干扰素-κ突变体及其制备方法
阅读说明：本技术 干扰素-κ突变体及其制备方法 (Interferon-kappa mutant and preparation method thereof ) 是由 赵耀 张建军 魏婷婷 孟万利 张秋磊 于 2021-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种干扰素-κ突变体,其通过在野生型干扰素-κ的基础上,将自由的半胱氨酸残基突变为半胱氨酸之外的氨基酸,和/或将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为甲硫氨酸之外的氨基酸。本发明的干扰素-κ突变体体外复性和纯化方便,并且产物均一。(The invention discloses an interferon-kappa mutant, which is obtained by mutating free cysteine residues into amino acids except cysteine and/or mutating partial or all methionine residues capable of forming oxidation modification into amino acids except methionine on the basis of wild-type interferon-kappa. The interferon-kappa mutant of the invention has convenient in-vitro renaturation and purification and uniform product.)
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种干扰素-κ突变体及其制备方法。
背景技术
干扰素(interferon，IFN)，是由科学家Isaacs和Lindenmann于1957年发现流感病毒感染的鸡胚能分泌的一种抗流感病毒因子(Isaacs等，1957)，是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，是可由多种细胞合成、分泌的重要细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种作用(Takaoka A等，2003)，是机体天然免疫防御系统的重要组成部分。
干扰素属诱生蛋白，正常细胞一般不自发产生，属于发挥病毒防御功能最快的免疫体系。干扰素抗病毒效应往往早于特异的机体免疫反应，可有效地限制病毒复制，并具有抑制肿瘤细胞增殖和调节免疫功能的活性(LaFleur等，2001年；Nardelli等，2002年)，是世界范围内许可的治疗多种病毒性疾病、肿瘤和免疫紊乱的药物。目前的抗病毒药物只有单纯的抗病毒作用，而IFN则同时具备抗病毒和调节免疫功能的双重作用，所以抗病毒效果比一般药物强而持久。目前，在我国临床上广泛使用干扰素来治疗慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎等。
根据来源和结构，可将干扰素分为两大类Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN：Ⅰ型IFN包括IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-ε、IFN-ω、IFN-δ等13种亚型，Ⅱ型IFN只有IFN-γ一种(Bach EA等，1997年)。近年来，有新发现的具有干扰素活性的IFN-λ1(IL-28A)、IFN-λ2(IL-28B)、IFN-λ3(IL-29)(Kotenko S V等，2003年)，但它们结合的受体与Ⅰ型干扰素受体不同，故将其命名为Ⅲ型干扰素。
干扰素-κ(interferon kappa，IFN-κ)是近来发现的Ⅰ型干扰素家族成员，由207个氨基酸组成，其中包括27个氨基酸的信号肽，IFN-κ与其他Ⅰ型干扰素具有30％的同源性，由角质形成细胞、单核细胞和树突状细胞(DC)表达，对角质形成细胞和特定的淋巴样细胞群表现出紧密的向性(DeCarlo等人，2010年；LaFleur等人，2001年)。IFN-κ可通过与其它I型干扰素相同的信号通路，即与IFN受体(IFNR)1/2相互作用，激活抗病毒因子的表达。这些基因调节广泛的细胞反应，包括抗病毒效应，抗肿瘤效应，增强NK细胞活性以及激活适应性免疫反应。研究表明，在病毒感染后，IFN-κ选择性地表达在上皮角质细胞中，从而抑制脑心肌炎病毒(ECMV)和人类乳头瘤病毒(HPV)的复制(DeCarlo CA等，2010年)。此外IFN-κ还可抑制多种囊膜病毒的复制，包括流感病毒、寨卡病毒等，显示出广谱抗病毒效果。
2020年1月上海市公共卫生临床中心提出的抗病毒喷剂其中一种主要成分即为IFN-κ，从实验室数据上看，新型冠状病毒(SARS-CoV-2，2019)对于干扰素比流感病毒和寨卡病毒对干扰素更敏感，因此喷剂对冠状病毒可能更有效。因此，IFN-κ已显示出与其他I型IFN相似的抗病毒活性，但它与其他I型IFN截然不同，因为它似乎以离散的自分泌而非旁分泌的细胞相关方式发出信号(LaFleur等，2001年)。在当前的IFN治疗方案中，大量副作用可能会限制IFN的治疗潜力，但是由于IFN-κ独特的分泌性质以及调节免疫分子的作用，可能会使目前的IFN治疗方案有所改善，因此具有更好的使用前景。但是由于其分子的性质原因，规模产业化可能是一个很大的挑战，所以有必要对其进行优化。
发明内容
有鉴于现有技术中的IFN-κ由于分子的性质原因，产量不高、变性和复性有难度、产物不均一等，难以进行规模产业化，本发明提供了一种IFN-κ突变体及其制备方法。本发明也可以只解决上述问题中的一种或几种。
本发明的一个方面提供了一种干扰素-κ突变体，在一个
具体实施方式
中，该干扰素-κ突变体通过在野生型干扰素-κ的基础上，将自由的半胱氨酸残基突变为半胱氨酸之外的氨基酸，和/或将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为甲硫氨酸之外的氨基酸。
