-a3肿瘤细胞中的应用 (Immortalized DC cells infected with lentivirus and their use in killing MAGE-A3 expressing tumor cells ) 是由 邵永平 胡杨 田光启 于 2018-08-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及免疫领域,特别涉及感染有MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞及其在杀伤表达MAGE-A3肿瘤细胞中的应用。本发明开发了一种将永生化树突状细胞进行基因改造,使之能持续表达并提呈MAGE-A3抗原肽,进而激活CD8+T细胞,对表达MAGE-A3的肿瘤细胞进行特异性杀伤的肿瘤免疫疗法。(The invention relates to the field of immunity, in particular to an immortalized DC cell infected with MAGE-A3 lentivirus and application thereof in killing and expressing MAGE-A3 tumor cells. The invention develops a tumor immunotherapy which carries out gene modification on immortalized dendritic cells, enables the immortalized dendritic cells to continuously express and present MAGE-A3 antigen peptide, further activates CD8+ T cells and carries out specific killing on tumor cells expressing MAGE-A3.)

感染有慢病毒的永生化DC细胞及其在杀伤表达MAGE-A3肿瘤 细胞中的应用

技术领域

本发明涉及免疫领域，特别涉及感染有慢病毒的永生化DC细胞及其在杀伤肿瘤细胞中的应用。

背景技术

免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的一种治疗方法。

肿瘤细胞或病原体的感染会激活人体内的T淋巴细胞产生免疫应答以抵抗这些疾病。T淋巴细胞的激活需要一类称为抗原提呈细胞(APC)的参与。抗原提呈细胞主要包括树突状细胞(DC)，巨噬细胞和B淋巴细胞，其中树突状细胞是最为重要，也是最为高效的抗原提呈者。抗原提呈细胞把来自于肿瘤或病原体的抗原蛋白经过消化，处理后，以小肽的形式将这些抗原提呈到细胞表面，一旦这些抗原信号被T淋巴细胞识别，后者就被激活并扩增。大量活化的T细胞会攻击并杀死肿瘤细胞或被病原体感染的细胞，从而发挥免疫的功能。

在一些慢性疾病如肿瘤或病原体引发的慢性炎症疾病中，T淋巴细胞的免疫功能会随着时间逐渐钝化，失去对肿瘤细胞的杀伤效果。此外，肿瘤组织中浸润的T淋巴细胞往往含量很少，达不到足够的杀伤效果，这些是造成肿瘤免疫逃逸的主要原因。体外激活并大量培养具有肿瘤特异性杀伤能力的T 细胞,回输患者体内发挥免疫功能是当前细胞免疫治疗的一个通用的有效策略.

在理想情况下，一个良好的免疫治疗策略应该满足以下条件：第一，在较低的效应细胞/肿瘤细胞比例(E:T比值)时，即具有较好的抗肿瘤效果，由此最大限度地减少注入患者的细胞数量，可同时降低成本和风险；第二，“现成化”模式，抗肿瘤免疫细胞可源于健康捐献者且不引起移植物抗宿主病并发症(GVHD)，从而提供经济、有效的治疗，并且显著减少病人等待时间；第三，尽量规避基因改造可能带来的毒副作用，CAR-T细胞经过基因工程改造，可长时间存留在病人体内，存在未知风险；第四，免疫细胞质量的优化，虽然激活免疫细胞的方法有多种，但是通过树突状细胞激活免疫细胞符合机体自然规律，被认为是最好的方法之一。

