阅读说明：本技术 治疗方法 (Method of treatment ) 是由 P·赫佐格 Z·马克斯 N·伯克 S·S·林 N·德维尔德 N·曼干 A·马修斯 于 2018-01-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用干扰素ε(IFNε)治疗疾病的方法,其中所述IFNε包括组合物中各种天然的、合成的和重组IFNε。(The present invention relates to methods of treating diseases using interferon epsilon (IFN epsilon), including various natural, synthetic and recombinant IFN epsilon in compositions.)

治疗方法

本申请与2017年1月30日提交的题为“治疗方法”的澳大利亚临时专利申请号2017900251相关并要求其优先权，其全部内容通过引用以其整体并入本文。本说明书涉及序列表。“ST25.txt”文件采用ANSI格式。该文件通过引用以其整体从AU 2017900251并入本说明书中。

技术领域

本发明涉及癌症治疗领域和用于其的制剂。

背景技术

本说明书中作者所引用的出版物的书目细节在说明书末尾按字母顺序收集。

本说明书中对任何先前出版物(或从其获得的信息)或任何已知事项的引用不是并且也不应被视为对先前出版物(或从其获得的信息)或已知事项形成本说明书所涉及的努力领域中的公知常识的一部分的承认或认可或任何形式的建议。

癌症是复杂的、多层面的细胞病症。它可导致具有潜在显著的发病率和死亡率的衰弱的疾病水平。医疗保健部门治疗癌症的经济成本是巨大的，更不用说个人和家庭的情感负担。在理解癌症生物学以及阻碍其发展的内源性和外源性因素方面投入了大量努力。尽管几十年来取得了巨大进步，但为了充分理解这种疾病，进一步的研究是至关重要的。

例如，卵巢癌是包括许多分子不同的肿瘤复杂的一种异质性疾病，这些肿瘤不仅由卵巢细胞产生，而且还由输卵管和/或周围组织的细胞产生(Jayson等(2014)TheLancet384(9951):1376-88)。许多女性在已经达到晚期疾病时才被第一次诊断出来，并且对于那些对治疗有反应的女性，超过一半会在5年内复发并死亡(AIHW.(2010)Cancerseries 52 Cat No.CAN48)。

绝大多数卵巢癌具有上皮起源(EOC)并且具有第四高的女性癌症死亡率(Jayson等(2014)同上)。EOC基于组织学亚型分类，包括粘液性、透明细胞、子宫内膜样和浆液性癌，每种都与不同的形态、突变谱、起源细胞和预后相关。浆液性癌是最常诊断的EOC，并且越来越多的证据表明EOC来自远端输卵管的分泌性上皮衬里。标准治疗选择、手术切除和基于铂的化疗通常是无效的，因为许多患有晚期疾病的女性不是手术候选者，并且化学感受导致增加的复发率(Jayson等(2014)同上)。

卵巢癌的广泛分子谱分析显示，BRCA1/2基因的突变使高级浆液性癌(HGSC)的风险显著增加，高级浆液性癌是最常见和致命的EOC(Bowtell等(2010)Nature Rev Cancer10(11):803-8)。BRCA1和BRCA2均为记录的干扰素(IFN)调节基因(IRG)，并在DNA的同源重组修复途径中起重要作用(Venkitaraman(2014)Science 343(6178):1470-5)，其体细胞突变和种系突变导致整体染色体不稳定。分子谱分析还发现，具有较高免疫相关基因比如CD8A、颗粒酶B和CXCL9的表达的高级浆液性癌(HGSC)被称为免疫亚型，表现出最佳的总体存活率(Tothill等(2008)Clin Cancer Res.14(16):5198-208)，突出了这种癌症中免疫驱动抑制的潜在益处，分子谱分析已经发现具有高频TP53、BRCA1和BRCA2突变的基底样乳腺癌和浆液性卵巢癌的突变谱的相似性，两者共有的RB1的下调和周期蛋白E1的扩增(Kobolt等(2012)Nature 490(7418):61-70)。此外，虽然激素在卵巢癌肿瘤发生中的作用仍不清楚，但有证据表明孕酮受体(PR)阴性患者的不良预后与***受体(ER)表达无关(Sieh等(2013)The Lancet Oncology 14(9):853-62)，与三阴性乳腺癌(TNBC)或***受体阳性/孕酮受体阴性(ER⁺/PR^-)癌症的乳腺癌患者的不良预后的报告有相似之处(Thakkar andMehta(2011)Oncologist 16(3):276-85)。关于这两种癌症的常见驱动因素，目前尚有许多未知之处，两者都涉及致癌基因和肿瘤抑制基因表达、激素敏感性和免疫细胞受累的共同要素。

需要进一步研究免疫诱导在调节卵巢癌以及其他癌症类型的发展和治疗中的作用。

关于先天免疫和适应性免疫之间的相互作用，情况尤其如此。先天免疫应答代表对病原体预先存在的、固有的、第一线和快速诱导的防御和对稳态线索的反应(Mangan等(2007)Eur J Immunol 37(5):1302-12；Smith等(2007)J Immunol 178(7):4557-66)。这通过驻留细胞比如巨噬细胞、自然杀伤(NK)和上皮细胞介导。适应性免疫应答包括通过分泌抗体的B淋巴细胞和T辅助细胞和效应淋巴细胞介导的对抗原的识别和应答，其中引发的应答是逐渐的和特异性的。自适应应答由先天系统来形成(sculpte)。在生殖道中，免疫系统的两个臂必须平衡同种异体胎儿的存在，其基本上包含“外来”蛋白质，并控制有害病原体，例如，病毒和细菌。它还必须在周期性激素环境和粘膜中发生的结构变化的背景下维持稳态。

女性生殖道(FRT)的先天性和适应性免疫细胞产生细胞因子和趋化因子，从而影响各种生殖过程，包括***迁移、受精、植入、子宫内膜重塑和对感染或其他攻击的免疫应答(Salamonsen等(2007)Semin Reprod Med 25(6):437-44)。

在其最简单的形式中，先天应答包括物理化学屏障，比如粘液分泌物、pH和氧化还原状态。在其最复杂的形式中，它由先天免疫应答表示，先天免疫应答在几分钟内感知病原体并开始一系列反应，最终产生抗菌防御素、NOS酶、募集和激活炎性细胞的趋化因子以及调节细胞行为的细胞因子等产物。一类具有多效活性的诱导物是I型干扰素(IFN)。

使用I型IFN，特别是IFNα和IFNβ治疗卵巢癌的临床试验未能给人们留下深刻印象，主要是由于限制剂量的毒性阻碍了晚期疾病中的高剂量疗法，这与其他实体瘤的情况相同(Berek等(1985)Cancer Res.45:4447-53；Willemse等(1990)Eur J Cancer ClinOncol26(3):353-8；Markman等(1992)Gynecol Oncol.45(1):3-8；Frasci等(1994)Eur JCancer30(7):946-50；Bruzzone等(1997)Gynecol Oncol.65(3):499-505；Moore等(1995)Gynecol Oncol.59(2):267-72；Berek等(1999)Gynecol Oncol.75(1):10-4；Markman等(2004)Oncology66(5):343-6)。然而，已经报道了使用腹膜内IFNα治疗来自卵巢癌的恶性肿瘤腹水的一些成功，尽管IFN对抗腹水的效力的机制仍然不清楚(Berek等(1985)CancerRes.45:4447-53)。重要的是要了解干扰素在疾病发病机制中的作用，以便最好地指导疗法。

IFNε(IFNε)是I型IFN(Fung等(2013)Science 339(123):1088-1092；Peng等(2007)Prot Expr Purif 53(2):356-362)。Ifnε基因位于I型IFN基因座的染色体9p上(Hardy等(2004)Genomics 84(2):331-45)。IFN与IFNα和IFNβ具有大约30％的氨基酸序列同源性，并且体外研究表明IFNε通过特征I型IFN受体lFNAR1和lFNAR2发出信号，然而，迄今尚未解决其潜在地抗肿瘤特性。

有趣的是，与保持在不可检测的水平直到病原体诱导的其他I型IFN不同，已经发现IFNε主要在FRT的器官比如子宫、子宫颈***和卵巢中组成型表达。IFNε由FRT的腔和腺体上皮细胞产生，并且在没有造血细胞的情况下不会改变。

另外，IFNε的调节与其他的I型IFN不同。与Ifnα和Ifnβ不同，鼠Ifnε表达对于响应病原性刺激基本上没有变化。

相反，IFNε水平在鼠动情周期的各阶段变化显著，在发情期间的表达水平高于间情期30倍，间情期是在***期间人组织中反映的表达方式。这表明与其他I型IFN不同，IFNε是激素调节的。

需要研究IFNε在癌症生物学中的作用。

发明内容

核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO)表示。SEQ ID NO在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)等。表2中提供了序列标识符的概述。序列表在权利要求之后提供。

本发明部分基于确定IFNε具有抑制癌细胞的作用。这种抑制包括——通过包括细胞凋亡过程——直接或间接诱导癌细胞死亡，以及阻止包括减缓或抑制癌细胞的发展、增殖、运动和/或迁移。IFNε可以直接作用于癌细胞，或者它可以诱导免疫应答，该免疫应答经由特定细胞类型或调节剂或其他因子——其又在癌细胞上诱导细胞毒性或细胞抑制作用——的产生，或经由肿瘤细胞环境中的基质或组分中的细胞起作用。虽然本发明在研究卵巢癌后阐明，但是该发现适用于任何哺乳动物，特别是人类中的女性生殖道(FRT)的其他癌症以及雌性或雄性受试者体内其他地方的癌症。

因此，本发明提供了抑制包括人的受试者中癌细胞的活力、生长、发展和扩散的方法。这包括阻止，包括减缓或抑制癌细胞的发展、增殖、运动和迁移。

因此，本文教导了用于抑制受试者中的癌细胞的方法，该方法包括将癌细胞暴露于一定量的干扰素ε(IFNε)或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物，以有效的直接或间接诱导癌细胞的细胞凋亡或抑制癌细胞增殖、运动和/或迁移。这可导致癌细胞的局部生长和侵入以及它们转移到身体的其他部位的减少。与癌细胞相关的“暴露”意思是直接或间接暴露癌细胞或经由其他细胞或组分。

本文进一步实现了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物持续一段时间，并且在足以直接或间接诱导癌细胞的细胞凋亡或抑制癌细胞增殖、运动和/或缓解的条件下。这包括阻止癌症细胞生长和发展。

本说明书说明了IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物在制备治疗受试者癌症的药物中的用途。在一个实施方式中，本文教导了用于治疗受试者癌症的IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物。药物包括抗癌症疫苗，该抗癌疫苗包括作为主要活性成分的IFNε或其变体或杂合体或诱导物，或其中它充当用于另一种抗癌剂的佐剂。可以与IFNε或其变体或杂合体或诱导物结合使用的其他抗癌剂的实例包括化疗剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝***抑制剂、类固醇、性激素或激素样药物、烷化剂、氮芥、亚硝基脲、激素激动剂和微管抑制剂。重组细胞还可以被工程化以生产IFNε或其变体、杂合体或诱导物或重组病毒，该重组病毒被工程化以引导感染的细胞生产IFNε、其变体、杂合体或诱导物。工程化的IFNε包括通过优化密码子表达和/或优化治疗活性产生的IFNε。

用于治疗癌症的制剂，该制剂包括IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物和一种或多种载体、佐剂和/或赋形剂。IFNε或其功能性天然或合成变体或其杂合体形式也可以结合抗癌剂或癌细胞调节分子用作疫苗佐剂。

在表1中定义了本文使用的缩写。

表1

缩写

缩写	定义
		EOC	上皮起源
ER	***受体
		FCS	胎牛血清
FRT	女性生殖道
		HGSC	高级浆液性癌
HuIFNε	人干扰素ε
		IFN	干扰素
IFNε	干扰素ε
		IRG	干扰素调节基因
Ifnε	编码IFNε的基因
		LGSC	低级浆液性癌
MuIFNε	小鼠干扰素ε
		PEC	腹膜渗出液细胞
PR	孕酮受体
		TNBC	三阴性乳腺癌

附图说明

一些图包含颜色表示或实体。彩色照片可在申请时从专利权人或从适当的专利局获得。如果从专利局获得，可能会收取费用。

图1A至C是显示IFNε和IFNβ在ID8细胞中诱导干扰素调节基因(IRG)的图示。该图显示CXCL10(A)、lfit1(B)和Isg15(C)的10-1000IU/ml IFNε(左图显示为黑色)和IFNβ(右图显示灰色)诱导的3小时剂量反应。通过qRT-PCR测量基因表达，通过标准化至18s的dCT计算的表达和此处显示的相对表达与t0处的表达相关地确定。数据显示为n＝3个独立实验的平均值+/-SEM，每个实验以三个技术平行实验(technical triplicate)进行。通过学生T检验确定显著性****p<0.0001。

图2A至E是显示涉及癌症相关生物学功能的基因的调节的图示。图表显示响应用1000IU/ml的IFNε(中间条)或IFNβ(右条)刺激3小时的Bcl-2(A)、Ccne1(B)、Cdc20(C)、Tap1(D)和Casp1(E)的表达。数据显示为n＝3个独立实验的平均值+/-SEM，每个实验以三个技术平行实验进行。通过学生T检验确定显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图3A和B是显示在用干扰素处理ID8细胞72小时内以30分钟间隔的平均细胞指数测量值——细胞数量的相关性——的图示；显示IFNε(A)而不是IFNβ(B)抑制ID8细胞增殖。图表显示用100-1000IU/ml的a)IFNε；b)IFNβ处理的ID8细胞抑制增殖48小时。通过xCELLigence测量细胞增殖。图表显示每个孔的平均细胞指数+/-SD。在无血清培养基中铺板的细胞24小时后(箭头)标准化每个细胞指数，并与未处理和缓冲液处理的对照进行比较。代表n＝3个独立实验，每个实验以三个技术平行实验进行。图例(a)-未处理的(红色)，对照(绿色)，100IU/ml IFNε(粉红色)和1000IU/ml IFNε(蓝色)；(b)未处理的(红色)，对照(绿色)，100IU/ml IFNβ(蓝色)和1000IU/ml IFNβ(粉红色)。

