一种纯化重组人干扰素-κ的方法和试剂盒
阅读说明：本技术 一种纯化重组人干扰素-κ的方法和试剂盒 (Method and kit for purifying recombinant human interferon-kappa ) 是由 彭继先 李振森 晁香君 吴桂苹 韩景花 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种纯化重组人干扰素-κ(rhIFN-κ)的方法和试剂盒。所述方法包括：1)将含rhIFN-κ的复性稀释液进行阴离子交换层析,收集流穿液；2)将步骤1)获得的流穿液进行阳离子交换层析,收集洗脱液；3)稀释步骤2)的洗脱液；和4)将步骤3)的稀释液进行阳离子交换层析。本发明的分离纯化方法采用三步层析进行分离,纯化步骤少,避免重组人干扰素-κ聚集,提高蛋白收率,纯度高达93％以上,且成本低、操作简单、可重复性高,适合工业化生产。(The invention discloses a method and a kit for purifying recombinant human interferon-kappa (rhIFN-kappa). The method comprises the following steps: 1) carrying out anion exchange chromatography on the renaturation diluent containing the rhIFN-kappa, and collecting flow-through liquid; 2) carrying out cation exchange chromatography on the flow-through liquid obtained in the step 1), and collecting eluent; 3) diluting the eluate of step 2); and 4) subjecting the dilution of step 3) to cation exchange chromatography. The separation and purification method provided by the invention adopts three-step chromatography for separation, has few purification steps, avoids recombinant human interferon-kappa aggregation, improves the protein yield, has the purity of over 93%, and is low in cost, simple to operate, high in repeatability and suitable for industrial production.)
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种重组人干扰素-κ(recombinedhuman interferon-kappa，rhIFN-κ)的分离纯化方法，特别涉及使用强阴离子和强阳离子交换介质纯化rhIFN-κ的方法。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的由单核细胞和免疫细胞产生的细胞因子，其可以激活自然杀伤细胞，且通过结合靶细胞上的同源受体而发挥抗病毒的活性。干扰素通常分为I型干扰素和II型干扰素，I型干扰素包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω，II型干扰素包括IFN-γ。这些不同类型的干扰素分别由不同的基因编码产生，且具有不同的生物学活性。目前，已经许多研究致力于进一步改善IFN-α、IFN-β和IFN-γ的分离纯化。例如，CN102219848B公开了一种重组人干扰素β-1a的纯化方法，其采用亲和层析、强阴离子交换层析和弱阳离子交换层析法获得高纯度的重组人干扰素β-1a；CN1259336C公开了一种复合干扰素的纯化方法，其透析和阳离子交换层析，实现了复性中间体和完全复性的蛋白基本分开且获得高纯度的蛋白产品；CN101928341B公开了一种分离重组人干扰素α-1b异构体的纯化工艺及其检测方法，其采用QHP层析和pH梯度洗脱把目的蛋白与其他相关的蛋白质分离开来；CN1229389C公开了利用免疫磁性分离技术分离重组干扰素，其采用免疫磁性微球和磁性分离装置对发酵菌体裂解液进行了分离纯化。CN103014101A提供了一种干扰素的纯化方法，该专利采用C18高效液相柱层析柱进行纯化干扰素，该方法后期放大成本较高，同时利用反相层析时，用有机试剂进行洗脱环保压力大，不易放大到生产上。因此，目前并不存在一种通用的适合各种类型干扰素分离纯化的方法。
干扰素卡帕(IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，其与IFN-α和IFN-β共同使用一个受体蛋白，都属于I型干扰素。IFN-κ能够活化干扰素刺激基因，抑制脑心肌炎病毒(ECMV)和人类乳头瘤病毒(HPV)的复制。编码IFN-κ的基因选择性地在上皮角蛋白细胞中表达，重组hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，也可以用于保护细胞免于病毒的感染且表达具有种族特异性。
