阅读说明：本技术 一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法 (Rapid reconstruction method for biological cell subsurface morphology based on phase imaging ) 是由 李响 唐文波 季颖 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法,包括细胞样本相位图像提取和细胞样本形貌重建；本发明基于镜像倒置显微镜获取待测样本的相位图,应用相位梯度算法来确定样本的不同部分的边界,并且提取边界点以重建样本表面,这里提出了跳变点及判断方法,该跳变点的判定条件对折射率变换非常敏感,能准确反应出样本的边界信息。最后基于光学实验,通过该方法得到了聚苯乙烯微球以及红细胞的表面形态图。本发明在活细胞相位显微成像及实时识别方面有着广泛的实用价值与应用前景,具有无创性和无标记的明显优势,对生物细胞相位显微成像以及形态重建等领域具有重要意义。(The invention provides a phase imaging-based quick reconstruction method for the sub-surface morphology of biological cells, which comprises the steps of extracting a phase image of a cell sample and reconstructing the appearance of the cell sample; the invention obtains a phase diagram of a sample to be measured based on a mirror image inverted microscope, determines the boundaries of different parts of the sample by applying a phase gradient algorithm, and extracts boundary points to reconstruct the surface of the sample. Finally, based on optical experiments, surface morphology maps of the polystyrene microspheres and the erythrocytes are obtained by the method. The invention has wide practical value and application prospect in the aspects of live cell phase microscopic imaging and real-time identification, has the obvious advantages of no wound and no mark, and has important significance in the fields of biological cell phase microscopic imaging, form reconstruction and the like.)

一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法

技术领域

本发明属于相位显微成像领域，具体涉及一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法。

背景技术

细胞是生命的物理，结构和功能单元。每个细胞包含必需的细胞器，这些细胞器对于细胞的生存是必需的。一个活细胞是一个复杂的结构体，其中包含许多不同折射率的细胞器。因此，了解折射率对于监测活细胞的特性至关重要。当光穿过这样透明的相位物体时，能引起与折射率分布密切相关的相移。考虑到这一现象，定量相显微镜QPM被应用于获得细胞的形态和结构信息。作为全视野的非侵入性显微镜，QPM能进行非接触、无损伤和快速的高分辨率成像并且携带方便，几乎不需要维护。其为相位物体的三维静态、动态形貌观察和细胞动力学行为特征等研究提供了强有力的工具。但是，相位图像不能用于直接显示细胞的形状和结构，特别是对于有核细胞，因为样品的折射率信息和物理厚度信息在相位图中耦合。

因此，形状重建确实很重要。用于细胞形态重建的方法很多，例如双波长技术，熵层析重建方法等。使用这些方法可以获得样品的折射率信息并重建生物细胞的三维形态特征。但是这些任务要花费很多时间，并且实验设备的成本很高。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法。基于镜像倒置显微镜获取待测样本的相位图，应用相位梯度算法来确定样本的不同部分的边界，并且提取边界点以重建样本表面，这里提出了跳变点及判断方法，该跳变点的判定条件对折射率变换非常敏感，能准确反应出样本的边界信息，最后基于光学实验，通过该方法得到了聚苯乙烯微球以及红细胞的表面形态图。本发明在活细胞相位显微成像及实时识别方面有着广泛的实用价值与应用前景，具有无创性和无标记的明显优势，对生物细胞相位显微成像以及形态重建等领域具有重要意义。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法，包括以下步骤：

步骤S1、细胞样本相位图像提取：通过显微镜成像系统获得细胞样本相位图像；

步骤S2、细胞样本形貌重建：

步骤S2.1、记录样本的相位图，样本的相位图表达为：

其中，表示光穿过透明样本的总相移值，h(x，y)表示光穿过样本时的轴向物理厚度，n_c(x，y，z)表示样本的平均折射率折射率，n_m表示样本所处环境液的折射率，λ为光的波长；

步骤S2.2、记录样本的相位梯度曲线：

x_n＝n，n为正整数 公式三

x表示沿着X方向的轴向梯度曲线，n表示根据已获取的相位图的像素数即n×n将相位图划分为n条相位梯度曲线；

步骤S2.3、判断跳变点，确定样本的边界信息：

根据公式四判断每条相位梯度曲线上的跳变点的数目，

P_y(x，y)-P_y(x，y-1)＞0andP_y(x，y)-P_y(x，y-1)＞0 公式四

P_y(x，y)表示在坐标点(x，y)处沿Y方向的相位梯度值，P_y(x，y-1)表示(x，y)前一个点的相位梯度值，P_y(x，y+1)表示(x，y)后一个点的相位梯度值，在坐标点(x，y)处的相位梯度值P_y(x，y)比相邻两点的相位梯度值都大，是附近相位梯度的峰值，则称该点为跳变点，通过跳变点确定样本的边界信息；