图4A至C是显示IFN诱导的ID8细胞生长抑制的图示。将ID8细胞铺板到涂有电极的96孔E板上以测量细胞阻抗。将细胞血清饥饿24小时，然后用0-1000IU/ml的(A)IFNε；或(B)IFNβ处理48小时。将细胞指数(CI-阻抗的量度)标准化为治疗时间，并使用RTCA软件在处理后48小时计算倍增时间。(C)还使用RTCA软件从标准化的Cl到处理后48小时计算生长曲线的斜率(代表增殖速率)。数据代表n＝3个独立实验，以四个技术平行实验进行。数据表示为N＝3个独立实验的平均值±SD，使用双因素方差分析(2-way ANOVA)和Sidak多重比较检验进行分析，****p，<0.0001。

图5是显示IFNε处理抑制ID8细胞的细胞迁移的图示。ID8细胞用1-100IU/ml的IFNε或缓冲液对照处理，并在处理12小时后测量迁移。胎牛血清(FCS)用作化学引诱物。无血清培养基(SFM)用作阴性对照。数据代表一个独立实验，以三个技术平行实验进行，并表示为技术重复的平均值±SD。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比较确定显著性；*P<0.05；**P，0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图6A至D是显示IFNε处理诱导ID8细胞凋亡的图示。数据显示与PBS和缓冲液处理的对照相比，用40-400IU/ml IFNε处理ID8细胞4小时的膜联蛋白V/PI染色分析。H₂O₂用作阳性对照。(A)活细胞；(B)坏死细胞；(C)早期凋亡；(D)晚期凋亡。数据代表N＝3个独立实验，以两个技术平行实验进行，并且表示为技术重复的平均值±SD。使用学生T检验确定显著性；*P，0.05；**P<0.01。

图7是良性人上皮和浆液性癌样品中IFNε染色强度的图示。使用Imagecope软件中的正像素分析来分析人对照上皮低级(LG)和高级(HG)浆液性癌(SC)样品中IFNε表达的免疫组织化学染色以量化上皮衍生组织成分中的染色强度。数据表示为在两个技术平行实验中染色的每个样品的强度分数。数据表示为来自低(n＝6)和高级浆液性癌样品(n＝70)的对照上皮和上皮的n＝30个样品的点图，平均值由条表示。使用单独的Mann-Whitney检验分析数据，**p<0.01，***p<0.001。

图8A至E为来自直生原发性肿瘤转移的晚期浸染卵巢癌的图示。在囊内ID8注射后13周，WT和Ifnε缺陷小鼠表明晚期原发性肿瘤和转移卵巢癌。A-B)将来自非肿瘤和ID8注射小鼠的左卵巢和脾脏称重；C)从腹膜排出腹水；和E)测量红细胞计数；D)记录腹膜壁上转移瘤的数量。数据显示每个基因型。n＝3没有荷瘤的和n＝6ID8注射小鼠，分析使用非配对的学生T检验*p<0.05。

图9A至D为显示重组IFNε在体内调节腹膜免疫细胞群体的图示。经腹膜内注射，用重组鼠IFNε或IFNβ(以500IU/剂量)健康的C57BL/6野生型小鼠(6至8周龄)，每周三次，持续8周。经腹膜灌洗在PBS中收集腹膜渗出液细胞并且对于包括下述的免疫细胞群体使用流式细胞术分析：A)CD45⁺CD8⁺T细胞；B)CD45⁺CD4⁺T细胞；C)CD45⁺CD11b⁺Ly6C+炎性单核细胞；和D)CD45⁺CD4⁺PD1⁺T细胞。数据表示为每组n＝5小鼠的平均值+/-SEM，使用非配对的学生T检验分析，*p<0.05，**p<0.01。

图10A至C为显示IFNε在浸染卵巢癌模型中抑制恶性的腹水发展的图示。A)图像显示从用PBS、IFNε或IFNβ(500IU/剂量，每周3次)处理的ID8注射后8周小鼠的腹膜排出的腹水的体积；B)使用流式细胞术测量腹水中上皮(pan-细胞角蛋白阳性)肿瘤细胞的数量；C)使用Sysmex细胞计数器测量腹水中红细胞的浓度。数据显示每个处理组n＝3PBS对照小鼠和n＝5小鼠，分析使用非配对的学生T检验，*p，0.05，**p,0.01，***p<0.001。

图11A至C为显示用IFNε或IFNβ处理的载有肿瘤的小鼠中炎性细胞因子水平的变化的图示。图像显示了从用PBS、IFNε或IFNβ(500IU/剂量，每周3次)处理的ID8注射后8周的小鼠的腹膜排出的腹水中MCP-1(A)、IL6(B)和IL-10(C)的浓度，由BD流式细胞小球微阵列(CBA)测量。数据显示表示为平均值^+/-SEM，每个处理组n＝3PBS对照小鼠和n＝5小鼠，分析使用非配对的学生T检验，*p,<0.05。

图12是显示浸染卵巢癌模型中重组IFNε调节腹膜免疫细胞群体的图示。C57BL/6野生型小鼠(6至8周龄)腹膜内注射ID8细胞并且经腹膜内注射用重组鼠IFNε或IFNβ处理(以500IU/剂量)，每周三次，持续8周。在PBS中经腹膜灌洗收集腹膜渗出液细胞，并且使用流式细胞术分析免疫细胞群体。数据表示为平均值^+/-SEM，每组n＝5小鼠，分析使用非配对的学生T检验，*p<0.05；**p<0.01。

图13A至D为显示用重组干扰素处理的上皮起源(EOC)的鼠癌症中生长和腹水发展的图示。A)ID8细胞注射后8周内监测小鼠的体重并且计算每个处理组相对于所有小鼠在第1天的平均值的百分比体重增加，在实验开始时的与平均体重的距离并入每个小鼠的总体百分比增加。B)总体生长曲线测量用或不用重组IFN每周处理3次的ID8细胞注射后8周小鼠的总体体重。C)在ID8细胞注射后8周测量腹围。D)ID8细胞注射后8-周从每个小鼠腹膜腔排出的腹水的总体积。为了确定横跨多个组的显著性，进行常见的单因素ANOVA以及Tukey多重比较检验(A)，同时非配对的学生T检验用于比较两个平均值(C和D)，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。数据表示为平均值^+/-SEM，n＝3-5个小鼠每组。

图14A至D为显示鼠EOC中，IFN对系统性贫血、腹膜出血和脾肿大的影响的图示。A)ID8细胞注射后8-周小鼠中贫血的临床信号包括后爪的苍白，其分级为0–正常灌注，1-轻微苍白，2–极度苍白。B)使用5ml PBS进行腹膜灌洗并且对于出血分级，0–没有出血至3–大量出血，深红色和完全不透明的流体。C)对腹膜渗出液细胞(PEC)进行细胞计数，包括红细胞(RBC)计数。D)来自ID8细胞注射后8周小鼠的脾脏重量。数据表示为平均值^+/-SEM，每组n＝3-5小鼠。使用非配对的学生T检验确定显著性，****p,0.0001，**p<0.01，*p<0.05。

图15A至F为显示用重组IFNε处理的鼠EOC中肿瘤载荷的影响的图示。A)肠系膜肿瘤载荷的程度分级，0–没有肉眼可见的疾病至4-大量肿瘤形成，明显的是大的结节性膈下肿瘤块以及整个肠系膜中数不清的肿瘤沉淀物。B)计数连接至腹膜壁的肉眼可见的肿瘤沉淀物。这些包括不同尺寸的肿瘤。C)计数连接至膈膜的肉眼可见的肿瘤沉淀物。这些包括不同尺寸的肿瘤。D)计数连接至肝叶的肉眼可见的肿瘤沉淀物。E)计数游离漂浮的球状体。F)每个小鼠的最大代表性肿瘤结节的表面积测量。数据表示为平均值^+/-SEM，每组n＝3-5小鼠。使用非配对的学生T检验确定显著性，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图16A和B为包括优化的表达序列(优化的密码子使用)的人和鼠IFNε的核苷酸和氨基酸序列。

具体实施方式

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”或变型比如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的要素或整数或方法步骤或要素或整数或方法步骤的组，但是不排除任何其他要素或整数或方法步骤或要素或整数或方法步骤的组。

如在本说明书中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个方面。因此，例如，提及“癌细胞”包括单个癌细胞，以及两个或更多个癌细胞；提及“IFNε”包括单个IFNε分子，以及两个或多个IFNε分子；提及“本公开内容”包括由本公开内容所教导的单个方面和多个方面；等等。本文教导和实现的方面包括在术语“发明”中。本文考虑的任何变体和衍生物都包括在本发明的“形式”中。在权利要求的宽度范围内实现了本发明的所有方面。

本发明教导了干扰素ε(IFNε)在治疗受试者癌症中的用途。这包括IFNε的功能性天然或合成变体或杂合体形式。本文进一步教导了Ifnε表达或IFNε活性的诱导物在治疗癌症中的用途。因此，IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式可直接作用于癌细胞，或可经由先天性或适应性免疫细胞或调节剂或IFNε诱导的过程或经由肿瘤细胞中的基质细胞或环境组分间接起作用。

因此，本文实现了使用以下来直接或间接抑制癌细胞：

(i)天然纯化的IFNε；

(ii)重组IFNε，包括通过优化表达产生的IFNε；

(iii)IFNε的功能性天然变体；

(iv)IFNε的功能性合成变体，包括针对活性的优化；

(v)来自不同物种的两种或更多种IFNε的杂合体；和/或

(vi)Ifnε表达或IFNε活性的诱导物，

本发明可以使用(i)至(vi)中的任一种，即选自(i)至(vi)的药剂，或使用(i)至(vi)中的两种或更多种的组合来治疗癌症。提及Ifnε表达或IFNε活性的诱导物包括上调启动子活性、优化调节控制以提供升高水平的IFNε的药剂，和增强IFNε活性的药剂。

癌症的治疗包括抑制单个或多个癌细胞。这包括直接或间接诱导癌细胞凋亡、直接或间接充当细胞毒素剂、直接或间接抑制癌细胞的复制、生长、发展、运动、增殖、存活和/或迁移、和/或直接或间接诱导癌细胞的白细胞淤积中的任一种或多种。该治疗可以经由肿瘤细胞的基质细胞或环境组分增强抗癌活性。

此外，IFNε或其功能性天然或合成变体或诱导物可以直接或间接防止癌细胞的局部生长或侵入和/或防止癌症细胞在受试者体内其他地方的转移，包括远离癌细胞发展的原始病灶的区域。

本发明部分源于卵巢癌的研究。然而，IFNε的抗癌作用适用于一系列癌症中的任一种，包括源自上皮组织、***、腺体组织、胚胎组织的癌症，血源性癌症，以及包括造血细胞、淋巴组织和骨髓或这种细胞所来源的细胞的癌症。本发明不限于治疗任一种类型的癌症或器官或受癌症影响的解剖学隔室或区域。因此，本发明延伸到治疗来自卵巢、子宫、输卵管、子宫内膜、胎盘、乳腺、睾丸、***、脑、胃、肝脏、脾脏、胰腺、胸腺、结肠、肺、肾、心脏、甲状腺和平滑肌中的任一种的癌症。这不旨在是穷尽的列表，而是代表可以通过IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物治疗的癌症类型。

然而，在一个实施方式中，本发明延伸到影响女性生殖道(FRT)的癌症，比如但不限于卵巢癌。如上所述，IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式可直接作用于癌细胞，该癌细胞诱导细胞凋亡、细胞毒性、衰老、裂解或其他形式的细胞死亡中的任一种或多种，或者可以延迟、抑制或以其他方式抑制细胞生长、增殖、复制、发展、迁移或运动。IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式也可间接作用于癌细胞，该癌细胞诱导细胞凋亡、细胞毒性、衰老、裂解或其他形式的细胞死亡中的任一种或多种，或者可以延迟、抑制或以其他方式阻止细胞生长、增殖、复制、发展、迁移或运动。在不将本发明限制于任何理论或作用模式的情况下，间接活性包括先天和适应性免疫调节剂和过程的诱导。IFNε还可以经由围绕癌细胞或癌组织的基质细胞或环境组分起作用。

接受治疗的受试者包括人和非人哺乳动物。非人动物包括在动物模型中有用的那些。这类动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猪和较大的非人动物。本文包括的其他动物是伴侣动物(例如狗和猫)，以及马类动物，包括马、普氏野马(Przewalski horse)、斑马和驴。“马”包括纯种马、温血马、夸特马(Quarter horse)和标准种马。圈养野生动物比如袋獾(Tasmanian devil)也可以是治疗对象，并且包括在本发明中。因此，本发明可用于人类和兽医学以及作为研究工具。

提及人类受试者包括任何性别或年龄的人。在一个实施方式中，人是患有影响FRT的癌症比如但不限于卵巢癌的女性。

虽然不意欲将本发明的范围限制于任何类型的癌症，但是它涉及癌、肉瘤、腺癌、胚细胞瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。术语“癌症”不应被解释为与“肿瘤”不同，并且这两个术语在本文中用于表示相同的细胞类型。无论分期如何分类，癌症可以是任何等级和任何阶段。因此，癌症可以是实体瘤或源自血液或淋巴液或骨髓，并且可以根据细胞类型、位置、肿瘤大小、局部、区域或远处转移的程度来定义。例如，关于卵巢癌，这可以是高级或低级或其间的等级的浆液性、粘液性、透明细胞或子宫内膜样。

因此，本文中实现的是用于抑制受试者中的癌细胞的方法，该方法包括将癌细胞暴露于一定量的干扰素ε(IFNε)或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物，其有效地间接或间接诱导癌细胞的凋亡、存活、增殖、运动和/或迁移。

本文进一步实现了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物持续一段时间，并且在足以诱导癌细胞的凋亡或抑制癌细胞增殖、运动和/或迁移的条件下。

本文教导了IFNε或其功能性天然或合成变体或其杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物在制备治疗受试者癌症的药物中的用途。

本文进一步教导了用于治疗受试者癌症的IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物。

IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式也可用作与抗癌剂比如化疗剂，另一种I型干扰素比如IFNα或IFNβ或另一种生物分子一起使用的佐剂。在本文中，“佐剂”是指与另一种抗癌剂协同作用的IFNε或变体或杂合体。

因此，本文中实现的是用于抑制受试者中的癌细胞的方法，该方法包括将癌细胞暴露于与另一种抗癌剂组合的一定量的干扰素ε(IFNε)或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物，其有效地间接或间接诱导癌细胞的凋亡、存活、增殖、运动和/或迁移。