目前，有关IFN-κ的研究文献非常少，涉及IFN-κ具体制备技术的研究更为罕见，尤其是工业化生产方面的技术方案。从IFN-κ氨基酸组成序列分析，可知IFN-κ蛋白疏水性较高，在水相系统中容易发生聚合失活；IFN-κ氨基酸序列中含有5个巯基，其中C1-C3及C2-C4形成两对二硫键，构成IFN-κ生物活性所必须的立体结构。有研究采用有机溶媒--正丁醇进行萃取的方法来分离IFN-κ蛋白，虽然解决了IFN-κ疏水易聚合的问题，但IFN-κ的两对二硫键无法正确形成，其立体结构无法正确折叠形成，其生物活性必然受到影响。因此，研究一种合适的IFN-κ的分离纯化方法尤为重要。
为了克服现有技术的不足，在本发明中，通过全在水相中操作的三步纯化(强阴离子交换层析-强阳离子交换层析-强阳离子交换层析)的方法，避免了有机溶剂的使用，从而减小后期的再处理压力，以简单的操作步骤实现了rhIFN-κ的有效分离和纯化。
发明内容
本发明的一个目的在于采用三步纯化(强阴离子交换层析-强阳离子交换层析-强阳离子交换层析)方式，提供了一种简单可行的、适合于工业化生产的rhIFN-κ的分离和纯化方法。
本发明的另一个目的在于通过合理搭配各种水相为基础的提取溶液，避免使用大量有机溶剂，提供了一种避免后期废弃有机溶剂再处理过程产生的成本和压力的环保型rhIFN-κ的分离和纯化方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种纯化重组人干扰素-κ(rhIFN-κ)的方法，包括以下步骤：
1)将含rhIFN-κ的复性稀释液进行阴离子交换层析，收集流穿液；
2)将步骤1)获得的流穿液进行阳离子交换层析，收集洗脱液；
3)稀释步骤2)获得的洗脱液；
4)将步骤3)获得的稀释液进行阳离子交换层析。
在一个具体的实施方式中，在上述方法中，所述步骤1)中的阴离子交换层析为强阴离子交换层析且所述将步骤2)和4)中的阳离子交换层析为强离子交换层析。
在一个具体的实施方式中，在上述方法中，含rhIFN-κ的复性稀释液可以是通过任意常规方法得到的含rhIFN-κ的复性稀释液。
在一个具体的实施方式中，含rhIFN-κ的复性稀释液通过以下获得：培养含有编码hIFN-κ的基因的宿主细胞、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或乳糖诱导表达、离心收集菌体、高压均质破碎细胞、离心收集包涵体、变性、复性和稀释得到。优选地，宿主细胞是大肠杆菌细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)细胞。优选地，所述变性利用含有高浓度尿素或盐酸胍的变性液进行变性。优选地，所述复性利用含有EDTA和Trition X-100的复性缓冲液进行，更优选地，复性缓冲液为1-30mM Tris，1-20mM磷酸二氢钠，20-100mM NaCl，0.2-0.6mM氧化型还原剂，0-3mM EDTA，0.05-0.2％TritionX-100，PH 7.0-8.5。优选地，所述氧化型还原剂选自氧化型谷胱甘肽和氧化型半胱氨酸中的一种或多种。
优选地，所述编码hIFN-κ的基因是在原核生物细胞中高效表达的编码hIFN-κ的基因。优选地，所述编码hIFN-κ的基因具有编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的密码子优化的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。优选地，所述编码hIFN-κ的基因是在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中高效表达的编码hIFN-κ的基因，且具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
优选地，所述编码hIFN-κ的基因是在原核生物细胞中高效表达的编码hIFN-κ突变体的基因。优选地，所述hIFN-κ突变体是将hIFN-κ的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位的半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)，或者突变为与丝氨酸结构相近的甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。更优选地，所述hIFN-κ突变体是将hIFN-κ的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位的半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)。与含有野生型hIFN-κ序列的菌株相比，含有所述突变体序列的质粒的菌株表达产生的hIFN-κ产量较高，与干扰素-κ受体结合的亲和力更高，体外活性也更好。
在一个具体的实施方式中，编码hIFN-κ基因的制备包括以下步骤：