当前临床上针对肿瘤的免疫治疗主要基于来自病人自体的T淋巴细胞，包括T淋巴细胞的分离、抗原特异性T细胞的体外激活、扩增及回输等四个步骤。其中抗原特异性T细胞群的体外扩增是该治疗策略中极为关键也是极具挑战性的步骤。目前常用的手段有以下三种1)利用CD3，CD28抗体和 IL12混合物刺激T细胞。该方法为T细胞提供了激活、扩增、生存三种关键信号，但是这些信号的呈现方式与体内APC的抗原自然呈递过程完全不同，可能导致T细胞扩增速度慢，功能受限或功能失调；2)利用Car-T技术或 TCR-T技术制备具有特异抗原肽识别能力的CD8+T细胞。这种方法的优势是，特异性CD8+T细胞在较低的效应细胞/肿瘤细胞比例(E:T比值)时，仍具较强的杀伤活性。但单一的抗原肽识别也有一些缺点。比如有可能对除了肿瘤组织外的正常组织造成非特异性的杀伤，具有安全隐患；另外，针对单一靶点的免疫治疗容易造成肿瘤主动丢失抗原后的免疫耐受。3)利用病人自体分离的DC细胞或经由单核细胞刺激分化而来的DC细胞，通过吞噬凋亡肿瘤细胞碎片，转导抗原肽基因等方式获取、提呈抗原，诱导T细胞的活化和扩增。这种方法与体内的抗原提呈方式相类似，但受限于病人血液中极低的DC 细胞含量，无法满足扩大化的临床需求。而且这些DC细胞在体外无法长期生存，往往短期培养后就会死亡。

因此提供一种通过基因改造的方式使永生化DC细胞系稳定表达肿瘤特异性抗原的方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种使永生化DC细胞稳定持续表达MAGE-A3 肿瘤抗原的方法。该方法使永生化DC细胞以尽可能接近自然的方式加工和提呈MAGE-A3肿瘤抗原，并能在体外高效的诱导CD8+T淋巴细胞的激活与扩增，解决了制约T细胞免疫治疗的一个重要难题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种慢病毒载体和具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

I、具有编码MAGE-A3的核苷酸序列；

II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；

IV、与I所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列；

V、如I、II、III或IV所示核苷酸序列的互补序列。

本发明还提供了所述的表达载体的构建方法，获得携带有限制性酶切位点的MAGE-A3全长cDNA，用所述限制性内切酶和DNA连接酶将所述 MAGE-A3全长cDNA与慢病毒载体连接，获得所述表达载体。

在本发明中，携带有限制性酶切位点的MAGE-A3全长cDNA的序列如 SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了转染有所述的表达载体和慢病毒包装载体的菌株。

在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株的构建方法为：取所述表达载体以及慢病毒包装质粒pLP1(Gag/Pol)、pLP2(Rev)、pLP-VSVG(VSVG) 转化大肠杆菌。

本发明还提供了转染有所述的表达载体和慢病毒包装载体的细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞的转染方法为：取所述表达载体以及慢病毒包装质粒pLP1(Gag/Pol)、pLP2(Rev)、pLP-VSVG(VSVG) 转染293T细胞。

在此基础上，本发明还提供了所述细胞培养后获得的MAGE-A3慢病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述MAGE-A3慢病毒的制备方法为：：取所述表达载体以及慢病毒包装质粒pLP1(Gag/Pol)、pLP2(Rev)、pLP-VSVG(VSVG)转染293T细胞，培养，收集病毒。

本发明还提供了感染有所述MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述感染有所述MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞的制备方法为：取所述MAGE-A3慢病毒感染永生化DC细胞；作为优选，根据慢病毒滴度测定结果，按照MOI＝20，加入所述MAGE-A3 慢病毒。

本发明还提供了感染有MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞在表达 MAGE-A3中的应用。

本发明还提供了感染有MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞在激活特异性识别MAGE-A3的细胞毒性CD8+T细胞中的应用。

本发明还提供了感染有MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞在筛选特异性识别MAGE-A3抗原肽和/或HLA复合物的T细胞受体中的应用。

本发明还提供了感染有MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的应用；所述肿瘤细胞表达MAGE-A3。

在上述研究基础上，本发明还提供了一种药物，包括感染有MAGE-A3 慢病毒的永生化DC细胞。

本发明提供了将永生化树突状细胞(DC细胞)进行基因改造，使之成为可长期稳定表达MAGE-A3特异性抗原的细胞系的方法。该细胞系可在体外诱导CD8+T细胞激活并大量扩增，使之对表达MAGE-A3的肿瘤细胞具有杀伤作用。

1.提供了一种持续表达、处理及提呈MAGE-A3抗原能力的永生化树突状细胞。

2.可驯化初始T细胞成为具有MAGE-A3特异性的细胞毒性CD8+T细胞 (CTL)，对MAGE-A3高表达的肿瘤细胞进行杀伤。

3.可以用于筛选对MAGE-A3抗原肽/HLA复合物有特异性识别的T细胞受体(TCR)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示包装质粒扩增电泳检测显示质粒核酸序列大小正确；