本文进一步实现了用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用与另一种抗癌剂组合的有效量的IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物持续一段时间，并且在足以诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞增殖、运动和/或迁移的条件下。

本文教导了与另一种抗癌剂组合的IFNε或其功能性天然或合成变体或其杂合体形式或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物在制备治疗受试者癌症的药物中的用途。药物可以是彼此组合使用的单一实体或药学上有效的药剂的搭配。

提及另一种抗癌剂包括但不限于化疗剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝***毒性抑制剂、类固醇、性激素或激素样药物、烷化剂、氮芥、亚硝基脲和/或激素激动剂。抗癌剂可以进一步包括微管免疫细胞或其产物。

化疗剂的实例包括放线菌素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星和米托蒽醌或基于铂的药剂。抗代谢物是干扰人体化学过程的物质，人体化学过程比如产生蛋白质、DNA和用于细胞生长和繁殖所需的其他化学物质；在癌症治疗中，抗代谢药物会破坏DNA的产生，这又阻止细胞***。实例包括重氮丝氨酸、D-环丝氨酸、麦考酚酸、甲氧苄氨嘧啶、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷(ara-C)和氟达拉滨。

抗肿瘤抗生素通过阻止酶和有丝***或改变围绕细胞的膜来干扰DNA。这些药剂可在细胞周期的所有阶段起作用。因此，它们广泛用于各种癌症。抗肿瘤抗生素的实例包括放线菌素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星和米托蒽醌。

有丝***抑制剂是植物生物碱和衍生自天然产物的其他化合物。它们可以抑制或阻止有丝***或抑制用于制备细胞增殖所需的蛋白质的酶。这些在细胞周期的M期期间起作用。有丝***抑制剂的实例包括紫杉醇、多西紫杉醇、依托泊苷(VP-16)、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。

类固醇是可用于治疗一些类型的癌症(淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤)以及其他疾病的天然和合成激素。它们可以杀死癌细胞或减缓其生长。实例包括强的松和***。

性激素或激素样药物改变雌性或雄性激素的作用或产生。它们用于减缓乳腺癌、***癌和子宫内膜癌的生长，这些癌症通常响应体内激素水平而生长。实例包括抗***(它莫昔芬、氟维司群)、芳香酶抑制剂(阿那曲唑、来曲唑)、孕酮(醋酸甲地孕酮)，抗雄激素(比卡鲁胺、氟他胺)和LHRH激动剂(亮丙瑞林、戈舍瑞林)。

烷化剂直接作用于DNA以防止癌细胞复制。作为一类药物，这些药物不是时相特异性的(换句话说，它们在细胞周期的所有阶段起作用)。这些药物对慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤以及肺、乳腺和卵巢的某些癌症具有活性。烷化剂的实例包括白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、二氯甲基二乙胺(氮芥)和苯丙氨酸氮芥。

氮芥以其结晶盐酸盐的形式用作治疗霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和脑肿瘤的药物。氮芥引起细胞遗传物质的突变，从而破坏有丝***或细胞***。细胞对氮芥的易感性不同，其中快速增殖的肿瘤和癌细胞最敏感；产生红细胞的骨髓也是敏感的，并且红细胞产生的抑制是氮芥治疗的常见副作用。氮芥还能抑制免疫应答(参见免疫力)。其他类型包括芳族氮芥苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥、环磷酰胺、HN1、双-(2-氯乙基)、乙胺；HN2、双-(2-氯乙基)、甲胺和HN3、三-(2-氯乙基)、胺。

亚硝基脲以与烷化剂类似的方式起作用。它们会干扰有助于修复DNA的酶。这些药物能够前往脑，因此可用于治疗脑肿瘤以及非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和恶性黑色素瘤。亚硝基脲的实例包括卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)。

激素激动剂包括用于***癌的亮丙瑞林(Lupron,Viadur,Eligard)、用于乳腺癌和***癌的戈舍瑞林(Zoladex)和用于卵巢癌和***癌的曲普瑞林(Trelstar)和醋酸纳法瑞林(Synarel)。

微管抑制剂包括“长春花”生物碱、紫杉烷和苯并咪唑。

诱导Ifnε表达或IFNε活性包括IFNε诱导物的使用。这类药剂包括蛋白质和非蛋白质药剂。这些药剂可以与基因(包括IFNε的成熟或前体形式)的调节区相互作用或调节上游分子的表达，该上游分子随后调节Ifnε表达或表达产物活性。因此，本文考虑的是直接或间接诱导或修饰Ifnε表达和/或IFNε活性的药剂。

不以任何方式限制本发明，已知Ifnε表达是激素调节的。因此，在一个实施方式中，***和***模拟物的使用提供了上调IFNε水平的有用手段。在另一个实例中，可以使用TGFβ。类似地，生物信息学分析已经鉴定了IFNε启动子内的糖皮质激素受体反应元件和Ets因子结合元件。BRCA1的假定转录因子结合位点也已在人Ifnε启动子中被鉴定。因此，经由这些位点比如Elf3和Elf5激活转录的分子可用于上调Ifnε表达。

根据本发明的方面使用的诱导物药剂可以采用任何合适的形式。例如，蛋白质试剂可被糖基化或未被糖基化、磷酸化或去磷酸化至不同程度，和/或可以包含与蛋白质如氨基酸、脂质、碳水化合物或其他肽、多肽或蛋白质一起使用、连接、结合或以其他方式关联的一系列其他分子。类似地，非蛋白质分子也可以采用任何合适的形式。本文描述的蛋白质和非蛋白质药剂均可以连接、结合、以其他方式与任何其他蛋白质或非蛋白质分子关联。例如，在本发明的一个实施方式中，该药剂与允许它靶向局部区域的分子关联。

术语“表达”是指核酸分子的转录和/或翻译。提及“表达产物”是指由核酸分子的转录和翻译产生的产物。

本文描述的分子的“变体”包括天然存在的或合成制备的片段、部分(part)、部分(portion)或衍生物。非天然来源包括例如重组或合成来源。“重组来源”是指从中收获IFNε的细胞来源已经遗传改变。例如，这可以发生，以便增加或以其他方式提高该具体细胞来源的生产速率和生产量。部分或片段包括例如IFNε的活性区域。衍生物可以源自氨基酸的***、缺失或取代。氨基酸***衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内***。***氨基酸序列变体是其中将一个或多个氨基酸残基引入蛋白质中的预定位点的变体，尽管随机***结合适当筛选所得产物也是可能的。缺失变体的特征在于从序列中除去一个或多个氨基酸。取代氨基酸变体是其中已除去序列中的至少一个残基并在其位置处***不同残基的变体。氨基酸序列的添加包括与如上详述的其他肽、多肽或蛋白质的融合。

变体还包括具有特定表位的片段或与肽、多肽或其他蛋白质或非蛋白质分子融合的完整IFNε蛋白的部分。本文考虑的分子的类似物包括但不限于糖基化变体，侧链修饰，在肽、多肽或蛋白质合成期间并入非天然氨基酸和/或其衍生物，和交联剂的使用，以及对蛋白质分子或其类似物施加构象限制的其他方法。

IFNε的“变体”或“突变体”应理解为是指表现出IFNε的至少一些功能活性(即直接或间接的抗癌活性)的分子，其为IFNε的变体或突变体。变异或突变可以采取任何形式，并且可以是天然的或非天然的。在一个实施方式中，核酸已经历密码子优化以增强表达，和/或IFNε蛋白可以包含氨基酸变化以便优化活性。在一个实施方式中，变体是两个或更多个IFNε分子的杂合体。例如，可以修饰源自接受治疗的受试者物种的IFNε以并入来自另一物种的IFNε的方面，反之亦然。在一个实例中，鼠IFNε具有高于人IFNε的对人细胞的活性。因此，可以产生并入人IFNε的元件以使其具有非免疫原性的杂合鼠IFNε(反之亦然)。

提及IFNε或其核酸包括与SEQ ID NO：28或32具有至少80％相似性或与SEQ IDNO：27、29或31具有至少80％同一性的蛋白质序列。提及至少“80％”包括80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。编码IFNε的核酸的变体包括在低严格条件下与低严格条件下的SEQ ID NO：27、29或31的互补序列杂交的核酸(还参见图16)。

如本文所用的术语“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平的比较序列之间的精确同一性。在存在核苷酸水平的非同一性的情况下，“相似性”包括序列之间的差异，该差异产生在结构、功能、生物化学和/或构象水平上彼此相关的不同的氨基酸。在存在氨基酸水平的非同一性的情况下，“相似性”包括在结构、功能、生物化学和/或构象水平上彼此相关的氨基酸。在一个实施方式中，核苷酸和序列比较是在同一性水平而不是相似性水平上进行的。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性的百分比”、“序列同一性的百分比”、“基本上相似”和“基本上同一”。“参考序列”的长度至少为12，但是经常为15至18，通常至少为25或更高，比如30个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸各自可包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)两个多核苷酸之间不同的序列，通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域，来进行两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较。“比较窗口”是指通常12个连续残基的概念性区段，其与参考序列进行比较。对于两个序列的最佳比对，比较窗口可以包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即缺口)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTAin the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)，或者通过选择的各种方法中的任一种产生的检查和最佳比对(即，在比较窗口上产生最高百分比同源性)进行。还可以参考例如Altschul等(1997)Nucl.Acids.Res.25:3389公开的程序的BLAST家族。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等，第19.3单元(In:Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons Inc.1994-1998)中找到。

如本文所用的术语“序列相似性”和“序列同一性”是指在比较窗口上关于核苷酸与核苷酸基础或氨基酸与氨基酸基础序列相同或功能或结构相似的程度。因此，例如，通过比较比较窗口上的两个最佳比对序列，确定在两个序列中出现相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数以获得匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以获得序列同一性的百分比，来计算“序列同一性的百分比”。出于本发明的目的，“序列同一性”将被理解为使用软件所附的参考手册中使用的标准默认值由DNASIS计算机程序(Version2.5for windows；可获得自Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA)计算的“匹配百分比”。类似的评论适用于序列相似性。

本发明涉及Ifnε核酸分子的变体。通常，变体仍将在低严格条件下与Ifnε序列杂交。

变体包括IFNε的化学和功能等同物，其包括表现出IFNε的任一种或多种功能活性(即直接或间接抗癌活性)的分子，其功能等同物可能源自任何来源，比如经由筛选过程比如天然产物筛选化学合成或鉴定的。例如，可以使用众所周知的方法比如组合化学或重组文库的高通量筛选或天然产物筛选来设计和/或鉴定化学或功能等同物。

例如，可以筛选包含小的有机分子的文库，其中使用具有大量特定亲本基团取代基的有机分子。一般的合成方案可以遵循公布的方法(例如Bunin等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4708-4712；DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6909-6913)。简而言之，在每个连续的合成步骤中，将多个不同的选定取代基中的一个加入到阵列中选定的管子集中的每一个中，管子集的选择使得产生用于产生文库的不同取代基的所有可能的排列。在美国专利号5,763,263中概述了一种合适的排列方案。另一种排列包括基于片段的药物设计。

目前对于使用随机有机分子的组合文库来检索生物活性化合物(参见例如美国专利号5,763,263)存在广泛关注。通过筛选这种类型的文库发现的配体可用于模拟或阻断天然配体或干扰生物靶标的天然存在的配体。在本发明的上下文中，例如，它们可用作开发IFNε类似物的起点，该IFNε类似物表现出特性比如更有效的药理学作用。根据本发明的IFNε或其功能部分可以用于通过各种固相或溶液相合成方法形成的组合文库中(参见例如美国专利号5,763,263和其中引用的对比文件)。通过使用比如美国专利号5,753,187中公开的技术，可以在不到几周的时间内常规筛选数百万种新的化学和/或生物化合物。在鉴定的大量化合物中，仅进一步分析了那些表现出适当生物活性的化合物。

关于高通量文库筛选方法，使用组合文库装置筛选能够与选择的生物药剂比如生物分子、大分子复合物或细胞特异性相互作用的寡聚或小分子文库化合物，本领域技术人员可以从众所周知的方法比如上述方法的范围中容易选择该组合文库装置。在这种方法中，针对文库中的每个成员与选择的药剂特异性相互作用的能力来筛选。在实践该方法时，将生物药剂吸入包含化合物的管中，并使其与每个管中的各个文库化合物相互作用。该相互作用被设计为产生可检测的信号，该信号可用于监视期望的相互作用的存在。

本文考虑的IFNε的类似物包括但不限于对侧链的修饰，在肽、多肽或蛋白质合成期间并入非天然氨基酸和/或衍生物，以及使用交联剂和对类似物施加构象限制的其他方法。这种修饰可以采取的具体形式将取决于对象分子是蛋白质分子还是非蛋白质分子。具体修饰的性质和/或适用性可以由本领域技术人员常规确定。

如上所述，本发明涉及一种制剂，其中IFNε是人和鼠IFNε之间的杂合体。单独或与本发明的另一种抗癌剂组合施用的制剂也可以被称为药物组合物，该制剂包括IFNε或其功能性天然或合成变体或杂合体或Ifnε表达或IFNε活性的诱导物。这种制剂可以通过任何方便的方法制备。当以取决于具体情况的量施用时，预期制剂的组分表现出抗癌活性。适于实现抗癌活性的IFNε或变体、杂合体或诱导物的量定义为“治疗有效剂量”或“有效量”。剂量方案和用于该用途即“给药方案”的有效量将取决于多种因素，包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重程度、患者健康的一般状态、患者的身体状况、年龄、药物制剂和活性剂(例如IFNε)的浓度等。在计算患者的剂量方案时，还要考虑施用方式。剂量方案还必须考虑药代动力学，即药物组合物的吸收速率、生物利用度、代谢、清除等。参见，例如，Egleton(1997)Peptides 18:1431-1439；Langer(1990)Science 249:1527-1533。可能适用广泛范围的剂量。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可以每天、每周、每月或其他合适的时间间隔施用几个分开的剂量，或者可以根据情况的紧急情况所指示的按比例减少剂量。在一个实例中，每个受试者可以每周施用1至3次10Ul/剂量至1，000,000Ul/剂量的量。示例性剂量方案包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100IU/剂量、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000IU/剂量或10³、10⁴、10⁵、10⁶IU/剂量。这可以是每周1、2、3、4、5、6或7次。还可以基于受试者的IU/kg体重来计算剂量。在一个实施方式中，剂量通过任何方便的方式给予。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液(其为水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，或者可以是乳膏形式或适于局部施用的其他形式。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须保藏防止微生物比如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用涂层比如卵磷脂，通过在分散的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。此外，活性剂可以与聚L赖氨酸(ply L lysine)偶联或PEG化。