根据hIFN-κ的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，其中，hIFN-κ的氨基酸序列如下所示：
MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:1)。
其中适用于大肠杆菌BL21(DE3)的密码子优化原则是：(1)对稀有密码子较为集中的区域进行整体优化，以达到最佳的优化效果；(2)调整富含AT和GC的区域，使序列的GC含量适宜；(3)在设计基因时不全部采用大肠杆菌BL21的最优密码子，仅是部分采用偏好密码子。
hIFN-κ表达序列密码子优化后的基因序列如下所示：
ATGCTGGATTGTAATCTGCTGAATGTGCATCTGCGTCGTGTGACCTGGCAGAATCTGCGTCATCTGAGCAGCATGAGCAATAGCTTTCCGGTTGAATGTCTGCGCGAGAATATTGCCTTTGAACTGCCGCAGGAATTTCTGCAGTATACCCAGCCGATGAAACGCGATATTAAGAAAGCCTTCTATGAAATGAGCCTGCAGGCATTTAATATCTTTAGCCAGCATACCTTTAAGTATTGGAAAGAACGTCATCTGAAACAGATTCAGATTGGCCTGGATCAGCAGGCAGAATATCTGAATCAGTGTCTGGAAGAAGATAAGAATGAGAATGAAGATATGAAGGAAATGAAGGAGAATGAAATGAAACCGAGCGAAGCACGCGTTCCGCAGCTGAGCAGTCTGGAACTGCGTCGCTATTTCCATCGTATTGATAATTTCCTGAAGGAGAAGAAATACAGCGATTGTGCCTGGGAAATTGTTCGCGTTGAAATTCGTCGCTGTCTGTATTATTTCTATAAATTTACCGCCCTGTTCCGCCGCAAATAA(SEQ ID NO:2)。
上述优化后的基因序列例如由上海近岸科技有限公司合成。
在一个具体的实施方式中，将制备的优化后的hIFN-κ基因序列与质粒pET30a合成pET30a-hIFN-k表达载体，将其转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中，转化后在感受态细胞中加入LB培养基(不含卡那霉素)37℃后培养1h，然后将其涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养。挑取阳性克隆，扩大培养，提取质粒，进行XhoⅠ-ApaⅠ双酶切验证，结果表明大片段约4500bp，小片段约为1500bp，酶切结果与预期相符。对测序正确的克隆菌株进行-80℃低温保存。
在一个具体的实施方式中，将制备的单克隆菌株进行复苏，接种至LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、去离子水1L)中，37℃培养过夜，并将培养液以1‰的接种量转接至摇瓶中，37℃培养至OD600为0.6-1.2时，加入终浓度为0.4-1.2mM的IPTG 37℃诱导3h进行诱导表达。将诱导完成的菌液离心收集菌体，超声破碎离心，将阳性菌株(BL21(DE3)-hIFNk)进行保种并于-80℃冰箱保存，待用于后续的复性和纯化。
其中，所述步骤1)的阴离子交换层析采用的交换介质为季铵基为配基的离子交换介质；优选地，所述步骤1)的阴离子交换层析采用的交换介质为选自Q Bestarose FF、DEAEBestarose Fast Flow、Q sepharose FF、UNOsphere Q、Q Bestarose XL和Mono Q中的任一种；更优选地，所述步骤1)的阴离子交换层析采用的交换介质为Q BestaroseFF。
其中，所述步骤2)和步骤4)的阳离子交换层析采用的交换介质为磺酸基为配基的离子交换介质；优选地，所述步骤2)和步骤4)的阳离子交换层析采用的交换介质为选自SPBestarose HP、SP BestaroseFF、SP Bestarose XL、SP Sepharose XL和CM BestaroseFast Flow、中的任一种；更优选地，所述步骤2)和步骤4)的阳离子交换层析采用的交换介质为SP Bestarose HP。
不拘于理论的限制，在本发明中，阴离子交换层析是指阴离子交换剂的电荷基团(配基)带正电，而反离子带负电，反离子可与溶液中的阴离子或带负电荷的化合物进行交换反应。阳离子交换是指阳离子交换剂的电荷基团(配基)带负电，而反离子带正电，反离子可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。在一定pH条件下，根据蛋白质所带电荷的不同，离子交换剂上的可交换离子(即反离子)与溶液中被分离的离子吸附结合，从而实现分离。其中，与离子交换介质无结合能力或结合能力弱的蛋白质被洗脱下来，而亲和力强的蛋白被结合在柱上。