图2示导mage-a3慢病毒后的永生化DC与空载永生化DC中MAGE-A3表达量；通过以beta-actin作为内参的qPCR检测显示，空载永生化DC几乎不表达 MAGE-A3，而转染mage-a3后其mRNA表达量显著提高(P＝0.0002)；

图3示流式细胞术检测CTL细胞亚群；通过流式细胞术检测CTL显示其细胞亚群中包含NK，NKT，CD8+T细胞和CD4+T细胞，分别为9.53％，4.17％和 47.6％(82.4％×57.8％)；

图4示mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞杀伤实验结果；其中，图4(A) 示mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞4小时杀伤实验结果；图4(B)示 mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞16小时杀伤实验结果；

图5示CTL细胞亚群CD11c流式细胞术检测；

图6示不同效靶比下针对A、B、C和HHC1954靶细胞4小时杀伤效果，显示针对A、B、C三种靶细胞，均有和HHC1954相近的特异性杀伤效果，效靶比为10:1时，杀伤比例大于40％。

具体实施方式

本发明公开了一种能稳定表达MAGE-A3抗原的永生化DC细胞系的制备方法及其在杀伤肿瘤细胞中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的MAGE-A3慢病毒载体、感染有MAGE-A3慢病毒的永生化DC细胞及其在杀伤肿瘤细胞中的应用中所用原料、菌株、细胞、试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

对特异性抗原序列进行载体构建，转化细菌长期保存。

通过全基因合成的方法合成两端携带限制性酶切位点(BgIII和NotI)的 MAGE-A3全长cDNA，如SEQ ID No.1所示。使用限制性内切酶(BgIII和 NotI)和DNA连接酶将目标DNA与LL3.7、pHD等慢病毒载体质粒进行连接，构建MAGE-A3慢病毒表达质粒。连同慢病毒包装质粒pLP1(Gag/Pol), pLP2(Rev),pLP-VSVG(VSVG)按如下方法分别转化大肠杆菌：

从-80℃冰箱中取出感受态细胞(stbl3)，迅速置于冰上，待完全融化；在超净工作台内，向每管感受态细胞中分别加入10ng上述所有质粒之一，轻弹混匀；再次置于冰上45-60min；42℃热激90sec；迅速放回冰上2min；在超净工作台内，向每管中加入800μL LB液体培养基，用封口膜封闭管口，于 37℃，250rpm振荡培养45-60min；取50～200uL培养物均匀涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上；37℃恒温培养箱中过夜培养(12～16h)。挑取单克隆挑至含相应抗生素的5mL液体LB培养基中，37℃，250rpm培养至 OD600＝0.6～0.8。通过菌液PCR和质粒DNA测序的方法进行鉴定。若质粒序列正确，则冻存于含15％甘油的LB培养基中，-80℃长期保存。

实施例2：

对MAGE-A3表达载体进行慢病毒包装、浓缩及滴度测定。

1.用无内毒素质粒中提或大提试剂盒对实施例1获得的菌株中pLP1 (Gag/Pol),pLP2(Rev),pLP-VSVG(VSVG)包装质粒以及MAGE-A3慢病毒质粒进行提取，测定质粒浓度及A260/280比值，A260/280比值应该处于 1.8～1.9之间。取少量质粒样品进行琼脂糖凝胶电泳，验证质粒大小正确，如图1所示。

2.质粒转染前一天，使用0.25％胰蛋白酶消化融合度约80％的293T细胞5 分钟后加入等体积胎牛血清终止消化。取20ul细胞悬液与80μL台盼蓝染液混合，滴加于血球计数板上计数。将5～6×10⁶个293T细胞悬浮于10ml 培养液(高糖DMEM+10％FBS，无抗生素)并接种到10cm的培养皿中。

3.第二天，吸掉细胞培养液，加入9ml新鲜的无抗生素培养液(高糖 DMEM+10％FBS)。换液后细胞放入37℃，5％CO2培养箱培养至完成 DNA-转染试剂复合物的制备。