根据需要通过将所需量的活性化合物与上面列举的各种其他成分一起并入适当的溶剂中，然后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体包含基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术获得活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外的所需成分。

制剂可以以方便的方式施用，比如通过口服、腹膜内、静脉内、皮下、吸入、栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)。制剂可以以药学上可接受的无毒盐的形式施用，比如酸加成盐，或者与例如锌、铁等的金属络合物(出于本申请的目的被认为是盐)。示例性的这种酸加成盐有盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。如果活性成分以片剂形式施用，则片剂可包含粘合剂，比如黄蓍胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，比如藻酸；和润滑剂，比如硬脂酸镁。

可以将本发明的IFNε或其变体、杂合体或诱导物与药学上可接受的载体(赋形剂)组合以形成药理学组合物。药学上可接受的载体可包含生理学上可接受的化合物，例如该化合物起作用以稳定、或者增加或降低本发明的药物组合物的吸收或清除速率。生理学上可接受的化合物可以包括，例如，碳水化合物比如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂比如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，降低肽或多肽的清除或水解的组合物，或者赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。洗涤剂还可用于稳定或者增加或减少包括脂质体载体的药物组合物的吸收。用于肽和多肽的药学上可接受的载体和制剂是本领域技术人员已知的，并且在科学和专利文献中有详细描述。

如上所述，IFNε也可以作为另一种抗癌剂的佐剂加入。在这方面，“药物”包括单独或与另一种抗癌剂组合的IFNε或其变体或杂合体。

固体制剂可用于肠内(口服)施用。它们可以配制为例如丸剂、片剂、粉末或胶囊。对于固体组合物，可以使用常规的无毒固体载体，其包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过并入任何通常使用的赋形剂，比如先前列出的那些载体，来形成药学上可接受的无毒组合物。非固体制剂也可用于肠内施用。载体可以选自各种油，包括石油、动物、蔬菜或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药学赋形剂包括例如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、聚乙二醇、水和乙醇。

当口服施用时，可以保护本发明的组合物免于消化。这可以通过将该组合物与组合物络合以使其抵抗酸性和酶水解，或通过将这些分子包装在适当的抗性载体比如脂质体中来实现。保护化合物免于消化的方法是本领域众所周知的，参见例如，Fix(1996)PharmRes.13:1760-1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119-135；美国专利5,391,377描述了用于口服递送治疗剂的脂质组合物(脂质体递送在下文中进一步详细讨论)。

本发明的组合物还可以以持续递送或持续释放机制施用，该机制可以在内部递送制剂。例如，能够持续递送肽的可生物降解的微球或胶囊或其它可生物降解的聚合物构型可以包括在本发明的制剂中(参见例如Putney(1998)Nat.Biotechnol.16:153-157)。

对于吸入，可以使用本领域已知的任何系统递送本发明的组合物，包括干粉气溶胶、液体递送系统、空气喷射喷雾器、推进剂系统等。参见，例如Patton(1998)Biotechniques16:141-143；例如，Dura Pharmaceuticals(San Diego,CA),Aradigm(Hayward,CA),Aerogen(Santa Clara,CA)的用于多肽大分子的产物和吸入递送系统，吸入治疗系统(San Carlos,CA)等。例如，IFNε制剂可以以气溶胶或雾的形式施用。对于气溶胶施用，制剂可以以精细分开的形式与表面活性剂和推进剂一起供应。在另一方面，用于将制剂递送至呼吸组织的装置是其中制剂蒸发的吸入器。其他液体递送系统包括例如空气喷射喷雾器。

IFNε还可以配制成适于肺部或呼吸递送给患者的药学上可接受的组合物。具体的制剂包括适用于雾化的干粉、液体溶液或悬浮液，以及适用于计量剂量吸入器(MDI的)的推进剂制剂。在专利、科学和医学文献中充分描述了这类制剂的制备，并且以下描述仅旨在是示例性的。

用于喷雾器系统的IFNε的液体制剂可以包括增强或维持化学稳定性的组分，包括螯合剂、蛋白酶抑制剂、等渗改性剂、惰性气体等。

为了用于计量的剂量吸入器，将本发明的IFNε溶解或悬浮在合适的气溶胶推进剂比如氯氟烃(CFC)或氢氟烃(HFC)中。合适的CFC包括三氯一氟甲烷(推进剂11)、二氯四氟乙烷(推进剂114)和二氯二氟甲烷(推进剂12)。合适的HFC包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。

在一个实施方式中，为了并入气溶胶推进剂中，将本发明的IFNε加工成如下针对干粉制剂描述的可吸入颗粒。然后将颗粒悬浮在推进剂中，通常用表面活性剂涂覆以增强它们的分散。合适的表面活性剂包括油酸、脱水山梨糖醇三油酸酯和各种长链甘油二酯和磷脂。

这种气溶胶推进剂制剂可以进一步包括低级醇，比如乙醇(按重量计至多30％)和其他添加剂，以维持或增强化学稳定性和生理学可接受性。

干粉制剂通常包含干燥的，通常为冻干的形式的IFNε，其具有用于在肺的肺泡区域内沉积的优选范围内的特定大小。在该优选的尺寸范围内的IFNε的可吸入粉末可以通过各种常规技术产生，比如喷射研磨、喷雾干燥、溶剂沉淀等。然后可以在常规的干粉吸入器(DPI)中或空气辅助装置中向患者施用干粉，干粉吸入器使用吸气呼吸通过装置来将粉末分散到气溶胶云中，空气辅助装置使用外部电源将粉末分散到气溶胶云中。在以上描述中，提及“IFNε”包括其变体、杂合体和诱导物。

在制备本发明的药物制剂中，可以使用和操作各种修饰以改变药代动力学和生物分布。用于改变药代动力学和生物分布的许多方法是本领域普通技术人员已知的。

在一个实施方式中，通过直接影响Ifnε的表达来实现Ifnε表达的诱导。这可以通过将包括Ifnε的基因直接引入构建体的实体瘤中的癌细胞来实现，这将允许在表达或甚至从头表达时诱导IFNε或其活性变体的水平，从而产生它所针对的生物学功能。因此，可以使用重组细胞或病毒手段在癌细胞处或癌细胞附近或癌细胞内产生IFNε或其变体、杂合体或诱导物。

本发明进一步考虑了治疗癌症的方法的组合。例如，IFNε治疗或通过IFNε的变体或杂合体或诱导物治疗可以与癌症或受癌症影响的器官或组织的外科或化学消融组合使用。

实施例

通过以下非限制性实施例进一步描述本文公开的方面。

方法

细胞系和细胞培养

卵巢癌细胞系ID8(鼠科；Roby等(2000)Carcinogenesis 21(4):585-591)用于体外测定。将ID8细胞系在补充有4％v/v热活化的胎牛血清(FCS；GibcoBRL)的RPMI 1640(GibcoBRL,Ontario,Canada)中培养。所有细胞在37℃下在5％v/v的二氧化碳(CO₂)的气氛中培养。根据MycoAlert(商标)PLUS支原体检测试剂盒，细胞是支原体阴性的(比例<1；Lonza,Basel)。

用于基因表达研究的细胞刺激

利用重悬浮缓冲液(如下文描述)或PBS作为载体对照，在用在0–1000IU/ml下的重组IFN或IFN(如下文描述)刺激之前24小时，将细胞系铺板(1.5x10⁵个细胞/孔)在12孔板中。然后在进行mRNA提取之前将细胞在37℃下温育3小时。

mRNA提取和纯化

使用QIAGEN RNA小量提取试剂盒(Invitrogen,USA)按照制造商的方案提取RNA(详细方案参见附录B)。在β-巯基乙醇/RLT(10μl-ME每1ml RLT缓冲液)中并使用1mL注射器和23号针头收集细胞，将每个样品上下注射10次以使细胞均质化。根据制造商的说明，使用QIAGEN核糖核酸酶-游离脱氧核糖核酸酶组(Invitrogen,USA)柱上脱氧核糖核酸酶处理RNA。然后使用NanoDrop(注册商标)ND-1000分光光度计(RNA纯度的可接受范围为～2.0的260/280比例和在2.0-2.2之间的260/230比例)来评估RNA的产量和质量，并储存在-80℃下。

cDNA合成

用Milli-Q H₂O处理的焦碳酸二乙酯(DEPC)将总计500ng的RNA补充至7μl。接着，使用M-MLV逆转录酶(Promega，USA)，根据制造商的指导，将RNA逆转录成cDNA。将cDNA样品存储在-20℃下直到使用。

GAPDH聚合酶链式反应PCR)

在存在或缺少逆转录酶酶(+/-RT)的情况下，对来自cDNA合成的样品进行GAPDHPCR。对于阴性RT样品，由GAPDH PCR产生的产物的缺失排除了存在基因组DNA污染。将1μl的等分试样的cDNA添加至5x绿色GoTaq缓冲液、氯化镁、正向和反向GAPDH引物、10mM dNTPs、GoTaq酶(Promega，USA)中，并且用DEPC处理的H₂O补充至25μl的总体积。

在MyCycler(商标)热循环仪(BIO-RAD)中，使用下述循环反应条件进行所有的PCR反应：

接着，将每个PCR产物加载在1.5％w/v琼脂糖凝胶上并且在100V下试验30分钟。

定量的实时PCR(qRT-PCR)

在可能的情况下，将引物设计为横跨内含子的。这确保了基于尺寸，将cDNA条带与基因组DNA区分开。使用Primer Express(注册商标)v3.0软件(Applied Biosystems，USA)设计引物。每个反应在总计10μl中进行，包括2μl的cDNA、5μl Sybr Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，USA)，0.2μl每种10mM原料的相关正向和反向引物和DEPC H₂O。所有基因扩增归一化至18S的表达，18S为在细胞中稳定表达的内部对照基因。将样品一式三份加载在MicroAmp(商标)光学384孔反应板上，并且用MicroAmp(商标)光学胶粘膜密封。另外，也使用两个RT阴性反应，作为非转录物对照，其中DEPC处理的H₂O用于替换cDNA。通过分析琼脂糖凝胶上的解离曲线和可视化，确认单个PCR产物的扩增。引物序列的列表提供在表2中。

表2

序列标识符的总结

GAPDH引物

5’GAPDH引物5’-GAACGGGAAGCTTGTCATCAA-3’(SEQ ID NO:1)

3’GAPDH引物3’-CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG-5’(SEQ ID NO:2)

qRT-PCR SYBR引物

5’18S引物5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’(SEQ ID NO:3)

3’18S引物3’-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-5’(SEQ ID NO:4)

小鼠

5’Isg15引物5’-TGAGAGCAAGCAGCCAGAAG-3’(SEQ ID NO:5)

3’Isg15引物3’-ACGGACACCAGGAAATCGTT-5’(SEQ ID NO:6)

5’Tap1引物5’–CGCAACATATGGCTCATGTC–3’(SEQ ID NO:7)

3’Tap1引物3’–GCCCGAAACACCTCTCTGT–5’(SEQ ID NO:8)

5’Cdc20引物5’–GTCACTCCGCTCGAGTAAGC–3’(SEQ ID NO:9)

3’Cdc20引物3’–GCCCACATACTTCCTGGCTA–5’(SEQ ID NO:10)

5’Ccne1引物5’–CCTCCAAAGTTGCACCAGTT–3’(SEQ ID NO:11)

3’Ccne1引物3’–AGAGGGCTTAGACGCCACTT–5’(SEQ ID NO:12)

5’Cxcl10引物5’-CTGAATCCGGAATCTAAGACCA-3’(SEQ ID NO:13)

3’Cxcl10引物3’-GAGGCTCTCTGCTGTCCATC-5’(SEQ ID NO:14)

5’Ifit1引物5’-TCAAGGCAGGTTTCTGAGGA-3’(SEQ ID NO:15)

3’Ifit1引物3’-ACCTGGTCACCATCAGCATT-5’(SEQ ID NO:16)

5’Casp1引物5’–ACGCCATGGCTGACAAGATCCTG–3’(SEQ ID NO:17)

3’Casp1引物3’–GGTCCCGTGCCTTGTCCATAGC–5’(SEQ ID NO：18)

5’Ifnε引物5’–GAAACGGATTCCCTTCCAAT–3’(SEQ ID NO:19)

3’Ifnε引物3’–ACTGCTGGACTGACGAGCTT–5’(SEQ ID NO:20)

人

5’ISG15引物5’-GCGAACTCATCTTTGCCAGT-3’(SEQ ID NO:21)

3’ISG15引物3’-AGCATCTTCACCGTCAGGTC-5’(SEQ ID NO:22)

5’IFIT1引物5’–AGCTTACACCATTGGCTGCT–3’(SEQ ID NO:23)

3’IFIT1引物3’–CCATTTGTACTCATGGTTGCTGT–5’(SEQ ID NO:24)

5’IFNε引物5’–AGGACACACTCTGGCCATTC-3’(SEQ ID NO:25)

3’IFNε引物3’–CTCCCAACCATCCAGAGAAA–5’(SEQ ID NO:26)

IFNε核苷酸和氨基酸序列

人核苷酸(SEQ ID NO:27)

人氨基酸(SEQ ID NO:28)

鼠核苷酸(SEQ ID NO:29)

鼠核苷酸(优化)[SEQ ID NO:30]

鼠核苷酸(SEQ ID NO:31)

鼠氨基酸(SEQ ID NO:32)

rmIFN的氨基酸残基22-27(SEQ ID NO:33)

使用7900HT Fast实时PCR机器(Applied Biosystems，USA)使用下述热循环方案处理所有的反应处理：50℃，2分钟，95℃，10分钟，随后40个循环的95℃，15秒和60℃，1分钟。输出对于所有探针的循环阈值(Ct)值并且使用2-CT方法进行数据分析。对于图，将基因扩增归一化至18S的表达，18S为在细胞中稳定表达的内部对照基因。接着，相对于未处理的样品(其为1)的值表达IFN处理之后倍数改变的值。