在本发明中，阴离子交换层析采用的交换介质为季铵基为配基的离子交换介质。季铵基是一种强碱性基团，其水中解离出OH-而成强碱性，在洗脱时，OH-与溶液中的阴离子进行交换使得其被吸附在介质上。强阴离子型交换介质适用的范围较广，在酸性环境下都能够进行反应。阳离子交换层析采用的交换介质为磺酸基为配基的离子交换介质，磺酸基为强酸性基团，其在溶液中容易离解出H+，故呈强酸性，在洗脱时，H+与溶液中的阳离子进行交换使得溶液中的阳离子被SO3－吸附结合，从而实现H+与溶液中的阳离子互相交换。强酸性阳离子交换树脂的离解能力非常强，在酸性或碱性条件下均能离解并产生离子交换作用。
在上述方法中，在步骤3)中，将步骤2)获得的洗脱液以1：(0.5～10)的比例用缓冲液稀释；优选地，将步骤2)获得的洗脱液以1：(2～8)的比例用缓冲液稀释；更优选地，将步骤2)获得的洗脱液以1：(4～6)的比例用缓冲液稀释。通过该稀释步骤，使得经过第一次阳离子交换后的洗脱液中的各种离子含量缓慢适量降低，避免目标蛋白因离子强度变化太大，引起蛋白凝集，从而在下一步的阳离子交换层析中实现洗脱液中不需要的阳离子尽可能多地被SO3－吸附结合，而目的蛋白被更好地分离出来。
在上述方法中，在步骤2)中使用缓冲液B、缓冲液C和NaCl水溶液进行洗脱，在步骤4)中使用缓冲液E、缓冲液F和NaCl水溶液进行洗脱，其中，所述缓冲液B、缓冲液C、缓冲液E和缓冲液F各不相同。
其中，所述缓冲液B和C分别为以磷酸缓冲液(PB)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)和NaCl为主要成分的溶液；所述缓冲液D、E和F分别为以磷酸缓冲液(PB)、Tween-20和NaCl为主要成分的溶液。
其中，在所述步骤1)之前，将经常规方法发酵培养的包涵体变性和复性得到的复性液用缓冲液G稀释，调节pH5.0～8.5，过滤，收集滤液。
具体地，一种纯化重组人干扰素-κ(rhIFN-κ)的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：将经常规方法发酵培养的包涵体变性和复性得到的复性液用缓冲液G稀释，调节pH5.0～8.5，过滤，收集滤液；
(2)阴离子交换层析：使用缓冲液A平衡阴离子层析柱，将步骤(1)的滤液上样，收集流穿液；
(3)阳离子交换层析：使用缓冲液A平衡阳离子层析柱，将步骤(2)的流穿液上样，再次用缓冲液A和缓冲液B平衡阳离子层析柱，用缓冲液B、缓冲液C和NaCl水溶液进行洗脱，收集洗脱液；
(4)稀释：将步骤(3)的洗脱液用缓冲液G稀释，调节pH5.0～8.5，得到稀释液；
(5)阳离子交换层析：使用缓冲液A平衡阳离子层析柱，将步骤(4)的稀释液上样，依次用缓冲液D和缓冲液E平衡阳离子层析柱，用缓冲液E、缓冲液F和NaCl水溶液进行洗脱，收集洗脱液。
在一个具体的实施方式中，所述步骤(1)包括：培养含有编码hIFN-κ的基因的宿主细胞后，IPTG或乳糖诱导表达、离心收集菌体、高压均质破碎细胞、离心收集包涵体、变性、复性和用缓冲液G稀释。优选地，所述编码hIFN-κ的基因具有经过适应于宿主细胞密码子优化的序列。优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。更优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)细胞。优选地，所述变性利用含有高浓度尿素或盐酸胍的变性液进行变性。优选地，所述复性利用含有EDTA和Trition X-100的复性缓冲液进行，更优选地，复性缓冲液为1-30mM Tris，1-20mM磷酸二氢钠，20-100mM NaCl，0.2-0.6mM氧化型还原剂，0-3mMEDTA，0.05-0.2％TritionX-100，PH 7.0-8.5。优选地，所述氧化型还原剂选自氧化型谷胱甘肽和氧化型半胱氨酸中的一种或多种。
在一些优选实施方案中，缓冲液A、B、C含有PB、TritonX-100和NaCl；缓冲液D、E、F含有PB、Tween-20和NaCl；缓冲液G含有PB和TritonX-100，但不含有NaCl和Tween-20。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液A为包含10-30mM PB、0.05-0.25％(体积比)TritonX-100和40-60mM NaCl的溶液，pH 4.0-6.8。优选地，所述缓冲液A为包含15-25mMPB、0.1-0.2％TritonX-100和45-55mM NaCl的溶液，pH 4.5-6.5。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液B为包含10-30mM PB、0.05-0.25％(体积比)TritonX-100和800-1200mM NaCl的溶液，pH7-9。优选地，所述缓冲液B为包含15-25mMPB、0.1-0.2％(体积比)TritonX-100和900-1100mM NaCl的溶液，pH7.5-8.5。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液C为包含10-30mM PB、0.05-0.25％(体积比)TritonX-100和40-60mM NaCl的溶液，pH 7-9。优选地，所述缓冲液C为包含15-25mM PB、0.1-0.2％TritonX-100和45-55mM NaCl的溶液，pH 7.5-8.5。