一种干扰素的制备方法
阅读说明:本技术 一种干扰素的制备方法 (Preparation method of interferon ) 是由 李冬冬 訾红彦 于 2020-12-25 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种干扰素的制备方法,包括以下步骤:步骤1、分离灰黄层、步骤2、氯化铵处理、步骤3、起动诱生、步骤4、正式诱生、步骤5、收获、步骤6、纯化。该一种干扰素的制备方法一次制备量大,回收率高于60%,经济,简便,易于普及,效价,比活2.2×10°u/mg蛋白,PIFN-A中干扰素含量占回收干扰素的82%,比活也比较高,IIFN的比活较低(5×10’u/mg蛋白)。(The invention discloses a preparation method of interferon, which comprises the following steps: step 1, separating a lime-yellow layer, step 2, treating ammonium chloride, step 3, starting induction, step 4, formal induction, step 5, harvesting, step 6 and purifying. The interferon preparation method has advantages of large preparation amount at one time, high recovery rate higher than 60%, economy, simplicity, easy popularization, high potency, specific activity of 2.2 × 10 u/mg protein, high specific activity of PIFN-A (interferon-alphA) 82%, and low specific activity of IIFN (5 × 10' u/mg protein).)
技术领域
本发明涉及干扰素生产技术领域,尤其涉及一种干扰素的制备方法。
背景技术
干扰素是一类糖蛋白,它具有高度的种属特异性,故动物的干扰素对人无效,干扰素具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。
干扰素主要用于治疗晚期毛细胞白血病、肾癌、黑色素瘤、Kaposi肉瘤、慢性粒细胞性白血病和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤,其他曾用于骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌和膀胱癌等,也适用于急、慢性丙型病毒性肝炎,慢性活动性乙型肝炎。
现有的干扰素的制备方法一次性制备的量较小,为此,我们提出了一种干扰素的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种干扰素的制备方法,解决了上述问题。
为了达到上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明提供一种干扰素的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、分离灰黄层:将100ml血液采入含有抗凝剂的塑料袋内,离心后分离出血浆吸取灰黄层,将吸取的灰黄层,放置4℃冰箱中8-12小时;
步骤2、氯化铵处理:每份灰黄层加入30ml缓冲盐水,再加入总体积9倍量的冷的0.83%的氯化铵溶液,混匀,40℃放置10min,然后在4℃离心(8,000转/min)20min,弃去溶血上清液,并加入适量的缓冲盐水,收集沉淀的细胞,作成悬液,再用9倍量的0.83%氯化铵液重复处理一次,溶解残存的红细胞,取沉淀的白细胞并悬于培养液中,置于冰浴,取样作活细胞计数,用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞;
步骤3、起动诱生:取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素,使其最后浓度为100u/ml,置37℃水浴搅拌培养2h;
步骤4、正式诱生:起动后的白细胞加入仙台病毒,使其最后浓度为100-150血凝单位/ml,在37℃搅拌培养8-12小时;
步骤5、收获:将培养物离心(2,500r/min)30min,吸取上清液即得粗制干扰素,取样作无菌试验并测定效价,每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素;
步骤6、纯化:将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5molL,用2molL盐酸调节pH3-53.5,离心弃去上清液,沉淀A加入原体积1/5量的90-96%冷乙醇,离心弃沉淀,上清液A用盐酸调节pH至5.5,离心弃去沉淀,再调至pH5.8,离心,得上清液B和沉淀B,沉淀B加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液溶解,检测,得干扰素。
优选的,步骤1中所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素、乙二胺四乙酸的一种,400ml血液吸取13-15ml,约为血中细胞的40-50%。
优选的,步骤6中上清液B中加盐酸使pH值降至3,离心,得到沉淀物C,在沉淀物C中加原体积1/5,500量的pH8、0.1mol/L PBS溶解,加NaOH调节pH7-7.5,对PBS透析,静置12小时,离心,收集上清液,检测,得PIEN-A。
优选的,步骤6中上清液B调节pH至8,离心弃去清液,得到沉淀物D,在沉淀物D中加原体积1/50量的0.1mol/LPBSO.5mol/L硫氰化钾溶解,pH降至5.2,离心得上清液C和沉淀物E,沉淀物E加原体积1/2,500量的pH8、0.1molL PBS溶解,调至pH7-7.5,对PBS透析,静置12小时,离心,收集上清液,检测,得PIFN-B。
优选的,步骤2中培养液的基础成分为Eagle’s培养基,其中含4-6%的人血浆蛋白,无磷酸盐,合Tricine 3mg/ml及适量抗生素。
优选的,步骤4中的仙台病毒在10天龄鸡胚中培养48-72h,收获尿囊液获得。
优选的,步骤5中作效价测定的材料在pH2的条件下处理24h后进行检定。
优选的,步骤6中的pH调节剂为盐酸。
优选的,步骤6中甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为2。
本发明的有益效果:本发明一次制备量大,回收率高于60%,经济,简便,易于普及,效价,比活2.2×10°u/mg蛋白,PIFN-A中干扰素含量占回收干扰素的82%,比活也比较高,IIFN的比活较低(5×10'u/mg蛋白)。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
步骤1、分离灰黄层:将100ml血液采入含有抗凝剂的塑料袋内,离心后分离出血浆吸取灰黄层,将吸取的灰黄层,放置4℃冰箱中8小时;
步骤2、氯化铵处理:每份灰黄层加入30ml缓冲盐水,再加入总体积9倍量的冷的0.83%的氯化铵溶液,混匀,40℃放置10min,然后在4℃离心(8,000转/min)20min,弃去溶血上清液,并加入适量的缓冲盐水,收集沉淀的细胞,作成悬液,再用9倍量的0.83%氯化铵液重复处理一次,溶解残存的红细胞,取沉淀的白细胞并悬于培养液中,置于冰浴,取样作活细胞计数,用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞;
步骤3、起动诱生:取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素,使其最后浓度为100u/ml,置37℃水浴搅拌培养2h;
步骤4、正式诱生:起动后的白细胞加入仙台病毒,使其最后浓度为100-150血凝单位/ml,在37℃搅拌培养10小时;
步骤5、收获:将培养物离心(2,500r/min)30min,吸取上清液即得粗制干扰素,取样作无菌试验并测定效价,每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素;
步骤6、纯化:将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5molL,用2molL盐酸调节pH3-53.5,离心弃去上清液,沉淀A加入原体积1/5量的90-96%冷乙醇,离心弃沉淀,上清液A用盐酸调节pH至5.5,离心弃去沉淀,再调至pH5.8,离心,得上清液B和沉淀B,沉淀B加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液溶解,检测,得干扰素。
步骤6中上清液B中加盐酸使pH值降至3,离心,得到沉淀物C,在沉淀物C中加原体积1/5,500量的pH8、0.1mol/L PBS溶解,加NaOH调节pH7-7.5,对PBS透析,静置12小时,离心,收集上清液,检测,得PIEN-A,PIEN-A干扰素含量为82%。
步骤6中上清液B调节pH至8,离心弃去清液,得到沉淀物D,在沉淀物D中加原体积1/50量的0.1mol/LPBSO.5mol/L硫氰化钾溶解,pH降至5.2,离心得上清液C和沉淀物E,沉淀物E加原体积1/2,500量的pH8、0.1molL PBS溶解,调至pH7-7.5,对PBS透析,静置12小时,离心,收集上清液,检测,得PIFN-B,PIFN-B中干扰素含量为。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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