细胞生长试验

对于实时细胞分析(RTCA)，使用xCELLigence系统(ACEA Biosciences，Inc.，SanDiego，CA，USA)测量细胞增殖。将50微升的细胞培养基添加至96孔E-板(ACEABiosciences，Inc.)的每个孔，用于阻抗背景测量。接着，在无血清培养基中，将细胞添加(ID8–6x10³细胞/孔，CAOV3和OVCAR4–1x10⁵细胞/孔)至100μL的体积，并且允许粘附过夜。将重组IFN或载体添加至细胞至普通培养基的200μL的终体积。将E-板在37℃下用5％v/v CO₂温育并且在RTCA系统上，以15-分钟时间间隔阻抗测量，处理或不处理至多72小时。对于数据分析，通过从仅仅具有培养基的CI减去包含细胞的孔的CI确定基线细胞指数(CI)。为了利于结果的统计评估，将来自每个孔的阻抗测量归一化至用IFN刺激的时间，称为“归一化细胞指数”。以技术一式四份进行三个独立的实验并且使用RCTA软件分析生长曲线d倍增时间和斜率(1/hr)，指示增殖的速率。使用双因素ANOVA Sidak的多重比较检验分析数据，****p<0.0001，***p<0.001。

迁移试验

对于单个细胞追踪，将ID8细胞以2.5x10⁴细胞/孔在48孔板中，在无血清培养基中铺平板并且使得其粘附过夜。对于划痕试验，将ID8细胞在48孔板中铺平板并且允许达到汇合。使用P10过滤器嘴(Axygen Scientific，California)，将涂布的孔划痕。使用CellTrace(商标)CFSE细胞增殖试剂盒(ThermoFischer Scientific，Massachusetts)，根据制造商的指导，将细胞染色，接着在PBS中冲洗并且用重组IFN处理。使用共焦显微镜，每30分钟捕获荧光图像12小时，并且使用Imaris软件分析。对于单个细胞追踪，经荧光追踪个体细胞，以测量每个细胞移动的总体距离(追踪长度)和从每个细胞的初始至最终位置的直接位移长度(追踪位移)超过12小时。通过学生T检验确定显著性，比较技术上一式三份平铺的2.5x10⁴个细胞移动的平均距离。对于划痕试验，将细胞迁移测量为12小时内划痕(空白空间)的百分比表面积闭合。通过单因素ANOVA与Tukey多重比较确定显著性；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

细胞凋亡试验

将ID8细胞在12孔板中以2ml铺平板(3.5x10⁴细胞/孔)并且使得粘附过夜。用重组鼠Ifn或载体对照刺激细胞48小时。过氧化氢(H₂O₂)以1-5mM用作阳性对照，用于诱导细胞凋亡。刺激之后，将细胞胰蛋白酶化并且在PBS中冲洗。使用FITC膜联蛋白V细胞凋亡探测试剂盒II(BD Biosciences，New Jersey)，根据制造商的指导，将单个细胞悬浮液用FITC缀合膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色，并且通过流式细胞术，使用FACSCanto(商标)II流式细胞计数器(BD Biosciences)和Flo-Jo软件分析。不同阶段的细胞凋亡定义为i)活细胞(FITC膜联蛋白V-/PI-)，ii)早期细胞凋亡(FITC膜联蛋白V+/PI-)，iii)后期细胞凋亡(FITCAnnexinV+/PI+)，和iv)坏死细胞(FITC膜联蛋白V-/PI+)。

免疫组织化学

将人输卵管、小鼠器官和肿瘤样品在10％v/v中性缓冲***中固定24小时，接着，在70％v/v乙醇中冲洗，并且嵌入链烷烃中。将组织以4-μm厚度切片并且为H&E、平滑肌肌动蛋白(SMa)、细胞角蛋白18(Ck18)和IFN染色。简言之，将组织学组织切片脱蜡并且再水化。通过在10mM Tris/1mM EDTA(pH 9.0)中加热进行抗原检索6分钟。在用3％v/v过氧化氢抑制内源过氧化物酶活性之后，在CAS-Block[商标](ThermoFisher Scientific)中将组织封闭1小时。接着，将组织在4℃用抗IFNε(1:200；Novus Biologicals，Colorado)、抗SMa(1:100；Dako Omnis，Santa Clara)、抗Ck18(1:50；Dako Omnis)和兔子IgG(1:200；VectorLaboratories，California)或小鼠IgG1(1:37；Vector Laboratories)作为同种型对照温育过夜。将生物素化的抗兔子或抗小鼠IgGs(都1:250稀释；Vector Laboratories)在相同缓冲液中稀释并且温育1小时。接着，在0.05％v/v Tween/PBS中冲洗载玻片并且用抗生物素蛋白和生物素化的辣根过氧化物酶(VECTASTAIN(注册商标)Elite(注册商标)ABC试剂盒，Vector Laboratories)，根据制造商的指导温育并且再次冲洗。接着，将载玻片用二氨基联苯胺盐酸盐(DAB；DAB+基板色原系统，Dako Omnis)根据制造商的指导温育。将切片用Haematoxylin复染45秒，接着脱水并且置于具有邻苯二甲酸二丁酯的二甲苯二甲苯(DPX；Merck，德国)的盖玻片下。使用Imagescope软件中的阳性像素分析工具计算染色强度并且使用Mann-Whitney检验确定显著性，**p<0.01，****p<0.0001。

免疫分型

使用直接与荧光染料缀合的一组单克隆抗体，从研究用于表面抗原表达的C57BL/J小鼠的腹膜灌洗细胞获得单细胞悬浮液。为了防止非特异性结合，用阻断抗体(BDPharMingen，California)的抗小鼠CD16/CD32 FcγIII/II受体阻断细胞表面受体。对于表面染色，用荧光染料标记的抗体的各种组合对细胞染色：图1-APC缀合的CD45，APC-Cy7缀合的CD8，FITC缀合的NK-1.1，PE缀合的CD69，Pacific Blue缀合的CD4；图2-APC缀合的CD25，APC-Cy7缀合的CD8，FITC缀合的CD45，PE缀合的Pan CK，PE-Cy7缀合的CD4和Pacific Blue缀合的FoxP3；图3-APC缀合的CD45，APC-Cy7缀合的CD11b，FITC缀合的Ly6C，PE缀合的I-Ab，PE-Cy7缀合的CD11c和Pacific Blue Ly6G。使用FACSCanto(商标)II流式细胞仪(BDBiosciences)和Flo-Jo软件分析细胞。

细胞计数珠阵列(CBA)

使用细胞计数珠阵列(BD CBA小鼠炎症试剂盒；BD Pharmingen)根据制造商的说明书测定注射ID8细胞的小鼠的腹膜渗出液细胞的上清液中的细胞因子水平(参见下面的卵巢癌的腹膜内模型)。流式细胞术用于检测PE缀合的检测抗体，其与IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70或TNF-α的捕获珠形成夹心复合物。使用FACSCanto(商标)II流式细胞仪(BD Biosciences)和Flo-Jo软件获得每种夹心复合物的PE荧光强度。

小鼠

将C57bl/6背景的Ifn^-/-小鼠(Fung等(2013)同上)和野生型小鼠(Monash AnimalResearch Facility,Monash University,Clayton,Australia)置于标准的无特定病原体(SPF)条件下。

囊内(直生)卵巢癌模型

在这些实验中使用雌性(10周龄)C57BL/6野生型(Ifn^+/+)和Ifn缺陷小鼠(Ifn^-/-)。通过在诱导室中吸入异氟烷(氧气中5％)麻醉小鼠，并且麻醉维持在所有程序期间经由鼻锥递送的2.5-3.0％异氟烷。在手术前向小鼠皮下注射卡洛芬(5mg/kg)。在卵巢脂肪垫正上方的背内侧位置做一个小切口，并通过腹膜壁进行第二个小切口。将卵巢脂肪垫外化并用公牛夹稳定，并用解剖显微镜定位暴露的卵巢中的输卵管。将ID8细胞(1x10⁶)注射到左卵巢囊下面。在局部布比卡因施用之前使用6/0缝合线缝合腹膜壁，并且用外科缝钉闭合切口。此后，在饮用水中提供镇痛(卡洛芬5mg/kg体重)，持续3天。监测小鼠的体重，身体状况评分(BCS)定义为：BCS 1差(thin)-骨骼结构突出和椎体突出，BCS 2状况不足(Under-conditioned)-脊柱明显但不突出的分割，BCS 3状况良好-没有椎骨，触诊不明显，以及临床症状，并在ID8注射后13周宰杀。在尸检时，记录每只小鼠的总体扩散和肿瘤负荷(肿瘤结节的数量，记录并拍照结节沉淀物的位点)，从腹膜排出腹水用于体积测量和细胞计数，和收获的组织(脾脏、膈膜、腹膜壁、肠系膜脂肪、女性生殖道)用于体重测量和免疫组织化学分析。

腹膜内(散播的)卵巢癌模型

在这些实验中使用雌性(6至8周龄)C57BL/6野生型(Ifn^+/+)小鼠。使用30号针头向小鼠腹膜内注射5x10⁶个ID8细胞。监测小鼠的体重、BCS和临床体征，并在ID8注射后8周宰杀。在尸检时，记录每只小鼠的总体扩散和肿瘤负荷(肿瘤结节的数量，记录并拍照的结节沉淀物的位点)，从腹膜排出腹水用于体积测量和细胞计数，和收获的组织(脾脏、膈膜、腹膜壁、肠系膜脂肪、女性生殖道)用于体重测量和免疫组织化学分析。

腹膜内重组IFN疗法

在腹膜内ID8细胞注射后3天开始IFN处理。小鼠接受重组鼠Ifn，该Ifn以2–500IU/注射的剂量每周腹膜内注射3次，或500IU/注射的Ifnβ，或载体，持续8周。在尸检时，收集直生的“原发性”肿瘤以及转移(膈膜和腹膜)、脾脏、腹水(体积和细胞计数)和腹膜灌洗，并对样品称重、拍照并加工用于免疫组织化学分析。

重组IFN生产

小鼠

mulFNε的生产和纯化

如其他地方所描述，进行包含IFN基因和杆状病毒的重组杆粒的产生和PCR筛选。简言之，扩增PCR阳性菌落(colony)，并根据制造商的说明书(Qiagen)使用EndoFree Maxi-Prep试剂盒分离重组杆粒。通过将纯化的杆粒转染到Sf9昆虫细胞中产生重组杆状病毒，并产生高滴度的杆状病毒。IFN表达为可溶性蛋白质并分泌到培养基中。

昆虫细胞表达上清液通过所描述的离心澄清，补充终浓度为1mM的苯基甲磺酰氟(PMSF)，然后使用12.5kDa截止透析管(Sigma-Aldrich)对TBS(10mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH 8.0)在4℃下透析过夜。通过0.8μm注射器驱动的过滤器(Sartorius)过滤透析液来除去颗粒。根据制造商的说明书(Thermo Scientific)，通过将10mg抗-IFN抗体与1mlAminoLink Plus树脂偶联，制备抗-IFN单克隆抗体亲和柱。将滤液施加到该柱上，并且然后用5倍柱体积(CV)的TBS洗涤柱以除去非特异性结合的蛋白质，并用0.5MV级分中的pH 3.0的0.1M甘氨酸洗脱rIFN。收集的级分立即用pH8.0的1M Tris-HCl的1/10^th CV中和，并通过加入10x TBS(100mM Tris-HCl，1.5M NaCl，pH8.0)进行缓冲液交换。进一步用10％v/v甘油补充通过在280nm处的吸光度确定的包含级分的蛋白质。随后使用包含10％v/v甘油的TBSpH8.0，通过在与AKTAPrimePlus(GE Healthcare)连接的S75 10/30尺寸排阻柱(GEHealthcare)上凝胶过滤进一步纯化该纯化的IFN。将纯化的级分过滤灭菌并在4℃下储存或在液氮中快速冷冻，用于在-80℃下长期储存。

人

使用细菌系统生产huIFNε

从大肠杆菌BL21(DE3)中的pET-28a表达载体(Novagen)表达人IFN(无标记的天然187个残基序列)。将新转化细胞的单个菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的L-肉汤中。培养物在37℃下生长过夜，同时以250rpm持续振荡。在16小时后，用包含50μg/mL卡那霉素的新鲜L-肉汤将细胞培养物稀释50倍。当用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞时，将混合物在37℃下振荡温育直至光密度(OD600)达到0.6-0.8。使细胞生长3小时，然后通过在5000g下离心收获，持续15分钟。将细胞沉淀在-20℃冷冻直至进一步使用。

可以通过优化的密码子表达来增强鼠和人IFNε的产生。实例显示于SEQ ID NO：28至32中。密码子优化也可用于取代、添加或删除氨基酸以增强IFNε活性和/或稳定性，比如血清半衰期。

包涵体的制备

将冷冻的细胞在室温下解冻30分钟。将每克细胞沉淀用加入10mM二硫苏糖醇(DTT)、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5％w/v完全Mini蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche)的10mL BugBuster Master Mix(Merck Millipore)重悬，并且在室温下温育2小时，伴随温和搅拌。将裂解物在30000g下离心20分钟，并倾析上清液。然后使用不同的缓冲液(每克IB为70mL)洗涤包涵体(IB)多次，所有缓冲液均包含10mM DTT和5mM EDTA：(1)1:10稀释的BμgBusterMasterMix(含MilliQ水)，(2)pH 8.0的10mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液，其包含150mM NaCl和2M尿素，(3)pH 8.0的10mM Tris缓冲液，其包含150mM NaCl和5％v/vTriton X-100。在30000g的离心20分钟之后均进行洗涤以除去上清液。此后，用pH 8.0的10mM Tris和150mM NaCl(每克IB 70mL)洗涤IB两次，以除去产物中的EDTA。然后在恒定搅拌下使用含有pH7.4的6M盐酸胍(Gdn-HCl),100mM Na₂HPO₄和10mM Tris的缓冲液在冷室中溶解IB，过夜。将得到的混合物在30000g下离心20分钟，并将溶液0.2μm过滤。

huIFNε的重折叠

将DTT以5mM的浓度加入变性的huIFN溶液中，并将混合物在室温(25℃)下在温和搅拌下温育2小时。此后，将混合物冷却至4℃，然后在4℃下将其逐滴加入50体积的重折叠缓冲液(pH 7.4的20mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，0.8M L-精氨酸(L-Arg)和10μM CuSO4)中，伴随温和搅拌，并使重折叠进行16小时。