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液D为包含10-30mM PB、0.05-0.25％Tween-20和40-60mM NaCl的溶液，pH4.0-6.8。优选地，所述缓冲液D为包含15-25mM PB、0.1-0.2％Tween-20和45-55mM NaCl的溶液，pH 4.5-6.5。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液E为包含10-30mM PB、0.05-0.25％Tween-20和40-60mM NaCl的溶液，pH7-9。优选地，所述缓冲液E为包含15-25mM PB、0.1-0.2％Tween-20和45-55mM NaCl的溶液，pH7.5-8.5。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液F为包含10-30mM PB、0.05-0.25％Tween-20和800-1200mM NaCl的溶液，pH7-9。优选地，所述缓冲液F为包含15-25mMPB、0.1-0.2％Tween-20和900-1100mM NaCl的溶液，pH7.5-8.5。
在一个具体的实施方式中，所述缓冲液G为包含10-30mM PB和0.05-0.25％TritonX-100的溶液pH 6-7.5。优选地，所述缓冲液G为包含15-25mM PB和0.1-0.2％TritonX-100的溶液，pH6.5-7.0。
在本发明中，使用几种组成不同且pH范围差异的缓冲液，通过改变pH，使溶液中离子的解离度降低，电荷减少，因而对交换剂的亲和力减弱从而被洗脱下来。通过使用缓冲液浓度和pH的特定组合，使离子交换剂的洗脱能力持续增强，从而实现目的蛋白的有效分离。
其中，所述步骤(2)的阴离子交换层析采用的交换介质为Q BestaroseFF。
其中，所述步骤(3)和步骤(5)的阳离子交换层析采用的交换介质为SP BestaroseHP。
其中，在步骤(1)中，复性液和缓冲液G的体积比为1：(0.5～5)。
其中，在步骤(2)中，以150～250cm/h的流速进行上样。
其中，在步骤(2)中，目标蛋白rhIFN-κ不挂柱。
其中，在步骤(3)中，以150～250cm/h的流速进行上样；且以40-80cm/h的流速依次利用缓冲液B、缓冲液C和50-500mM NaCl水溶液洗脱。
其中，在步骤(3)中，洗脱液收集条件设置如下：5％缓冲液B～20％缓冲液B，5min；选择280nm作为检测波长，当紫外吸收值升至180mAU时开始收集洗脱液，当紫外吸收值降至230mAU时停止收集。
其中，在步骤(4)中，洗脱液和缓冲液G的体积比为1：(0.5～10)。
其中，在步骤(5)中，样品收集条件设置为：0％缓冲液F～47％缓冲液F，3-10min；选择280nm作为检测波长，当紫外吸收值升至180mAU时开始收集洗脱液，当紫外吸收值降至200mAU时停止收集，所得产物为纯化的干扰素-κ。
具体地，一种纯化rhIFN-κ的方法，包括以下步骤：
(1)样品预处理：
培养含有编码hIFN-κ的基因的宿主细胞、IPTG或乳糖诱导表达、离心收集菌体、高压均质破碎细胞、离心收集包涵体、变性和复性，得到复性液，以复性液和缓冲液G的体积比为1：(0.5～5)的比例，用缓冲液G稀释，调节pH：5.0～8.5，电导率：2～10ms/cm，滤膜过滤，收集滤液；
(2)强阴离子交换层析：
①Q Bestarose FF柱预处理：用缓冲液A平衡层析柱5～10CV，当流出液电导率为7.0～8.5ms/cm时，停止平衡；
②上样：将步骤(1)获得的滤液以流速150～250cm/h进行上样；
③柱平衡：用缓冲液A冲洗层析柱3-8CV，使得目标蛋白在该条件下不挂柱，表现为流穿，收集流穿液；
(3)强阳离子交换层析：
①SP Bestarose HP柱预处理：用缓冲液A平衡层析柱5～10CV，当流出液电导率为7.0～8.5ms/cm时，停止平衡；
②上样：将步骤(2)的流穿液以流速150～250cm/h进行上样；
③柱平衡：用缓冲液A平衡冲洗3-8CV，再用缓冲液B平衡冲洗2-8CV；
④洗脱：以40-80cm/h的流速依次利用缓冲液B、缓冲液C和50-200mM NaCl水溶液洗脱；
⑤收集洗脱液：将系统设置为：5％缓冲液B～20％缓冲液B，5min；选择280nm作为检测波长，当紫外吸收值升至180mAU时开始收集洗脱液，当紫外吸收值降至230mAU时停止收集；
(4)稀释：将步骤(3)的洗脱液以洗脱液和缓冲液G的体积比为1：(0.5～10)的比例用缓冲液G稀释，调节pH为5.0～8.5和电导率：2～10ms/cm，得到稀释液；
(5)强阳离子交换层析：
①SP Bestarose HP柱预处理：用缓冲液A平衡层析柱5～10CV，当流出液电导率为7.0～8.5ms/cm时，停止平衡；
②上样：将步骤(4)的稀释液以流速150～250cm/h进行上样；
③柱平衡：用缓冲液D平衡冲洗3-8CV，再用缓冲液E平衡冲洗2-8CV；
④洗脱：以40-80cm/h的流速依次用缓冲液E、缓冲液F和50-500mM NaCl水溶液进行洗脱；
⑤收集洗脱液：将系统设置为：0％缓冲液F～47％缓冲液F，3-10min；选择280nm作为检测波长，当紫外吸收值升至180mAU时开始收集洗脱液，当紫外吸收值降至200mAU时停止收集，所得产物为纯化的干扰素-κ。