进一步地，将自由的半胱氨酸残基突变为侧链较小的氨基酸；将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为侧链较小的氨基酸和/或疏水性氨基酸中的一种或多种。
进一步地，侧链较小的氨基酸为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸；疏水性氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
在一个实施方式中，干扰素-κ突变体还在野生型干扰素-κ的基础上，在N末端添加一个或多个氨基酸。
进一步地，在N末端添加的一个或多个氨基酸为侧链较小的氨基酸。
进一步地，侧链较小的氨基酸为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
可选地，野生型干扰素-κ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、或者包含如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列、或者包含与SEQ ID NO.1至少80％、90％、95％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
进一步地，自由的半胱氨酸残基为SEQ ID NO.1所示的序列的第166位半胱氨酸残基；能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基为SEQ ID NO.1所示的序列的第52位、第112位、第115位和第120位甲硫氨酸残基。
在一个实施方式中，干扰素-κ突变体的氨基酸序列如下所述：
1)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第166位半胱氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸；即IFN-κ(C166S/G/A)；
2)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第166位半胱氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，并在N末端添加一个丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸；即IFN-κ(-1S/G/A，C166S/G/A)；
3)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第166位半胱氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，在N末端添加一个丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，并将第112位甲硫氨酸残基和第115位甲硫氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或疏水性氨基酸；即IFN-κ(-1S/G/A,M112*,M115*,C166S/G/A)；
4)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第166位半胱氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，在N末端添加一个丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，并将第115位甲硫氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或疏水性氨基酸；即IFN-κ(-1S/G/A,M115*,C166S/G/A)；
5)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第166位半胱氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，在N末端添加一个丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，并将第115位甲硫氨酸残基和第120位甲硫氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或疏水性氨基酸；即IFN-κ(-1S/G/A,C166S/G/A,M115*,M120*)；
6)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第166位半胱氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，在N末端添加一个丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，并将第52位甲硫氨酸残基、第115位甲硫氨酸残基和第120位甲硫氨酸残基替换为丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸或疏水性氨基酸；即IFN-κ(-1S/G/A,C166S/G/A,M52*,M115*,M120*)；
7)包含如1)～6)中任一个所示的氨基酸序列；或者
8)包含与1)～6)中任一个所示的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
本发明的第二个方面提供了一种分离的多核苷酸，在一个具体实施方式中，其编码如上所述的干扰素-κ突变体。
可选地，多核苷酸的序列如SEQ ID NO.4或6所示、或者包含如SEQ ID NO.4或6所示的多核苷酸序列、或者包含与SEQ ID NO.4或6的多核苷酸序列至少80％、90％、95％、98％、99％同一性的多核苷酸序列。