蛋白质纯化

将EDTA以5mM浓度加入重折叠混合物中，并且在在4℃下使用Vivaspin 200切向流过滤器(MWCO 10kDa)和Vivaspin 20浓缩器(MWCO 10kDa)浓缩之前将重折叠溶液的pH调节至pH 6.0。然后使用凝胶过滤(HiLoad 16/60Superdex 200)在1.0mL/min的流速下用包含150mM NaCl和0.8M L-Arg作为运行缓冲液的pH 6.0的20mM磷酸盐缓冲液纯化样品。合并包含huIFN的级分(fraction)，并向其中加入1mL的阴离子交换树脂(琼脂糖凝胶快速流(QSepharose fast flow))。将混合物在4℃下温育18小时，伴随不断搅拌。然后收集流出物(flow)并使用Vivaspin 20浓缩器浓缩。

凝胶电泳和蛋白质印迹

使用Bolt Bis-Tris以及4-12％梯度凝胶(Life Technologies)和Bolt MOPS SDS运行缓冲液(Life Technologies)在165V下进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹，持续50分钟。对于SDS-PAGE分析，将凝胶用考马斯蓝色溶液(0.25％w/v考马斯蓝R-250，50％v/v甲醇和10％v/v乙酸)染色2小时，然后用包含40％v/v乙醇和10％v/v乙酸的溶液脱色。对于蛋白质印迹，使用Bolt转移缓冲液(LifeTechnologies)在30V下将蛋白质条带转移至止动剂(Immobilon)-FL聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，持续45分钟。在室温下将膜在Odyssey封闭缓冲液(PBS)[LI-COR Biosciences]中温育1小时。倾析缓冲液，并且将以1:500稀释的兔多克隆抗huIFN抗体(Novus Biological)加到膜上，并在4℃下温育16小时。此后，除去抗体溶液，并用包含0.1％v/v Tween 20的pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤膜三次。将以1:1000稀释的IR染料800缀合的(Rockland)抗兔IgG(H&L)(GOAT)抗体加到膜上并在室温下温育1小时。如先前一样用包含0.1％v/v Tween20的pH 7.4的PBS洗涤膜。使用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences)使用700和800通道进行蛋白质印迹分析。

内毒素测试

使用鲎阿米巴样细胞裂解物(LAL)测试来测试样品中的内毒素水平。测试系统和试剂购自Charles River。首先用LAL试剂水以1:10稀释蛋白质样品，并且然后用内毒素特异性缓冲液以1:10进一步稀释。然后将样品加载到LAL柱(cartridge)上(对于纯样品，灵敏度为0.05至5EU/mL)并使用Endosafe-PTS来记录吸光度。

圆二色性

在包含500mM NaCl、5mM EDTA和10％v/v甘油的pH 6.0的20mM磷酸盐缓冲液中制备人IFN样品。圆二色性(CD)实验在25℃下在配备有珀耳帖(Peltier)温控水循环器的Jasco J-810光谱仪上进行。使用1mm路径长度的石英池测量范围从190至250nm的光谱，累积周期为3次试验，1nm带宽，0.1nm数据间距和1s数据积分时间。使用Jasco SpectraManager分析数据。

通过与已知活性的hIFN蛋白的连续稀释液进行比较来确定huIFN样品的生物活性(IU/ml)。

使用该系统的重折叠的huIFN的比活性(IU/mg)与从抗病毒保护测定(保护WISH细胞免受EMCV感染)获得的结果一致，并确认：该重折叠的蛋白质具有生物活性；并且huIFN的比活性与昆虫细胞表达系统中表达的muIFN具有相似的数量级(表3)。

表3

通过病毒保护测定或报告细胞系确定的小鼠和人干扰素ε蛋白的比活性(IU/mg)的比较

<u>干扰素</u>	<u>方法</u>	<u>比活性(IU/mg)</u>
			muIFN	抗病毒保护测定(L929细胞和SFV)	2.1x 10<sup>5</sup>
huIFN	抗病毒保护测定(WISH细胞和EMCV)	1.12x 10<sup>4</sup>
			huIFN	报告细胞系(HEK-蓝色[商标])	5.26x 10<sup>4</sup>

该报道细胞系的使用为确定huIFN的生物活性提供了简便且经济的测定，并且应简化能够中和该活性的单克隆抗体的鉴定。

最终的IFN制剂在以下缓冲液中，该缓冲液在体内和体外实验中用作“载体对照”：包含150mM NaCl和0.8M L-Arg作为运行缓冲液的pH 6.0的20mM磷酸盐缓冲液。

实施例1

IFNε在卵巢癌中的作用

评估用重组IFNε处理小鼠和人肿瘤二者来源的细胞系的效果，并比较其与常规I型IFN的效果。

研究的小鼠细胞系是用于体内实验的鼠卵巢上皮细胞系ID8(实施例2)，以便实现体外与体内抗肿瘤作用的比较。

还研究了IFNε对各种人卵巢癌细胞系的效果。许多人细胞系用于体外研究卵巢癌，包括OVCAR4和CAOV3细胞。这些表示被分类为代表根据与肿瘤样品的系统基因组比较在高度遗传上与人HGSC相似的高级浆液性卵巢癌(HGSC)的细胞系(Domcke等(2013)NatureCommunications 4:2126)。所使用的每种细胞系都证明了HGSC的基本分子特征，包括大部分基因组改变、通用TP53突变以及蛋白质编码区中的其他体细胞突变(如果有的话)，并且因此表示用于在体外研究人卵巢癌的一些最合适的模型。

实施例2

IFNε诱导鼠卵巢癌ID8细胞系的抗肿瘤作用

目的是使用ID8细胞系来表征IFNε在卵巢癌的鼠模型中的体内抗肿瘤作用。最初，重要的是确认该细胞确实可以应答I型IFN，包括IFNε。在定量三种充分表征的IFN调节基因(IRG)——cxcl10、isg15和ifit1之前，用不同剂量的重组鼠IFNε或IFNβ体外刺激ID8细胞持续3小时(图1)。IFNε以剂量依赖性方式显著诱导所有三种IRG的表达，与IFNβ类似(以IU/ml计)，因此确认这些细胞可以对IFNε响应。

已经确认ID8细胞可以对IFNε响应，接下来研究的是IFNε是否可以调节IRG编码蛋白的表达，以及其在肿瘤相关特性、细胞增殖和凋亡中的作用。结果发现，用1000IU/ml的IFNε处理ID8细胞可显著下调bcl-2、ccne1和cdc20的表达，其编码具有抗凋亡(bcl-2)和促增殖功能(ccne1，cdc20)的蛋白质(图2)。相反，IFNε显著诱导IRGs tap1和casp1的表达，其为编码促凋亡蛋白的基因。因此，这些数据表明IFNε调节基因参与细胞周期、增殖和凋亡。

接下来使用Xcelligence(注册商标)实时细胞分析(RTCA)系统(AceaBiosciences)评估IFNε对ID8细胞的增殖的影响，其允许实时、无标记地监测细胞增殖。因此，可能基于每30分钟孔中细胞的阻抗读数来监测用IFNε处理的ID8细胞的增殖。随着细胞增殖，阻抗读数(细胞指数)增加。如图2明显可见，用IFNε(图3A)或IFNβ(图3B)处理后的细胞指数存在剂量依赖性差异。

从该软件中，这种降低可以使用两个不同的量度来量化细胞增殖：(i)细胞的倍增时间；(ii)指示生长速率的细胞生长曲线的斜率。发现IFNε处理以剂量依赖性方式增加ID8细胞的倍增时间，与对于IFNβ所观察到的相似(图4A和4B)。还观察到用IFNε或IFNβ处理后ID8细胞的生长曲线的斜率下降(图4C)。因此，IFNε处理可以显著抑制鼠卵巢癌细胞系的增殖。

已经观察到IFNε处理可以减少ID8细胞系的增殖，接下来分析了对细胞迁移的影响，作为IFNε如何影响肿瘤细胞转移的指示。为此，使用荧光细胞染料(CellTrace(商标)CSFE,ThermoFisher Scientific)在划痕测定期间染色和跟踪ID8细胞迁移。使用这种分析方法，ID8细胞的迁移百分比是基于当ID8细胞在12小时内从融合体迁移到开放空间时“划痕”的闭合计算的。发现用IFNε处理细胞持续12小时可以显著降低ID8细胞的划痕闭合(或迁移)百分比，从而表明IFNε影响ID8细胞运动的肿瘤相关体外活性，这将暗示这些细胞的转移潜力(图5)。

由于观察到IFNε抑制ID8细胞增殖、运动和迁移，接下来评估的是IFNε是否可以诱导ID8细胞的凋亡。为此，将处理细胞的膜联蛋白/PI染色结合FACS分析使用以鉴定垂死细胞是否经历早期或晚期细胞凋亡或坏死。发现，IFNε处理使测定中的活细胞数量减少了大约40％，并且当进一步分析时发现这些细胞处于早期和晚期凋亡中，如通过仅膜联蛋白V以及膜联蛋白V和PI二者的细胞染色阳性分别指示。重要的是，在评估任何剂量的IFNε时未观察到坏死。在图6中总结了来自该FACS分析的数据。

实施例3

IFNε在卵巢癌发展中的调节异常：患者样品

使用卵巢癌患者样品中的免疫组织化学在健康患者与卵巢癌患者中测定IFNε表达。将组织切片格式化为组织微阵列(TMA)以最小化染色之间的实验误差。通过染色来自获得的健康输卵管对照样品并产生对照组织块的切片以沿着卵巢癌患者一侧染色来开始IHC分析。发现IFNε在健康输卵管的上皮细胞中高度表达。作为对照，上皮细胞用细胞角蛋白18染色，并且下层基质细胞用平滑肌肌动蛋白(SMA)染色。

健康对照输卵管的这些切片用于产生每块包含高达8个样品的对照块，用于沿着侧卵巢癌患者活组织切片TMA并排同时染色。这些TMA包含来自106名患者的高级浆液性癌、低级浆液性癌、良性增生和边界上皮细胞的活组织切片。发现与对照良性上皮相比，浆液性癌样品中IFNε的表达显著受到抑制(图7)。

实施例4

IFNε在卵巢癌发展和治疗益处中的作用：小鼠模型

研究了内源性IFNε在卵巢癌的肿瘤发生中的作用。

将ID8细胞注射到C57BL/6野生型和Ifnε缺陷小鼠的左侧卵巢囊中。在注射后13周，这些小鼠在与腹膜壁、膈膜、脾脏和肠系膜上的转移性沉淀物相关的腹膜中形成大的直生肿瘤和特征出血性腹水。重要的是，这种疾病传播模型是晚期人类卵巢癌进展和转移的特征。在13周时，这些小鼠已经发展为晚期疾病，并且随后发现这时在WT和Ifn^-/-小鼠之间的原发性肿瘤大小没有差异(图8)。相反，在Ifnε缺陷小鼠中观察到更晚期的散播性疾病的趋势，包括脾肿大(图8B)、腹水量(图8C)、转移性腹膜沉淀物的数量(图8D)和排出的腹水中的红细胞(图8E)。收集原发性肿瘤和转移性沉淀物用于免疫组织化学分析。苏木精和伊红染色表明混合的腺体形态，其具有散布的成纤维细胞样细胞和脂肪组织以及向膈膜和脾脏中的侵入。这使用多重免疫细胞组进一步分析。

实施例5

在散播性卵巢癌模型中来自重组IFNε疗法的附加数据

IFNε在人卵巢癌细胞中诱导抗肿瘤作用

因为已经表明IFNε对鼠卵巢癌细胞系具有强烈的抗肿瘤作用，接下来评估其对人卵巢细胞系的作用。如上所表明，选择CaOV3和OVCAR4细胞，因为这些代表HGSC。

首先，确认这些细胞系对I型IFN刺激有反应。用重组人IFNε处理CaOV3和OVCAR4细胞。在刺激3小时后测量IRG诱导。发现尽管在不同细胞系中观察到不同的IRG诱导，但是两种细胞系都对I型IFN刺激有反应。

接下来使用xCELLigence RTCA系统来确定IFNε刺激是否改变人卵巢癌细胞系的增殖。发现用IFNε处理的人卵巢癌细胞具有总体显著较低的细胞指数图，具有增加的倍增时间并且其生长曲线的斜率显著较低。该分析表明IFNε处理降低了人卵巢癌细胞系的增殖。在CaOV3和OVCAR4中证明了IFNε的这种抗增殖作用。

腹膜内重组IFNε疗法在健康小鼠中的免疫调节作用

通过腹膜内注射用重组鼠IFNε或IFNβ(500IU/剂量)处理健康的C57BL/6野生型小鼠(6至8周龄)，每周三次，持续8周。通过腹膜灌洗在PBS中收集腹膜渗出液细胞，并使用流式细胞术分析免疫细胞群体。发现IFNε疗法显著调节已知在抗癌免疫以及其活化状态中重要的免疫细胞群体，包括CD8⁺T细胞(图9A)、CD4⁺T细胞的活化(图9B)、炎性单核细胞(图9C)和CD4⁺T细胞上的PD1表达(图9D)。

腹膜内重组IFNε疗法在散播性卵巢癌模型中的效力

对于准确概括转移性扩散(膈膜、腹膜壁和肠系膜)恶性腹水发展，脾肿大和人卵巢癌贫血的晚期散播性卵巢癌模型，使用腹膜内ID8小鼠模型。将ID8细胞(每只小鼠5×10⁶个细胞)腹膜内注射至C57BL/6野生型小鼠(6至8周龄)。在注射后3天，小鼠开始腹膜内重组IFNε或IFNβ疗法(500IU/剂量，每周三次)，持续8周。发现用IFNε处理的小鼠与PBS对照小鼠或用IFNβ处理的小鼠相比，在肠系膜中显著降低了肿瘤扩散以及更少的腹膜和膈膜沉淀物。

还发现用IFNε处理的小鼠具有显著减少的腹水发展(图10A)，以及较少的可检测的腹水肿瘤细胞(图10B)和减少的红细胞含量(图10C)，表明疾病不是太晚期。这与在这些小鼠的腹水中可检测到的抑制的炎性细胞因子水平相关，特别是已知促进该疾病中的血管生成的MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)[图11]。图12提供了关于散播性卵巢癌模型中IFNε对腹膜免疫细胞调节区域的数据。