4.在一个1.5ml离心管中加入800μl的

I培养液(Invitrogen)，再加入36μL的转染试剂Lipofectamine 3000，颠倒混匀后于室温(本发明所述室温为25℃±5℃)静置5分钟，制得转染制剂混合液。另取一个1.5ml 离心管，加入200ulI培养液，再分别加入3μg pLP1,3μg pLP2, 3μg pLP-VSVG，3μg目标基因慢病毒质粒，混匀后静置。5分钟后将质粒混合液加入转染试剂混合液，缓慢吹打混匀后于室温(本发明所述室温为25℃±5℃)静置20分钟，制得DNA-转染试剂复合物。

5.将1mlDNA-转染试剂复合物逐滴均匀加到步骤3制得的已换过液的293T 细胞培养板中，前后左右摇动培养皿混匀，放入37℃，5％CO2培养箱过夜培养。第二天，将细胞培养液吸走，加入无抗生素的10ml新鲜培养液，放入37℃，5％CO2培养箱培养，至转染72小时后收集病毒。将培养皿中的培养液上清收集到15ml离心管中，3000rpm，4℃离心15minutes后收集上清。

6.将收集到的病毒上清液以66,549×g的速度，4℃离心2小时，弃掉上清，将病毒沉淀重悬于PBS或无血清培养基，-80℃长期保存，分装避免反复冻融。

7.利用Clonetec公司的Lenti-X^TMqRT-PCR Titration试剂盒测定病毒滴度。

实施例3：

利用MAGE-A3慢病毒感染永生化-DC细胞并筛选获得稳定表达 MAGE-A3的细胞株：

1.收集2ml永生化DC细胞混悬液至15ml离心管内，1200rpm，离心5min。

2.弃上清，用2ml新鲜培养基重悬细胞，取100ul细胞悬液于EP管中，另向EP管中加入100ul台盼蓝，混匀后滴加于血球技术板上计数，接种1×10⁵个细胞至6孔板的一个孔内，并记录细胞悬液体积。

3.根据慢病毒滴度测定结果，按照MOI＝20，计算加入细胞中的病毒液体积，加入病毒上清液，补齐培养基至2ml，同时向孔内加入2μl浓度为 10mg/ml的聚凝胺溶液，保证其终浓度为10μg/ml，37℃，CO2 5％培养箱内培养。

4.24小时后，将细胞收集于15ml离心管内，1200rpm，5min。

5.弃上清，2ml新鲜培养基重悬永生化DC细胞并放入新的孔内培养，放入37℃，CO25％培养箱内培养2天。

6.将细胞收集于15ml离心管内，1200rpm，5min，重复步骤3-6。

7.弃上清，3ml新鲜培养基重悬永生化DC细胞并放入新的孔内放入 37℃，CO2 5％培养箱内培养

8.病毒感染2周后，收集部分细胞，通过Q-PCR鉴定特异抗原表达情况，如表1、图2所示。

表1 EmptyDC与转染MAGE-A3抗原后的DC中mage-a3表达差异

*P＝0.0002

实施例4：细胞供体筛选和供体PBMC制备1.抽取PBMC供体志愿者1ml 外周血并存储在EDTA抗凝采血管中充分混匀。

2.进行HLA-A低分型检测，并选择血清型为HLA-A0201志愿者1位入组作为实验组、对照组的PBMC供体。选择血清型非HLA-A0201志愿者1位入组作为PBMC阴性对照1组供体。

3.抽取入组志愿者10ml外周血并存储在EDTA抗凝采血管中充分混匀。

i.将血液样品转移至50ml离心管中加入平衡至室温(25℃±5℃)的 PBS至总体积35ml。

ii.向每管预先已加入15mL Ficoll-Paque分离液的50mL离心管中缓慢加入35mLPBS稀释后的血样。

iii.使用Thermo Scientific Sorvall ST16R或同型离心机，室温(25℃±5℃)下1800转/分钟，离心30分钟，离心机加速参数设置为1，降速参数设置为0。

iv.分别将每个离心管中液体的中间层转移至一个新的50ml离心管中。

v.加入预冷的PBS至终体积50mL，4℃下1200转/分钟离心10分钟。弃去上清，用1.0mL PBS重悬细胞团块。

vi.加入预冷的PBS至终体积50mL，4℃下1000转/分钟离心10分钟。弃去上清，加入1.0mLPBS重悬细胞团块。

vii.加入预冷的PBS至终体积50mL，4℃下800转/分钟离心10分钟。弃去上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞团块。