本发明的第三个方面提供了一种表达载体，在一个具体实施方式中，包含如上所述的一种分离的多核苷酸。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，在一个具体实施方式中，包含如上所述的一种分离的多核苷酸或如上所述的一种表达载体。
本发明的第五个方面提供了一种干扰素-κ突变体的制备方法，在一个具体实施方式中，干扰素-κ突变体上所述；制备方法为：在表达系统中表达编码如上所述的干扰素-κ突变体的多核苷酸序列，或者利用如上所述表达载体进行表达，或者通过如上所述的宿主细胞表达。
可选地，表达系统为原核表达系统。
可选地，多核苷酸序列连接到表达载体pET21b或pET41a上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
进一步地，制备方法还包括：将表达获得干扰素-κ突变体的包涵体进行体外复性和纯化。
可选地，体外复性为使用盐酸胍和/或DTT进行包涵体溶解，并在复性液中进行复性；纯化为离子交换层析纯化和/或反向层析纯化。
本发明的第五个方面提供了干扰素-κ突变体用于制备治疗疾病的药物或制剂中的用途，干扰素-κ突变体如上所述，或者通过如上所述的制备方法制备获得。
本发明的具体实施方式中的干扰素-κ突变体具有如下优势：
1)将野生型干扰素-κ中自由的半胱氨酸突变为其他氨基酸残基，比如侧链较小的氨基酸残基，有助于表达蛋白的体外复性和纯化。
2)将野生型干扰素-κ中能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为其他氨基酸残基，比如侧链较小的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸，防止或减少在后续的体外复性和纯化中，甲硫氨酸形成氧化修饰(oxidation)造成的产物不均一的现象。
3)当使用大肠杆菌进行蛋白表达时，起始密码子生成的甲硫氨酸残基不会或难以掉落，会导致在后续的体外复性和纯化中，甲硫氨酸形成氧化修饰(oxidation)造成的产物不均一的现象。因此，在起始密码子之后，在野生型干扰素-κ的第一位亮氨酸残基之前(N末端)增加一个或多个氨基酸残基，以帮助起始密码子生成的甲硫氨酸残基的掉落，进一步避免产物不均一的现象。
4)本发明的具体实施方式中的干扰素，其对WISH细胞免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用效果与IFNβ类似。
附图说明
图1是本发明实施例1中IFN-κ(C166S)的PCR产物电泳图。其中，M为DNA分子量梯度；泳道1和泳道2分别为第一轮PCR和第二轮PCR产物。
图2是本发明实施例1中IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)的PCR产物电泳图。
其中，M为Marker；泳道1和泳道2分别为第一轮PCR和第二轮PCR产物。
图3是本发明实施例2中IFN-κ(wt)蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白标准；T为全菌蛋白；S为细菌裂解上清；P为包涵体。
图4是本发明实施例2中IFN-κ(C166S)蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白标准；T为全菌蛋白；S为细菌裂解上清；P为包涵体。
图5是本发明实施例2中IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白标准；T为全菌蛋白；S为细菌裂解上清；P为包涵体。
图6是本发明实施例3中IFN-κ(wt)和IFN-κ(C166S)包涵体复性后的SDS-PAGE电泳图，采用15％梯度胶。其中，M为蛋白标准(单位kD)，还原代表上样缓冲液中有还原剂，非还原代表不含还原剂。
图7是本发明实施例3中IFN-κ(C166S)包涵体复性及纯化后的SDS-PAGE电泳图，采用4～15％梯度胶。其中，M为蛋白标准(单位kD)，还原代表上样缓冲液中有还原剂，非还原代表不含还原剂。
图8是本发明实施例3中IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)包涵体复性及纯化后的SDS-PAGE电泳图，采用15％胶。其中，M为蛋白标准(单位kD)，还原代表上样缓冲液中有还原剂，非还原代表不含还原剂。
图9是采用LC-MS鉴定IFN-κ(C166S)的结果图。
图10是采用LC-MS鉴定IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)的结果图。
图11是IFN-κ(C166S)对WISH细胞保护作用的测定；其中，阳性对照为IFNβ，阴性对照为与I型干扰素不相关的蛋白样品。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
下文中，除另有说明，野生型干扰素-κ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其是以NCBI中protein_id：NP_064509的氨基酸序列去除1～27位信号肽之后形成的。
除另有说明，干扰素-κ突变体的氨基酸序列中氨基酸位置，以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为基准进行计算，即SEQ ID NO.1第一位亮氨酸的位置为1，第一位亮氨酸之后的氨基酸顺序计算位置；若干扰素-κ突变体在第一位亮氨酸之前(N末端)添加其他氨基酸，则添加的其他氨基酸的位置其位置按-1、-2依次计算(最靠近第一位亮氨酸的位置为-1)。
“自由的半胱氨酸残基”是指在干扰素-κ中不形成二硫键的半胱氨酸残基。
“能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基”是指根据空间构象和表面氨基酸分析，可能暴露在蛋白表面的甲硫氨酸残基。