一种根据本发明的分离提纯方法所述的方法制备的重组人干扰素-κ(rhIFN-κ)。
一种用于实施上述方法的试剂盒，包括：进行阴离子交换层析的强阴离子交换介质和进行阳离子交换层析的强阳离子交换介质。
其中，所述强阴离子交换介质为季铵基为配基的离子交换介质；且所述强阳离子交换介质为磺酸基为配基的离子交换介质。
本发明的试剂盒在制备或纯化干扰素中的用途。
在所述用途中，所述干扰素为干扰素-κ；优选地，所述干扰素为人干扰素-κ；更优选地，所述干扰素为重组人干扰素-κ。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明采用全水相的纯化分离方法，克服了rhIFN-κ极易聚合成多聚体的缺陷，且在整个分离过程中不存在有机溶剂的使用，其极大地降低了整个纯化工艺后期的环保压力和成本，从而显著地降低了hIFN-κ分离纯化的总成本。
(2)与现有技术相比，本发明的分离纯化工艺采用强阴离子和强阳离子两种层析柱填料进行分离，纯化步骤少，提高rhIFN-κ的收率，纯度达93％以上。
(3)本发明采用阴离子交换树脂和两步阳离子交换树脂三步纯化，很好地避免干扰素-κ多聚体的形成，分离纯化方法成本低、操作简单、可重复性高，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明的重组人干扰素-κ的分离纯化方法的示意性流程图。
图2为经过本发明的方法分离的重组人干扰素-κ的HPLC图谱。
图3为经过本发明的方法分离的重组人干扰素-κ的SDS-PAGE电泳胶图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，本领域技术人员将知晓，所描述的实施例仅是出于举例的目的，而不是本发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员将更好地理解和掌握本发明所要求保护的技术方案及其实现的技术效果。
在下面的具体实施例中，除了特殊制备的试剂外，其余试剂皆是可商购的试剂。
(一)rhIFN-κ蛋白的分离纯化
实施例1
按照图1所示的分离纯化流程，进行本发明的分离纯化的各个步骤。
实验材料：
Q Bestarose FF(Q-FF)柱：博格隆(上海)生物技术有限公司；SP Bestarose HP(SP-HP)柱：博格隆(上海)生物技术有限公司；Butyl Sepharose HP(GE Healthcare)柱：上海玉博生物科技有限公司。
仪器：蛋白纯化仪AKTAPure。
在下面各个过程中使用的各种缓冲液，具体如下所示：
缓冲液A：20mM PB，0.1％TritonX-100和50mM NaCl，pH6.5；
缓冲液B：20mM PB、0.1％TritonX-100和1000mM NaCl，pH7.5；
缓冲液C：20mM PB、0.1％TritonX-100和50mM NaCl，pH7.5；
缓冲液D：20mM PB、0.1％Tween-20和50mM NaCl，pH6.5；
缓冲液E：20mM PB、0.1％Tween-20和50mM NaCl，pH7.5；
缓冲液F：20mM PB、0.1％Tween-20和1000mM NaCl，pH7.5；
缓冲液G：20mM PB，0.1％TritonX-100，pH6.5。
具体操作步骤包括：
(1)样品预处理：
培养含有编码hIFN-κ的基因的大肠杆菌细胞、IPTG诱导表达、离心收集菌体、高压均质破碎细胞、离心收集包涵体、8M尿素变性和复性缓冲液复性，得到复性液，以复性液和缓冲液G的体积比为1：2的比例用缓冲液G稀释，调节pH 6.5，电导率为5ms/cm，0.45μm滤膜过滤，收集滤液；其中，所述复性缓冲液为20mM Tris，10mM磷酸二氢钠，50mM NaCl，0.4mM氧化型谷胱甘肽，2mM EDTA，0.1％TritionX-100，PH 7.0。
(2)强阴离子交换层析：
①Q Bestarose FF(Q-FF)柱预处理：用缓冲液A平衡层析柱8CV，当流出液电导率为7.5ms/cm时，停止平衡，层析柱预处理结束；
②上样：将步骤(1)获得的滤液以流速200cm/h进行上样；
③柱平衡：用缓冲液A冲洗层析柱5CV，使得目标蛋白在该条件下不挂柱，表现为流穿，收集流穿液；
(3)强阳离子交换层析：
①SP Bestarose HP(SP-HP)柱预处理：用缓冲液A平衡层析柱8CV，当流出液电导率为7.5ms/cm时，停止平衡，层析柱预处理结束；
②上样：将步骤(2)的流穿液以流速200cm/h进行上样；
③柱平衡：用缓冲液A平衡冲洗5CV，再用缓冲液B平衡冲洗3CV；
④洗脱：以60cm/h的流速依次利用缓冲液B、缓冲液C和100mM NaCl水溶液洗脱；
⑤收集洗脱液：将系统设置为：5％缓冲液B～20％缓冲液B，5min；选择280nm作为检测波长，当紫外吸收值升至180mAU时开始收集洗脱液，当紫外吸收值降至230mAU时停止收集；
(4)稀释：将步骤(3)收集到的洗脱液以其和缓冲液G的体积比为1：5的比例用缓冲液G稀释得到稀释液，调节pH为7.0和电导率5ms/cm，备用；
(5)强阳离子交换层析：