结果显示在图13至15中。

图13

图13A显示，到第8周时，该模型已经充分进展到弥漫性肿瘤发展(如通过增重和宰杀小鼠所显示)以及腹膜液的出血，然而，该时间点刚好在晚期腹水发展之前捕获小鼠。与指示腹水发展很少的没有荷瘤的对照相比，治疗组均没有显示出显著的增重差异。然而，除了高剂量IFNε之外，每个治疗组与其自身对照相比趋于显著。另外，在荷瘤的治疗组之间可以看到显著差异，显示用500IU IFNε治疗的小鼠中最低量的疾病发展。

图13B，在最后2周(第6周至第8周)中可以看到明显更陡的曲线。该时间点表示刚好在晚期腹水发展之前疾病的进展。在此期间，只有用高剂量IFNε处理的小鼠的生长速度未表明与没有荷瘤的对照组相比更陡的生长速率。

图13C，在整个治疗组中荷瘤的小鼠均没有显示出显著差异，然而，除了用高剂量IFNε治疗的小鼠之外，所有治疗组与其没有荷瘤的对照相比具有显著更大的胸围。这种趋势在一定程度上通过排出的腹水量反映。

图13D显示了在8周的实验终点处从每只小鼠的腹膜腔排出的腹水量。用高剂量IFNε处理的小鼠构成唯一具有显著减少的腹水发展的治疗组(个体Mann-Whitney测试)和唯一具有尚未显现腹水的荷瘤小鼠的治疗组。所有其他荷瘤小鼠已经开始显现腹水，其中由低剂量IFNε组记录的体积(～3.5ml)最大。在8周时，这些小鼠仍处于腹水发展的早期阶段。

图14

评估肿瘤和IFN治疗对体重的影响，以及贫血症的几种评估(爪子苍白、红细胞计数和腹水中的出血等级)。仅高剂量IFNε对爪子苍白和RBC计数具有显著影响。

图15

图15A显示在整个肠系膜中肿瘤发展和扩散的程度0至4(0-无疾病，1-非常少的明显疾病，在探测时有一些小的肿瘤沉淀物，2-明显的肿瘤但是主要局限于一种沉淀物，3-在脾脏附近发展的大的肿瘤结节，在整个肠系膜中的一些沉淀物，4-在脾脏附近延伸到整个肠系膜的数量太多而无法统计的大肿瘤结节)。用高剂量IFNε处理的小鼠是患有存在于肠系膜区域中的显著较少的疾病的唯一治疗组。

图15B，用高剂量IFNε处理的小鼠具有最少的腹膜结节。

图15C，用高剂量IFNε处理的小鼠具有最少的膈膜结节，然而，PBS对照小鼠中的一些变异性阻止了该组的显著性。

图15D，肝脏结节不像其他部位(腹膜、膈膜)那样可检测到，然而，在用高剂量IFNε处理的小鼠中仍然存在减少的趋势。

图15E是该模型的早期时间点，在该时间点肿瘤没有机会成功地粘附和定植二级位点。在第二个模型(其试验持续10周，伴有大量的腹水发展)中没有检测到球状体。因为这种球状体可以作为该模型中不太晚期疾病的标志物。在目前的模型中，由于在8周时的合理晚期(然而，仍然比上次更早)而检测到极少数的这些结节，并且虽然不显著，但是用高剂量IFNε处理的小鼠显示出非附着的球状体的最高患病率。这也许是IFNε如何预防这种疾病进展的另一个指标。

图15F给出了一些肿瘤沉淀物的不同尺寸，测量每只小鼠的最大单个肿瘤结节的表面积尺寸以确定这是否仍然反映朝向IFNε破坏肿瘤生长的趋势。尽管在PBS对照中存在一些变异性(p＝0.06，高剂量IFNε)，但是与低剂量IFNε相比，高剂量IFNε显著减少了大结节，这表明肿瘤生长的剂量减少。

实施例6

在高级浆液性卵巢癌中，输卵管上皮IFNε的表达减少与预后不良相关

为了进一步鉴定IFN在卵巢癌中的潜在作用，其内源性在包含分泌性上皮细胞(SEC)的人输卵管(FT)上皮细胞中表征，分泌性上皮细胞是许多HGSC的假定起源细胞(Kurman,and Shih(2011)Human pathology 42:918-931)。使用免疫组织化学，发明人显示在显然包括SEC的所有上皮细胞中的IFNε表达。这种表达模式类似于上皮标记物——细胞角蛋白18的表达模式，并且与主要对非上皮组织染色的平滑肌肌动蛋白(SMa)形成对比。通过分析用于表达IFN的人FT分泌细胞和初级FT上皮细胞的转录组数据集来确认这种表达，这表明IFN是在这些细胞中高度且组成型表达的唯一IFN。

与正常FT上皮相比，IFN的这种组成型表达在人HGSC中被显著抑制。这通过染色IFN的组织微阵列证明，其显示在低级浆液性癌(LGSC)和HGSC中定性和定量地抑制表达。其次，本发明人发现在来自93名患者的HGSC样品的澳大利亚卵巢癌研究队列(Patch等(2015)Nature 521:489-494)中显著更低的IFN转录物水平。在正常和肿瘤上皮中基本上不可检测到其他I型IFN比如IFN。第三，发明人通过分析来自可公开获得的癌症科学研究所新加坡卵巢癌数据库(Tan等(2015)Oncotarget 6:43843-43852)的外部队列的707个卵巢癌和非肿瘤组织样品的微阵列数据来验证这些发现。这些分析确认了IFNε在FT上皮细胞中的表达及其在HGSC中的损失。

为了确定IFN表达是否对临床结果有影响，查询了关于93个病例的HGSC AOCS同龄组和707个病例的CSIOVDB同龄组中的临床存活数据。确定高IFN表达HGSC与两个同龄组中增加的无进展和总体存活相关。总之，这些证明IFN是在正常上皮细胞中组成型表达、在卵巢癌中受到抑制的独特的I型IFN，其中较低水平与不良预后相关。

实施例7

IFN在卵巢癌的同基因原位模型中具有有效的抗肿瘤作用

由于上述数据意味着IFNε具有抗肿瘤特性，并且在没有任何先前研究证明此的情况下，本发明人研究了卵巢癌的体内、同基因、原位模型中的IFNε活性(参见实施例4)。将鼠卵巢癌细胞ID8注射到免疫活性小鼠的卵巢中的囊内空间中(Greenaway等(2008)Gynecologic oncology 108:385-394)。该模型能够评估IFN经由肿瘤细胞内在和外在(免疫调节)机制对黏液囊中“原发性”原位肿瘤生长以及在腹膜腔中转移性扩散和生长的不同阶段和位置的直接和间接抗肿瘤作用。

用腹膜内注射重组鼠(rmu)IFN的治疗以剂量依赖性方式显著抑制腹膜转移瘤的生长。这在恶性出血性腹水的发展中首先显而易见——这是在紧密模拟人类疾病的进展的模型中末期疾病的一个关键特征。其次，IFN显著减少整个腹膜腔内的转移性肿瘤沉淀物，该沉淀物定量为肠系膜肿瘤负荷评分和整个腹膜的转移总数。第三，IFN还减少了腹膜腔内的出血，这是晚期疾病的另一个指示。有趣的是，尽管肿瘤扩散明显减少，但是IFN对原位、原发性肿瘤生长几乎没有影响，其中原发性肿瘤的大小或体重仅略有下降，但没有达到显著性。这些结果构成IFN明显具有抗肿瘤作用的首次证明，并且这些是针对卵巢癌转移的。

由于常规的I型IFN可以经由免疫细胞募集和激活发挥其抗肿瘤作用，因此在该模型中研究了这些参数的IFNε诱导。与没有荷瘤的小鼠(NT)相比，荷瘤小鼠的总的白细胞、CD4⁺、CD8⁺和B淋巴细胞以及NK细胞的数量和比例增加。“原发性”和转移性肿瘤负荷的所有参数与免疫细胞应答的手动相关性强调该免疫原性肿瘤模型触发宿主防御，其特征在于与模型中的疾病进展强烈相关的升高水平的免疫细胞。至关重要的是，虽然总免疫细胞数量更多地反映了疾病的存在，而不是治疗组之间的差异，但是用IFN治疗的小鼠具有显著更高比例的激活的免疫细胞和检查点分子的表达，这通过在CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞和B细胞上CD69和PD-1的诱导来证明。实际上，IFNε对疾病的抑制与某些细胞类型的激活有关，包括CD4⁺CD69⁺PD1⁺T细胞和B220⁺CD69⁺B细胞。这些结果表明肿瘤引发显著的免疫细胞募集，但是除非通过IFNε处理激活，否则这些免疫细胞似乎不能有效清除肿瘤负荷。因此，本发明人首次证明，新的I型IFNε在体内具有有效的抗肿瘤和免疫激活活性。

为了证明IFNε在更临床相关的设备(setting)中的抗肿瘤作用，本发明人研究了其对已建立的肿瘤的活性，并将活性与常规的I型IFN，IFN比较。值得注意的是，将起始IFN治疗延迟4周(以允许形成更多已建立的原位肿瘤)并未降低IFN的整体效力。从肠系膜肿瘤负荷，腹膜出血和整体转移评分可以明显看出，延迟起始的IFN疗法抑制了卵巢癌的腹膜扩散；但是在抑制原位‘原发性’肿瘤发展上是无效的。相反，接受延迟起始的IFN疗法的小鼠没有表现出降低的原发性或腹膜肿瘤负荷。引人注目的是，在激活大多数腹膜免疫群、诱导CD69和/或检查点分子、CD4⁺和CD8⁺T细胞和B细胞上的PD1时，IFN处理也比IFN显著更有效，而两种IFN均显著激活NK细胞。

因此，IFNε表明对发展中的和已建立的卵巢癌的腹膜扩散的抗肿瘤活性，比IFN的等效单位的抗肿瘤活性更强；并且此外，IFNε激活包括CD4和CD8T细胞和NK细胞的免疫细胞以及检查点标志物的表达。

实施例8

IFNε抑制晚期卵巢癌模型中的腹水和转移

由于绝大多数HGSC作为晚期转移性疾病存在，因此通过将ID8细胞直接注射到腹膜中，在概括该晚期疾病的模型中评估外源性IFN治疗的效力。小鼠在整个腹膜中展现大量的散播性肿瘤生长，其中肿瘤结节在多个器官上粘附和生长模仿人类中的卵巢癌特征性扩散到比如腹膜壁、整个肠系膜和膈膜以及出血性恶性腹水。用IFN治疗显著抑制了该模型中的腹膜肿瘤散播，以及肠系膜中减少的肿瘤生长，和粘附至膈膜和腹膜壁的减少的肿瘤结节。另外，IFN处理的小鼠显示减少的恶性腹水发展，由此腹膜液的体积减少，出血明显减少，并且包含较少的循环上皮肿瘤细胞。IFNε治疗导致较低水平的炎性细胞因子水平，例如趋化因子MCP1(CCL2)。引人注目的是，通过任何措施施用IFN对腹水肿瘤生长没有影响。

本发明人发现，在该晚期肿瘤模型中，总的免疫细胞比如白细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞与腹膜内(i/p)注射卵巢肿瘤细胞的小鼠中晚期疾病的存在相关，但是这些总数(population)在治疗组之间没有差异。然而，IFN处理显著增加了以CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD25或CD69和PD1诱导为代表的这些小鼠的腹膜中的激活的CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例，这与整体肿瘤负荷和腹水发展的减少相关。

实施例9

内源性和外源性IFN在体内调节免疫细胞

上述结果一起证明IFN维持针对卵巢癌的发展、建立和晚期模型的腹膜扩散的效力，然而针对IFNε未与IFN共享的作用机制是未知的。由于常规的I型IFN可以直接在肿瘤细胞上或经由免疫细胞间接地发挥抗肿瘤作用，本发明人试图将IFN的迄今未知的、内在的、体内免疫调节作用限定为独立于肿瘤的存在，但是在腹膜腔中卵巢癌转移位点。IFN处理不调节CD4⁺T细胞数量，并且仅显示CD8⁺CD4^-细胞的小的但是显著的增加，但是确实激活PD1、CD69和CD25的CD4细胞表达。IFN处理还增加了总的腹膜白细胞、炎性巨噬细胞和树突细胞。

接下来通过比较WT和IFNε-/-小鼠来确定内源性IFNε是否调节腹膜中的免疫细胞，其可以影响在该位点的肿瘤发展。虽然腹膜白细胞或总的T细胞的数量没有显著差异，但是与WT小鼠相比在IFN^-/-中存在较少的NK细胞，这与上述数据一致。此外，存在增加水平的包括NK的激活细胞和表达CD69和或PD1的CD4T细胞，该水平在IFNε缺陷型小鼠中较低。这些结果显示，内源性IFNε维持适用于免疫监视的某些腹膜免疫细胞的水平和活化状态。

实施例10

内源性IFNε抑制卵巢癌转移

通过比较WT和IFN^-/-小鼠中的原位肿瘤发展和散播，研究内源性IFN是否在肿瘤发生中起作用。在ID8植入后13周，IFN^-/-小鼠在整个腹膜腔中显现腹膜出血和腹水积聚，大的结节性原位肿瘤和多个转移性肿瘤沉淀物。引人注目的是，肿瘤细胞在没有内源性IFN的情况下更容易在整个腹膜中散播，如通过所有三个量度的增加的腹膜转移所显示，而WT和IFN^-/-小鼠的“原发性”原位肿瘤生长相似，如通过相似的卵巢重量所显示。为了深入了解这种内源性IFN在早期肿瘤发展中的作用，本发明人比较了在ID8植入后6周小鼠的肿瘤负荷，此时，IFN^-/-小鼠显现出相对小的、较少的结节性原位肿瘤。然而，虽然本发明人显示在早期阶段的WT和IFN-/-小鼠之间的原发性肿瘤重量没有显著差异，但是已经证明IFN^-/-小鼠中肿瘤散播和转移性生长的增加，如通过腹膜壁上增加的肿瘤转移和腹膜腔中发现的总的转移所测量的。