在氨基酸侧链的相对尺寸在本领域是熟知的，并且可以使用任何已知的度量标准比较，所述度量标准包括立体效应、电子密度等。以渐增的尺寸的顺序列出的氨基酸的一个实例是G、A、S、C、V、T、P、I、L、D、N、E、Q、M、K、H、F、Y、R、W。
疏水性氨基酸在本领域是熟知的，例如V、L、I。
本发明的一个具体实施方式中的干扰素-κ突变体，是通过在野生型干扰素-κ(可以是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、或者包含与SEQ ID NO.1至少80％、90％、95％、98％、99％同一性的氨基酸序列)的基础上，通过将自由的半胱氨酸残基突变为半胱氨酸之外的氨基酸，和/或将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为甲硫氨酸之外的氨基酸形成的。在一些实施方式中，将自由的半胱氨酸残基突变为侧链较小的氨基酸；将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为侧链较小的氨基酸和/或疏水性氨基酸。侧链较小的氨基酸包括但不限于，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸。疏水性氨基酸包括但不限于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。将自由的半胱氨酸残基突变为侧链较小的氨基酸残基，有助于后续表达蛋白的体外复性和纯化。将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为侧链较小的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸，可以防止或减少在后续的体外复性和纯化中，甲硫氨酸形成氧化修饰(oxidation)造成的产物不均一的现象。
在一个具体实施方式中，自由的半胱氨酸残基为SEQ ID NO.1所示的序列的第166位半胱氨酸残基；能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基为SEQ ID NO.1所示的序列的第52位、第112位、第115位和第120位甲硫氨酸残基。
在另一个具体实施方式中，干扰素-κ突变体可以通过表达系统进行表达。表达系统可以是原核表达系统，可以是真核表达系统或无细胞表达系统。当使用原核表达系统，比如大肠杆菌表达系统进行表达时，为了避免或减少起始密码子经翻译后形成的甲硫氨酸残基没有掉落，而在后续体外复性和纯化中该甲硫氨酸残基形成氧化修饰(oxidation)造成的产物不均一的现象，在起始密码子翻译形成的甲硫氨酸残基之后，添加一个或多个氨基酸残基，比如添加一个、两个或三个氨基酸残基，从而有助于甲硫氨酰氨基肽酶(MAP)催化对甲硫氨酸进行切除。添加的一个或多个氨基酸残基不是甲硫氨酸残基、不是半胱氨酸残基，可选地是侧链较小的氨基酸残基，包括但不限于，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸。
在另一个具体实施方式中，可以对野生型干扰素-κ(可以是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、或者包含与SEQ ID NO.1至少80％、90％、95％、98％、99％同一性的氨基酸序列)进行三种改进方式中的一种或两种或三种：1)将自由的半胱氨酸残基突变为半胱氨酸之外的氨基酸，2)将能够形成氧化修饰的甲硫氨酸残基部分或全部突变为甲硫氨酸之外的氨基酸形成的，3)在起始密码子翻译形成的甲硫氨酸残基之后，添加一个或多个氨基酸残基。
以下实施例中，野生型干扰素-κ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1重组IFN-κ的设计及表达质粒的构建
IFN-κwt即野生型干扰素-κ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
为了有助于IFN-κ的体外复性和纯化和/或使产物单一，设计了如下的重组IFN-κ：
IFN-κ(-1S/G/A,C166S/G/A)，例如IFN-κ(-1S,C166S)；
IFN-κ(C166S/G/A)，例如IFN-κ(C166S)；
IFN-κ(-1S,M112*,M115*,C166S)，例如IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)、IFN-κ(-1S,M112V,M115A,C166S)；
IFN-κ(-1S,M115*,C166S)，例如IFN-κ(-1S,M115A,C166S)、IFN-κ(-1S,M115V,C166S)；
IFN-κ(-1S,C166S,M115*,M120*)，例如IFN-κ(-1S,C166S,M115A,M120A)、IFN-κ(-1S,C166S,M115A,M120L)；
IFN-κ(-1S,C166S,M52*,M115*,M120*)，例如IFN-κ(-1S,C166S,M52S,M115G,M120A)、IFN-κ(-1S,C166S,M52S,M115V,M120L)。
其中*代表侧链较小的氨基酸或疏水性氨基酸。
IFN-κ(C166S)即在野生型干扰素-κ的基础上，将第166位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)即在野生型干扰素-κ的基础上，在第1位亮氨酸之前(-1位)添加一个丝氨酸，将第112位和第115位的甲硫氨酸突变成丙氨酸，将第166位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
1.1基因和引物合成
IFN-κwt的核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成。
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，具体如表1所示：
表1引物序列