步骤S2.4、三维形貌重构：

根据公式二反演样本的物理厚度得到公式五，计算的到样本的物理厚度，通过样本的边界信息和物理厚度，从而获得样本的三维形貌，

其中，h表示样本的物理厚度，

表示光穿过透明样本的总相移值，n_c(x，y，z）-n_m表示样本的平均折射率与样本所处环境液的折射率之差。

上述方案中，所述显微镜成像系统包括光源、磨砂透镜、彩色滤光片、第一反射镜、第一物镜、电动载物平台、第二物镜、第二反射镜、4f成像系统、分光棱镜、第一CCD、第二CCD和成像软件；

所述磨砂透镜、彩色滤光片和第一反射镜沿着光源的输出方向并排分布；

所述第一物镜、电动载物平台和第二物镜沿反射光方向依次放置；

所述第二反射镜、4f成像系统和分光棱镜沿平行光速依次分布，光路汇聚到分光棱镜上分别投射在第一CCD和第二CCD，第一CCD和第二CCD分别与成像软件连接。

进一步的，所述步骤S1中通过显微镜成像系统获得细胞样本相位图像具体为：

步骤S1.1、使波长为λ的光源发出的光束进入镜像倒置显微镜系统，通过磨砂透镜和彩色滤光片后，形成平行光入射到第一反射镜；

步骤S1.2、平行光经过第一反射镜后，穿过第一物镜和放置在电动载物平台的样本再通过第二物镜后汇聚到第二反射镜形成平行光束；

步骤S1.3、所述平行光束通过4f成像系统后经过分光棱镜分成两束光分别被两个信息采集器第一CCD和第二CCD接收，最终传输到成像软件形成相位图像。

上述方案中，所述显微镜成像系统为BioPhase镜像倒置显微镜成像系统。

进一步的，所述BioPhase镜像倒置显微镜成像系统为奥林巴斯GX51镜像倒置显微镜系统。

上述方案中，所述成像软件为BioPhase成像软件。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明基于镜像倒置显微成像系统来实现相位显微成像，具有无损、免标记的优点，能快速获取样本的相位信息，可靠性和稳定性高，实验可重复进行，成本低。本发明提出了跳变点及判断方法，该跳变点的判定条件对折射率变换非常敏感，能准确反应出样本的边界信息，是一种简单的操作方法能快速获取样品的表面，特别适合动态实时检测生物细胞的形态特征。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明一种实施方式的光路示意图。

图2是本发明一种实施方式的直径为4微米的聚苯乙烯微球相位图2(a)以及相位梯度图图2(b)，图中，A1和A2两点分别表示跳变点，

图3是本发明一种实施方式的直径为4微米的聚苯乙烯微球沿光照方向三维重建图，图中，两点间的距离即为聚苯乙烯微球重建的厚度。

图4是本发明另一种实施方式的人血红细胞相位图图4(a)以及相位梯度图图4(b)，图中，B1和B2两点分别表示跳变点。

图5是本发明另一种实施方式的人血红细胞相位图沿光照方向三维重建图，图中，两点间的距离即为人血红细胞重建的厚度。

表1是直径为4微米的聚苯乙烯微球重建结果，表中，聚苯乙烯微球重建厚度为3.98微米，真实厚度4微米，误差为0.5％，整个重建过程消耗时间0.0484s。

图中，1：光源；2：磨砂透镜；3：彩色滤光片；4：第一反射镜；5：第一物镜；6：第二物镜；7：电动载物平台；8：第二反射镜；9：4f成像系统；10：分光棱镜；11：第一CCD；12：第二CCD；13：成像软件。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

一种基于相位成像生物细胞亚表面形态快速重建方法，包括以下步骤：

步骤S1、细胞样本相位图像提取：通过显微镜成像系统获得细胞样本相位图像，所述显微镜成像系统包括光源1、磨砂透镜2、彩色滤光片3、第一反射镜4、第一物镜5、电动载物平台6、第二物镜7、第二反射镜8、4f成像系统9、分光棱镜10、第一CCD 11、第二CCD12和成像软件13；所述磨砂透镜2、彩色滤光片3和第一反射镜4沿着光源1的输出方向并排分布；所述第一物镜5、电动载物平台6和第二物镜7沿反射光方向依次放置；所述第二反射镜8、4f成像系统9和分光棱镜10沿平行光速依次分布，光路汇聚到分光棱镜10上分别投射在第一CCD11和第二CCD 12，第一CCD 11和第二CCD 12分别与成像软件13连接。