①SP Bestarose HP柱预处理：用缓冲液A平衡层析柱8CV，当流出液电导率为8ms/cm时，停止平衡，层析柱预处理结束；
②上样：将步骤(4)的稀释液以流速200cm/h进行上样；
③柱平衡：用缓冲液D平衡冲洗5CV，再用缓冲液E平衡冲洗3CV；
④洗脱：以60cm/h的流速依次用缓冲液E、缓冲液F和300mM NaCl水溶液进行洗脱；
⑤收集洗脱液：将系统设置为：0％缓冲液F～47％缓冲液F，5min；选择280nm作为检测波长，当紫外吸收值升至180mAU时开始收集洗脱液，当紫外吸收值降至200mAU时停止收集，所得产物为纯化的干扰素-κ。
实施例2
将实施例1中的缓冲液A-G分别替换为如下的缓冲液：
缓冲液A：10mM PB、0.05％TritonX-100和50mM NaCl，pH4.0；
缓冲液B：10mM PB、0.1％TritonX-100和800mM NaCl，pH7.0；
缓冲液C：10mM PB、0.25％TritonX-100和40mM NaCl，pH8.0；
缓冲液D：10mM PB、0.05％Tween-20和40mM NaCl，pH4.0；
缓冲液E：10mM PB、0.1％Tween-20和40mM NaCl，pH7.0；
缓冲液F：10mM PB、0.25％Tween-20和800mM NaCl，pH8.0；
缓冲液G：10mM PB、0.05％TritonX-100，pH6.0。
其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
实施例3
将实施例1中的缓冲液A-G分别替换为如下的缓冲液：
缓冲液A：30mM PB，0.25％TritonX-100和60mM NaCl，pH6.8；
缓冲液B：30mM PB、0.25％TritonX-100和1200mM NaCl，pH9.0；
缓冲液C：30mM PB、0.25％TritonX-100和60mM NaCl，pH9.0；
缓冲液D：30mM PB、0.25％Tween-20和60mM NaCl，pH6.8；
缓冲液E：30mM PB、0.25％Tween-20和60mM NaCl，pH9.0；
缓冲液F：30mM PB、0.25％Tween-20和1200mM NaCl，pH9.0；
缓冲液G：30mM PB、0.25％TritonX-100，pH7.5。
其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
实施例4
将实施例1中的操作步骤(2)的强阴离子交换层析柱Q Bestarose FF替换为弱阴离子交换层析柱DEAE Bestarose Fast Flow(即DEAE Bestarose FF)，且将实施例1中的操作步骤(3)和(5)中的强阳离子交换层析柱SP Bestarose HP替换为弱阳离子交换层析柱CMBestarose Fast Flow(即CMBestarose FF)，其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
实施例5
将实施例1中的操作步骤(2)的强阴离子交换层析柱Q Bestarose FF替换为弱阴离子交换层析柱DEAE Bestarose Fast Flow(即DEAE Bestarose FF)，且将实施例1中的操作步骤(3)中的强阳离子交换层析柱SP Bestarose HP替换为弱阳离子交换层析柱CMBestarose Fast Flow(即CM Bestarose FF)，其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
实施例6
将实施例1中的操作步骤(3)中的强阳离子交换层析柱SP Bestarose HP替换为弱阳离子交换层析柱CM Bestarose Fast Flow(即CM Bestarose FF)，其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
对比例1
将实施例1的操作步骤(2)的强阴离子交换层析柱Q Bestarose FF替换为弱阴离子交换层析柱DEAE Bestarose Fast Flow(即DEAE Bestarose FF)，且将步骤(3)的强阳离子交换层析柱SP Bestarose HP替换为弱阳离子交换层析柱CM Bestarose Fast Flow(即CMBestarose FF)，同时省略步骤(4)和步骤(5)，其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
对比例2
在实施例1的操作步骤中，将步骤(4)和(5)省略，其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。
对比例3
在实施例1的操作步骤中，将步骤(5)替换成疏水层析，其余的反应物质和操作步骤及条件与实施例1相同。疏水层析的具体步骤如下：将步骤(4)的稀释液在电导率为50ms/cm，流速为60cm/h下利用Butyl Sepharose HP(GE Healthcare)疏水层析柱进行洗脱分离，收集洗脱液，所得产物为纯化的干扰素-κ。
(二)结果测定