1.2表达质粒的构建
以SEQ ID NO.2基因为模板，进行2轮PCR扩增(分别以SEQ4-F1和SEQ4-R1、SEQ4-F1和SEQ4-R2为引物)，扩增获得的PCR产物进行DNA凝胶回收(如图1所示)，然后重组进pET21b质粒，构建出pET21b-IFNK C166S表达质粒；而以获得的pET21b-IFNK(C166S)表达质粒为模板，进行2轮PCR扩增(分别以SEQ6-F1和SEQ6-R1、SEQ6-F2和SEQ6-R2为引物)，扩增获得的PCR产物进行DNA凝胶回收(如图2所示)，构建出pET41a-IFNK(-1S,M112A,M115A,C166S)表达质粒。以上均按照《分子克隆》进行操作。
同时构建了pET21b-IFNK(wt)表达质粒。
实施例2 IFN-κwt、重组IFN-κ(C166S)和IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)在大肠杆菌中的表达
取1μL实施例1中制备的表达质粒转化表达菌BL21(DE3)，挑取1个单菌落进行保菌。
按1：2000比例进行接种，次日按1：50比例转接到含Amp抗性的500mL LB培养基的三角瓶中，37℃，220rpm，培养至OD600＝2，加入终浓度为0.5mM IPTG，37度诱导3h后收菌。收获的菌体用缓冲液进行悬浮，并进行高压破碎，800bar，3次，然后将表达的蛋白进行SDS-PAGE还原性电泳检测，查看是否生成正确大小的蛋白。以上均按照《分子克隆》进行操作。
结果如图3、图4和图5所示，IFN-κwt，IFN-κ(C166S)和IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)均获得了在20kD～25kD之间有特异蛋白被表达，且目标蛋白主要以包涵体的形式表达。
实施例3重组IFN-κwt，IFN-κ(C166S)和IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)体外复性和纯化
体外复性和纯化中使用的包涵体，采用如实施例2中的培养、诱导及破碎方法获得。
3.1包涵体溶解和复性
用6M盐酸胍和20mM DTT分别溶解实施例2中得到的含有目的蛋白的包涵体，然后分别将溶解后的包涵体按1:100的比例稀释到复性液中(20mM Tris-HCl，1mM半胱氨酸(cysteine)，1mM胱氨酸(cystine)，0.1％SDS，pH9.0)，室温过夜，作为复性样品，即IFN-κwt，IFN-κ(C166S)或IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)的复性样品。
如图6所示，IFN-κ(C166S)在还原和非还原胶上都能看到特异性目的条带，且折叠好的目的蛋白在非还原条件下要比还原条件下迁移的快；而IFN-κwt只在还原条件下看到目的条带，而非还原则没有，可能是形成了沉淀或是聚合物。
3.2离子交换层析纯化
复性后的样品经过10000g，30分钟离心，上清液上样20ml的阳离子交换柱子(购自GE healthcare)，然后进行NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存，此步可以捕获目的蛋白并去除一些杂蛋白。
3.3反相层析纯化
离子交换层析后合并的蛋白再经过反相层析柱子C8(购自YMC)，采用乙腈梯度洗脱，去除折叠错误和一些修饰的蛋白。
3.4离子交换精细纯化
反相层析柱子C8后合并的蛋白适当稀释后进行阳离子交换精细纯化，采用NaCL梯度洗脱，去除一些杂蛋白。
3.5脱盐柱脱盐换液
采用脱盐柱G25(购自GE healthcare)对IFN-κ蛋白进行脱盐换液处理，最终缓冲液为PBS，pH 7.4。
最终样品SDS-PAGE电泳结果如图7和图8显示，为单一条带，且折叠好的目的蛋白在非还原条件下要比还原条件下迁移的快。
3.6 LC-MS鉴定
IFN-κ(C166S)的理论分子量为22306(带有起始Met)，而经过LC-MS鉴定(正离子模式，cone voltage：70V；Capillary voltage：1.5kV；mass range:400-7000m/z)，本实施例中的IFN-κ(C166S)分子量正确(如图9)，复性成功，但是也有连续的+16的分子量，提示为氧化修饰(oxidation)，造成产物的不均一；而经过突变后的IFN-κ(-1S,M112A,M115A,C166S)的理论分子量为22142，实际测得分子量正确(如图10)，且没有氧化修饰，产物较均一。
实施例4复性纯化后的IFN-κ(C166S)活性测试
本发明中利用2015年版《中国药典》三部通则3523干扰素生物学活性测定法来检测干扰素的活性，本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用MTT法对存活的WISH细胞染色，在酶标仪测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。其中，使用到IFN-κ(C166S)的最高浓度为10000ng/mL，5倍梯度倍比稀释，共10个稀释度。
结果如图11所示，IFN-κ(C166S)样品起到了明显保护WISH细胞免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，IFN-κ(C166S)样品从5ng/ml的剂量开始发生效果，并且在各自发挥最大功能的剂量时，对WISH细胞的保护效果与阳性对照IFNβ相当。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京志道生物科技有限公司
<120> 干扰素-κ突变体及其制备方法
<150> CN202010425805.6
<151> 2020-05-19
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp Gln
1 5 10 15
Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu Cys