viii.使用RPMI1640培养基、10％FBS和1％青链霉素配制成完全培养基，向离心管中加入1.0mL完全培养基，重悬细胞团块。

ix.将细胞悬液用2ml血清移液管测量体积，重悬后取10μl进行计数。

效应细胞的制备1.复苏HLA-A0201，表达MAGE-A3的永生DC，使用 RPMI1640培养基和10％FBS培养体系，调整细胞密度为2x10⁵/ml并接种于25瓶中，每天加入200U/mlIL-2至密度达到5x10⁵/ml。

2.使用RPMI1640培养基和10％FBS培养体系，将PBMC以1-2x10⁶/well接种于6孔板中，将表达MAGE-A3的永生化DC与PBMC按1：500比例加入孔中，并保证每孔细胞悬液体积为2ml。

3.Day1-Day3每天加入IL-2 200U/ml进行扩增，培养基变黄时进行半量换液。

4.Day5将细胞转移至25培养瓶并补足培养基至6mL，每天加入IL-2 200U/ml 进行扩增至Day9，培养基变黄时进行半量换液。

5.Day9将细胞转移至75培养瓶并补足培养基至15mL，每天加入IL-2 200U/ml进行扩增至Day14，培养基变黄时进行半量换液或增加培养基。

6.Day14将CTL细胞进行流式检测分析。

实施例5：

通过将荧光素报告基因转染至靶细胞后，使用CTL作为效应细胞对靶细胞进行杀伤以验证杀伤效果。在MAGE-A3永生化DC与PBMC混合共培养后的第10天，复苏2株表达荧光素酶的目标肿瘤细胞HHC1954用于CTLs 细胞活性检验。

2.使用0.25％胰酶消化靶细胞5分钟，终止消化后，细胞混悬液10ml转移至 15mL离心管中，常温，1200rpm，离心5min。

3.弃去上清，用2mL RPMI1640培养基重悬细胞团块，样品进行细胞计数。

4.按照2.5×10⁴/250ul调整肿瘤细胞密度，接种250ul肿瘤细胞悬液于24孔板内。

5.杀伤试验细胞处理贴壁2小时后，按照靶细胞：效应细胞(CTL细胞)1:10 至1:1.25调整CTLs细胞密度进行接种。保证加入每孔的细胞悬液体积为250μL。

ii.阴性对照组加入血清型为HLA-A2且与效应细胞各组等量的PBMC，保证加入每孔的细胞悬液体积为250uL。

iii.空白对照加入250uL RPMI1640培养基。

iv.将效应细胞与靶细胞共培养16或4小时。

6.荧光检测使用注射用水将5×Reporter Lysis Buffer按照H₂O：RLB＝4：1的比例稀释配制裂解工作液制得细胞裂解液制得细胞裂解液并4℃预冷。

ii.吸弃培养基上清，使用10ml血清移液管加入PBS，轻微震荡，吸弃PBS，再次加入PBS洗涤，确保所有悬浮的细胞及细胞碎片均被清除。

iii.每孔加入100μL细胞裂解液，冰上裂解细胞约2小时。

iv.将裂解产物转移至1.5mL离心管内，标记样品编号，进行12000 rpm，5min离心。

v.将每个1.5mL离心管取20μL上清液依次加入96孔酶标板检测孔内。

vi.使用100μL手持单道移液器依次向酶标板检测孔内加入100μL Luciferase底物，吹打3次后，立刻检测荧光强度。

vii.依次检测各孔荧光强度，确保每个样品加入底物后在10秒内检测。

viii.计算CTL细胞对肿瘤细胞杀伤率。杀伤活性％＝[1-(E+T组OD值)/T 组OD值]×100％

E:效应细胞，T：靶细胞，E+T：效应细胞+靶细胞

杀伤试验结果

mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞4小时(图4A)和16小时(图4B) 杀伤试验显示，mage-a3-DC-CTL在靶细胞：效应细胞1:10条件下，杀伤活性分别达到90.8％(4小时)和96.6％(16小时)；在靶细胞：效应细胞1:2.5 条件下，杀伤活性分别达到56.2％(4小时)和72％(16小时)。