在肿瘤植入后6周，与其没有荷瘤的(NT)基因型对照相比，IFN^-/-小鼠具有增加数量的总的白细胞、CD4和CD8淋巴细胞，在WT小鼠中未见该增加。数据表明，肿瘤的存在加上来自内源性IFNε的抑制信号的缺失的组合导致增加的肿瘤生长。重要的是，IFN^-/-小鼠的激活免疫细胞的比例显著低于WT小鼠，如通过包括CD69和PD1的CD4和CD8 T细胞表达的标志物所证明的。这些数据表明尽管不存在在肿瘤细胞植入位点缺失内源性IFN的显著影响，但是内源性IFN信号传导确实影响免疫细胞的激活状态并抑制肿瘤引发的免疫细胞流入。内源性IFN信号传导所赋予的这些差异对肿瘤细胞在整个腹膜中散播并在腹膜组织上建立宏观转移的能力具有显著影响。

实施例11

区分IFNε对腹膜转移的直接和间接抗肿瘤作用

为了进一步剖析外源性和内源性IFN在卵巢癌模型中的作用机制，发明人表征了缺乏IFNAR1的小鼠(Ifnar1^-/-小鼠)中的肿瘤发展，其中免疫细胞不能对I型IFN响应。在ID8注射后8周，Ifnar1^-/-小鼠在整个肠系膜中显示特征性腹膜出血、腹水积聚和结节性肿瘤沉淀物并粘附到腹膜壁上。相对于WT小鼠，在荷瘤的Ifnar1^-/-小鼠中存在几种更晚期疾病的指示，特别是更大量的上皮腹膜肿瘤细胞、总的腹膜白细胞、CD4和CD8细胞。此外，腹水量和腹膜出血也有增加的趋势。

重要的是，外源性IFNε显著抑制Ifnar1^-/-小鼠中的整体肿瘤转移负荷。与先前的数据一致，激活的细胞比如CD69阳性CD4细胞和B220阳性细胞的比例未受影响，表明这是IFNε的直接作用。相比之下，外源性IFNε仍然减少了Ifnar1^-/-小鼠中CD4、CD8细胞的数量，表明这种作用经由肿瘤细胞(唯一存在的IFN应答细胞)发生——与上面产生的显示外源性IFNε对抗肿瘤免疫细胞的水平的间接免疫调节作用的数据一致。

总之，这些结果表明，首先，可能经由IFNε的IFNAR1的内源性IFN信号传导抑制肿瘤发展。其次，外源性IFN处理的抗肿瘤效力在Ifnar1缺陷型小鼠中仍然是明显的，表明该IFN对肿瘤细胞的直接作用。

实施例12

IFNε调节卵巢癌细胞的内在抗肿瘤活性

虽然在该模型中IFN驱动的肿瘤抑制机制被认为是经由直接的肿瘤内在机制，但是这些尚未确认这种IFN。因此，发明人试图在小鼠卵巢癌细胞系ID8中限定体外IFN的直接抗肿瘤作用的所有组成成分(repertoire)。用rmuIFNε处理ID8细胞显著调节参与癌症相关生物途径的基因表达，包括免疫应答，PDL1，Tap1；细胞死亡，Casp1和Bcl-2；细胞周期，Ccne1和Cdc20和趋化性，Cxcl10。重组muIFN表现出剂量依赖性抗增殖作用，如通过使用xCELLigence测量的降低的生长速率和延长的倍增时间所显示，其使用MTT测定进一步确认。另外，如通过增加的膜联蛋白V/PI染色所证明的，rmuIFN诱导这些细胞中增加的细胞凋亡。总之，结果表明鼠卵巢癌细胞通过经典IFN信号传导途径对重组IFN的直接刺激作出反应，IFN信号传导途径包括诱导参与癌症相关途径的IRG。这类途径的调节也与功能测定相关，这表明IFN在体外具有包括抗增殖和促凋亡作用的内在的抗癌特性，因此可能是它的体内作用机制中的一种，与上面提到的来自Ifnar缺陷型小鼠的结果一致。

为了强化来自小鼠模型的这些适应症与人卵巢癌相关，并且考虑到IFNε在患有卵巢癌的女性中肿瘤抑制作用的有力临床适应症，并且在没有关于这种相对新的细胞因子的抗肿瘤特性的公开数据的情况下，本发明人测试了其对人卵巢癌细胞系的直接抗肿瘤作用。重组人IFN(rhIFN)用于两种人卵巢癌细胞系CaOV3和OVCAR4，先前显示为代表人HGSC(Domcke等(2013)同上)。首先，发明人显示这些细胞对rhIFN刺激直接作出反应，这引起经典IRG比如ISG15和IFIT1的剂量依赖性诱导，IFN也是如此。因此，由于这些数据显示rhIFN表现出经典的I型IFN信号传导，本发明人使用功能测定确定了抗肿瘤作用。结果表明，rhIFN调节细胞增殖，并且直接抑制人卵巢癌细胞的生长。通过倍增时间测量，IFN在48小时和72小时内对两种细胞系均具有显著的剂量依赖性抗增殖作用。这些结果表明，IFN可通过调节肿瘤细胞内在途径来延长HGSC的存活，如临床前动物模型中所指示的。

实施例13

实施例1至12的总结

干扰素ε(IFNε)是一种I型IFN，其由I型IFN簇——其经由常规的IFNAR受体信号传导——中的基因编码、独特调节并且在保护女性生殖道(FRT)免于感染方面是重要的。

IFNε在抑制卵巢癌的作用的上下文是独特的。它不同于传统的I型IFN(，等，其已被确认在卵巢癌治疗中不成功并且在目前的研究中是无效的)，其为典型的急性期蛋白质，由危险信号诱导并且瞬时表达有效又避免由于过度或持续存在而潜在的毒性。IFN是组成型的并且不断地在FRT上皮细胞中表达，不受危险信号调节，而是受激素和其他“发展”因素的调节。发明人在实施例1至12中结合人和临床前动物模型首次证明了IFNε抑制癌症，并且特别是高级浆液性卵巢癌(HGSC)。

获得IFNε参与这些癌症的证据显示：

(1)IFNε在输卵管上皮中HGSC起源的假定细胞中表达；

(2)IFNε表达在HGSC中降低；

(3)与不良预后相关的降低的IFNε表达。

同基因的、原位鼠模型用于限定免疫活性小鼠中的IFNε抗肿瘤作用，并使遗传方法能够表征作用机制，并通过小鼠和人卵巢癌细胞系的研究得到补充，表明：

(4)IFNε在IFNε-/-小鼠中的损失导致增加的肿瘤发展；

(5)机械地，使用IFNAR1缺陷小鼠，本发明人显示IFNε直接作用于肿瘤细胞并且体外研究显示IFNε抑制增殖，诱导细胞凋亡和诱导免疫调节表面分子比如PDL1和趋化因子表达；

(6)IFNε在抑制腹膜转移方面是特别有效的(患有这种疾病的妇女中的主要问题)；

(7)对发展、建立和晚期癌症的抗肿瘤作用(治疗潜力)；

(8)IFNε调节腹膜免疫细胞激活和PDL1的表达(因此与免疫疗法组合)

因此，发明人证明这种不同的IFN对于抑制卵巢癌进展具有先前未知的作用。它降低的表达水平与预后不良相关，并表明IFNε疗法的病例，通过临床前模型研究确认其潜力，在该临床前模型研究中IFNε抑制伴有发展、建立和晚期腹膜转移的癌症。IFNε的独特性质使其适合用作FRT癌症的内源性抑制剂的目的。此外，IFNε对肿瘤细胞PDL1的诱导表明其在结合检查点抑制的联合疗法中具有潜力。

实施例14

重组鼠人(rm)IFNε和人(hu)IFNε的表达和生理化学表征

为了表征IFN的物理化学和生物学特性，必须阐明该蛋白质的信号肽在何处被切割以产生成熟的分泌蛋白质，与先前表征的I型IFN的情况相同。Ifne1基因在CMV启动子的控制下表达，并瞬时转染到HEK293细胞中。发现来自这些细胞的上清液包含通过SDS PAGE检测到的约20kDa的蛋白质，并用抗-IFN单克隆抗体免疫印迹。来自这些上清液的IFN的免疫沉淀导致在考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE上在～20kDa处可见条带，当用同种型对照抗体进行免疫沉淀时未见到该条带。该20kDa蛋白质的氨基末端测序鉴定了6个氨基酸残基'LEPKRI(SEQ ID NO:33)'，代表rmIFN蛋白的残基22-27(登记号NP_796322)。该结果表明，成熟的IFN多肽始于已公布的rmIFN序列的亮氨酸22(登记号NP_796322)，并且因此成熟的蛋白具有20,006Da的理论分子量(Gasteiger等(2003)Nucleic Acids Res 31:3784-3788)。

对于物理化学和生物学表征，rmIFN在杆状病毒表达系统中产生，并使用与抗-IFN单克隆抗体偶联的免疫亲和层析柱纯化(Stifter等(2014)同上)。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析纯化的蛋白质揭示存在对于rmIFN(～20kDa)预期大小的蛋白质，该蛋白质用抗IFN抗体(克隆H3)检测。对纯化的蛋白质进行圆二色(CD)光谱分析以证明总的蛋白质折叠。平均残基椭圆率(MRE)在208和222nm处显示最小值，这是-螺旋蛋白比如IFN和IFN的剖面特征。这些数据表明，从昆虫细胞培养物中表达和纯化的～20kDa蛋白质具有其他I型IFN典型的-螺旋折叠。

对于表面等离子体共振(SPR)，分别从如前所述的哺乳动物细胞和昆虫细胞培养物中表达和纯化mIFNAR1-ECD和rmIFN(Stifter等(2014)Protein Expr Purif 94:7-14)；从同样如前所述的哺乳动物细胞培养物中表达并纯化mIFNAR2-ECDC94S和rmIFN1(deWeerd等(2013)同上)。huIFNε以类似的方式生产。使用HTG芯片用于His-标记的蛋白质和TBS作为运行缓冲液，所有SPR实验均在ProteOn XPR36(Bio-Rad Labs)上进行。在TBS中稀释至25μg/mL后，经由His-标记将mIFNAR1-ECD和mIFNAR2-ECDC94S固定在镍激活的芯片。将所有IFN(rmIFN1、rmIFN和rmIFN)在TBS中稀释至40nM至2μM的各种浓度。所有数据根据制造商的说明书(Bio-Rad)参考并使用Langmuir结合模型进行分析。只有当制造商的说明书(Bio-Rad)的Chi2值(测量值和拟合值之间的误差量度)小于R_max的10％时，才考虑将数据包括在分析中。通过ProteOn Manager软件计算Ka(1/Ms)、Kd(1/s)和KD(nM)，并且表示为来自至少三个平行实验的平均值(±SD)。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较测试确定显著性。

SPR用于评估rmIFN与mIFNAR1和/或mIFNAR2的细胞外结构域(ECD)的重组形式的相互作用的动力学，并且将结果与用其他I型IFN：rmIFN1或rmIFN获得的结果进行比较。结果揭示，rmIFN与mIFNAR2-ECD的结合亲和力低于rmIFN1。RmIFNα1-mIFNAR2-ECD相互作用的亲和力是1.68(+0.91)nM(10个独立实验的平均值)，与先前公布的研究相似(Jaitin等(2006)Mol Cell Biol 26:1888-1897)，而在rmIFN浓度高达2M时，mIFNε-mIFNAR2-ECD相互作用是无法测量的。这些浓度表明rmIFN与该受体的亲和力比rmIFN1低>1,000倍。由于rmIFN与mIFNAR1-ECD的亲和力高于rmIFN1(de Weerd等(2013)Nat Immunol 14:901-907,Jaks et al.(2007)J Mol Biol 366:525-539)，发明人比较rmIFN-mIFNAR1-ECD与rmIFN-mIFNAR1-ECD相互作用的结合亲和力。对于IFNAR1-ECD，测量rmIFN的亲和力为556±239nM(n＝9个独立实验)，并且与2.45±1.41nM的rmIFN-IFNAR1-ECD相互作用相比低约200倍(n＝10个独立实验)。

结果表明，与其他I型IFN相比，rmIFN对IFNAR1和IFNAR2表现出较低的亲和力。在受体结合后，IFN信号传导的早期步骤是信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白的激活，该蛋白质进入细胞核以结合干扰素调节基因(IRG)的启动子中的干扰素刺激的应答元件(ISRE)。因此，本发明人研究了rmIFN是否会诱导STAT1的激活以及STAT1是否会结合ISRE-和IRG启动子驱动的信号转导报告子。

试图确定rmIFN是否像其他I型IFN一样激活STAT1。在用低至3pmol/ml的rmIFN刺激RAW264.7细胞后，酪氨酸残基701上的STAT1磷酸化是明显的，并且发现在0.1pmol/ml下以剂量依赖性方式增加rmIFN诱导的STAT1磷酸化，该剂量低于rmIFN 30倍。为了研究rmIFN和rmIFN之间STAT1激活的动力学是否不同，在用10pmol/ml IFN干扰刺激后5、15、30、60和120分钟取样。在rmIFN刺激后5分钟就发生STAT1磷酸化，刺激后15-30分钟达到峰值，在60-120分钟后降低。类似地，rmIFNβ刺激在处理后5分钟导致峰值STAT1磷酸化，并且发现在120分钟后如先前公布的那样降低(Darnell(1997)Science 277:1630-1635)。这些结果证明rmIFN可以诱导STAT1的快速活化，尽管需要更高的剂量来实现与用rmIFN刺激所见到的相似水平的激活。

本文呈现的数据显示IFNε对IFNAR2受体的亲和力低，但对IFNAR1受体的亲和力较高。rhuIFNε在大肠杆菌中产生并重折叠。全长hIFN_[1-190]表达为来自大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体(IB)。裂解细菌细胞，并通过离心分离IB。然后使用包含Triton X-100和尿素的各种缓冲液彻底洗涤IB。此后，将IB溶解在包含胍-HCl的缓冲液中。使用金属催化的空气氧化方法将变性蛋白质重折叠成可溶形式。随后，使用凝胶过滤纯化hIFN。使用表达huIFNε的大肠杆菌，还采用微量热泳(MST)来测定IFNε对hIFNAR2的亲和力。与huIFNβ为0.25+/-0.04nM相比，亲和力确定为8,187±839nM。这表明高度的huIFNε活性。这是重要的，因为可以施用减少量的huIFNε以降低使用IFNβ的毒性。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的公开内容易于进行变化和修改。应该理解，本公开内容考虑了所有这些变化和修改。本公开内容还实现了本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物单独地或共同地，以及任何两个或更多个步骤或特征或组合物或化合物的任何和所有组合。

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