对实施例1-6和对比例1-3获得的产物重组人干扰素-κ蛋白进行测定，纯度和收率结果如下表1所示。采用现有技术常规的SEC-HPLC法和SDS-PAGE法对检测实施例1制得的重组人干扰素-κ蛋白进行检测，检测结果如图2和3所示。
SEC-HPLC层析条件：使用SEC-300型分析柱，色谱柱尺寸4.6*300mm，孔径粒径5μm，外水10000～1000000Da，流速0.26ml/min，缓冲液体系是20mMPB、500mMNaCl、0.1％吐温20，pH7.2，在280nm检测。
表1
从以上表1可以看出，本发明的实施例1-6的层析纯化的样品都实现至少60％的收率和至少93％的蛋白纯度。与本发明的实施例1相比，弱阴离子和弱阳离子交换层析的组合和强阴离子和强阳离子的组合分别导致蛋白收率降低了约31％和约8％，且回收的蛋白纯度下降约18％和约12％。第三步的强阳离子层析步骤用疏水层析步骤替代，也导致重组人干扰素-κ蛋白的收率和纯度显著下降。另外，对本发明的实施例1获得的纯化的干扰素-κ蛋白进行分析，如图2所示的SEC-HPLC结果，本发明的分离纯化方法的实现了干扰素-κ蛋白良好的分离，出现单一主峰；如图3所示，该目标蛋白人干扰素-κ的SDS-PAGE结果显示分离纯化的蛋白纯度极高，且纯化的目标蛋白分子量与天然人干扰素-κ的分子量接近。以上结果表明，本发明的三步层析法以及两次阳离子交换层析步骤显著改善了干扰素-κ蛋白的分离纯化。
本发明的内容不限于以上所列举的各个实施例，本领域普通技术人员应知晓，在不偏离本发明的精神和实质的情况下，通过阅读本发明的说明书可对本发明的技术特征进行各种替代、修改和组合，所述各种替代、修改和组合后的技术方案均为本发明的权利要求的保护范围所涵盖。
序列表
<110> 山东晶辉生物技术有限公司
<120> 一种纯化重组人干扰素-κ的方法和试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp
1 5 10 15
Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu
20 25 30
Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln
35 40 45
Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met
50 55 60
Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp
65 70 75 80
Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala
85 90 95
Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp
100 105 110
Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val
115 120 125
Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp
130 135 140
Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
145 150 155 160
Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala
165 170 175
Leu Phe Arg Arg Lys
180
<210> 2
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctggatt gtaatctgct gaatgtgcat ctgcgtcgtg tgacctggca gaatctgcgt 60
catctgagca gcatgagcaa tagctttccg gttgaatgtc tgcgcgagaa tattgccttt 120
gaactgccgc aggaatttct gcagtatacc cagccgatga aacgcgatat taagaaagcc 180
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aaagaacgtc atctgaaaca gattcagatt ggcctggatc agcaggcaga atatctgaat 300
cagtgtctgg aagaagataa gaatgagaat gaagatatga aggaaatgaa ggagaatgaa 360
atgaaaccga gcgaagcacg cgttccgcag ctgagcagtc tggaactgcg tcgctatttc 420
catcgtattg ataatttcct gaaggagaag aaatacagcg attgtgcctg ggaaattgtt 480
cgcgttgaaa ttcgtcgctg tctgtattat ttctataaat ttaccgccct gttccgccgc 540
aaataa 546
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