表2A mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞4小时杀伤活性

表2B mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞4小时杀伤化学发光检测值

表3A mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞16小时杀伤活性

表3B mage-a3-DC-CTL对HHC1954靶细胞16小时杀伤化学发光检测值

实施例6：

使用带APC荧光素的DC细胞表面标志物CD11c抗体对培养14天的CTL 细胞进行流式细胞术鉴定，如图5所示，未发现CD11c阳性细胞亚群，即14 天培养后，CTL细胞亚群中已无永生化DC细胞，保证了CTL细胞的安全性。

实施例7：

使用6种mage-a3和HLA-A型组合的肿瘤细胞系(见表3)作为靶细胞，使用表达MAGE-A3的DC诱导产生的特异性CTL细胞作为效应细胞进行杀伤实验。

靶细胞和效应细胞、表达MAGE-A3的DC细胞，供体PBMC细胞和对照细胞HHC1954的HLA类型如下表：

表4 PBMC供体、DC细胞、靶细胞HLA和MAGE-A3表型

杀伤实验结果：

结果显示DC-CTL对HHC1954,A,B，C细胞株在效靶比为1.25:1至10:1 时均具有明显的杀伤效果(P<0.0001)，而对D，E，F未见杀伤作用。(图6)

其中对于HHC1954靶细胞在1.25:1至10:1各浓度杀伤效率为8.8％至 44.6％。

对于靶细胞A在效靶比为1.25:1至10:1各浓度杀伤效率为22.5％至 51.2％。

对于靶细胞B在效靶比为1.25:1至10:1各浓度杀伤效率为5.8％至45.2％。

对于靶细胞C在效靶比为1.25:1至10:1各浓度杀伤效率为11.3％至 38.7％。

表5不同效靶比下针对A、B、C和HHC1954靶细胞杀伤百分比

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京惠大生物科技有限公司

<120> 感染有慢病毒的永生化DC细胞及其在杀伤表达MAGE-A3肿瘤细胞中的应用

<130> MP1816384

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 两端携带限制性酶切位点BgIII和NotI的MAGE-A3全长cDNA(MAGE-A3 full-length cDNA carrying restriction enzyme sites BgIII and NotI at both ends)

<400> 1

ttaataaaga agaggcggat gaggatccag atctcaatgg cgacggatcc atcgccacca 60

tgcctcttga gcagaggagt cagcactgca agcctgaaga aggccttgag gcccgaggag 120

aggccctggg cctggtgggt gcgcaggctc ctgctactga ggagcaggag gctgcctcct 180

cctcttctac tctagttgaa gtcaccctgg gggaggtgcc tgctgccgag tcaccagatc 240

ctccccagag tcctcaggga gcctccagcc tccccactac catgaactac cctctctgga 300

gccaatccta tgaggactcc agcaaccaag aagaggaggg gccaagcacc ttccctgacc 360

tggagtccga gttccaagca gcactcagta ggaaggtggc cgagttggtt cattttctgc 420

tcctcaagta tcgagccagg gagccggtca caaaggcaga aatgctgggg agtgtcgtcg 480

gaaattggca gtatttcttt cctgtgatct tcagcaaagc ttccagttcc ttgcagctgg 540

tctttggcat cgagctgatg gaagtggacc ccatcggcca cttgtacatc tttgccacct 600

gcctgggcct ctcctacgat ggcctgctgg gtgacaatca gatcatgccc aaggcaggcc 660

tcctgataat cgtcctggcc ataatcgcaa gagagggcga ctgtgcccct gaggagaaaa 720

tctgggagga gctgagtgtg ttagaggtgt ttgaggggag ggaagacagt atcttggggg 780

atcccaagaa gctgctcacc caacatttcg tgcaggaaaa ctacctggag taccggcagg 840

tccccggcag tgatcctgca tgttatgaat tcctgtgggg tccaagggcc ctcgttgaaa 900

ccagctatgt gaaagtcctg caccatatgg taaagatcag tggaggacct cacatttcct 960

acccacccct gcatgagtgg gttttgagag agggggaaga gtaagcggcc gcaaggatct 1020

gctcgacaat caacctctgg attacaaaat tggaaagat 1059