所述步骤S1中通过显微镜成像系统获得细胞样本相位图像具体为：

步骤S1.1、使波长为λ的光源1发出的光束进入奥林巴斯GX51镜像倒置显微镜系统，通过磨砂透镜2和彩色滤光片3后，形成平行光入射到第一反射镜4；

步骤S1.2、平行光经过第一反射镜4后，穿过第一物镜5和放置在电动载物平台6的样本再通过第二物镜7后汇聚到第二反射镜8形成平行光束；

步骤S1.3、所述平行光束通过4f成像系统9后经过分光棱镜10分成两束光分别被两个信息采集器第一CCD 11和第二CCD 12收录，最终传输到BioPhase成像软件13形成所需的相位图像；

步骤S2、细胞样本形貌重建：

步骤S2.1、记录样本的相位图，

样本的相位图表达为：

其中

示光穿过透明样本的总相移值，h(x，y)表示光穿过样本时的轴向物理厚度，表示样本内部某点的折射率，n_m表示样本所处环境液的折射率，λ为光的波长；

考虑到实际细胞同一介质折射率的异质性，为了便于计算，引入了平均折射率n_c(x，y，z)来代替

步骤S2.2、记录样本的相位梯度曲线，

x_n＝n，(n＝1，2，...255) 公式三

x表示沿着X方向的轴向梯度曲线，n表示根据已获取的相位图的像素数即255×255将相位图划分为n条相位梯度曲线；

步骤S2.3、判断跳变点，根据公式四判断每条相位梯度曲线上的跳变点的数目，

P_y(x，y)-P_y(x，y-1)＞0and P_y(x，y)-P_y(x，y+1)＞0 公式四

P_y(x，y)表示在坐标点(x，y)处沿Y方向的相位梯度值，P_y(x，y-1)表示(x，y)前一个点的相位梯度值，P_y(x，y+1)表示(x，y)后一个点的相位梯度值，满足公式四的点称为跳变点，通常成对(光射入和射出)出现，在坐标点(x，y)处的相位梯度值P_y(x，y)比相邻两点的相位梯度值都大，是附近相位梯度的峰值，则称该点为跳变点，通过跳变点确定样本的边界信息；

步骤S2.4、三维形貌重构，根据公式二反演样本的物理厚度得到公式五，计算的到样本的物理厚度，通过样本的边界信息和物理厚度，从而获得样本的三维形貌，

其中，h表示样本的物理厚度，

表示光穿过透明样本的总相移值，n_c(x，y，z)-n_m表示样本的平均折射率与样本所处环境液的折射率之差。

实施例1：

为了进一步说明重建方法在实际中应用效果，本发明以聚苯乙烯微球为实验样品进行了实验。

根据Biophase倒置镜像显微镜工作原理，对实验样品聚苯乙烯微球进行相位成像，实验环境为奥林巴斯镜油，环境液折射率大小为1.4218，光的波长λ＝632.8nm，得到聚苯乙烯微球相位图，如图2(a)；

根据公式三对已得到的聚苯乙烯微球相位图图2(a)取梯度，为方便说明，以穿过聚苯乙烯微球相位图中心的梯度曲线为例，如图2(b)，再根据公式四可知，图2(b)中A1和A2两点分别表示聚苯乙烯微球相位图图2(b)的跳变点，即边界点，且两点处的折射率为已知，即平均折射率大小为1.5916；

根据公式五对聚苯乙烯微球沿光照方向进行厚度反演，得到其三维形貌，如图3所示，将图3中两点纵坐标绝对值相加即可得到聚苯乙烯微球沿光照方向的厚度。

根据所得的重建结果图3，进行误差分析，聚苯乙烯微球按照本发明提出的方法重建出的厚度为3.98微米，其实际厚度为4微米，误差0.5％，整个重建过程耗时仅0.0484s，这表明该重建装置和方法确实可以用于对实验样品进行实时的检测，并且重建结果也较好。

表1

实施例2：

为了进一步说明该重建方法在实际生物细胞重建中的应用，本发明以人血红细胞为实验样品进行了实验。

根据Biophase倒置镜像显微镜工作原理，对实验样品人血红细胞进行相位成像，实验环境为生理盐水，折射率大小为1.33，光的波长λ＝632.8nm，得到人血红细胞相位图，如图4(a)；

根据公式三对已得到的人血红细胞相位图图4(a)取梯度，为方便说明，以穿过人血红细胞相位图中心的梯度曲线为例，如图4(b)，再根据公式四可知，图4(b)中B1和B2两点分别表示人血红细胞相位图图4(a)的跳变点，即边界点，且两点处的折射率为已知，折射率大小为1.41；

根据公式五对人血红细胞沿光照方向进行厚度反演，得到其三维形貌，如图5所示。这表明该重建装置和方法确实可以用于对实验样品进行实时的检测。

应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。