20 25 30
Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln Tyr
35 40 45
Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met Ser
50 55 60
Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala Glu
85 90 95
Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp Met
100 105 110
Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val Pro
115 120 125
Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn
130 135 140
Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg
145 150 155 160
Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu
165 170 175
Phe Arg Arg Lys
180
<210> 2
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
ctggactgca acctgctgaa tgtccacctg cgtcgcgtta cctggcagaa cctgcgtcat 60
ctgagttcta tgagcaatag ttttccagtt gagtgcctgc gtgagaacat tgccttcgaa 120
ctgcctcagg agtttctgca atacacgcag ccgatgaagc gcgacatcaa aaaggctttc 180
tacgaaatga gtctgcaagc gtttaacatc ttctctcaac atactttcaa gtactggaaa 240
gaacgtcacc tgaaacaaat ccaaattggt ctggaccagc aggctgagta cctgaatcag 300
tgtctggaag aagacaaaaa cgagaacgaa gacatgaagg agatgaaaga aaatgagatg 360
aagccaagcg aagctcgcgt tccacagctg agtagcctgg agctgcgtcg ctactttcat 420
cgtatcgaca atttcctgaa ggaaaagaag tactctgatt gtgcttggga aattgttcgc 480
gttgaaattc gtcgttgcct gtactacttt tacaaattca ccgctctgtt tcgtcgcaaa 540
<210> 3
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp Gln
1 5 10 15
Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu Cys
20 25 30
Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln Tyr
35 40 45
Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met Ser
50 55 60
Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala Glu
85 90 95
Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp Met
100 105 110
Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val Pro
115 120 125
Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn
130 135 140
Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg
145 150 155 160
Val Glu Ile Arg Arg Ser Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu
165 170 175
Phe Arg Arg Lys
180
<210> 4
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
ctggactgca atctgctgaa cgtgcatctg cgtcgtgtca cctggcaaaa tctgcgccac 60
ctgagcagca tgtctaacag ttttcctgtg gaatgtctgc gcgagaacat tgcattcgaa 120
ctgccacaag agttcctgca atacacccag ccaatgaaac gtgacattaa gaaggccttc 180
tatgagatga gcctgcaagc cttcaatatc tttagccagc atacgttcaa gtactggaag 240
gaacgccatc tgaagcaaat ccagattggc ctggatcaac aggcagaata tctgaatcaa 300
tgtctggaag aagacaaaaa cgagaacgag gatatgaaag agatgaagga aaacgagatg 360
aagccgtctg aagctcgcgt accacaactg agttctctgg agctgcgtcg ttactttcat 420
cgcattgaca actttctgaa ggagaagaag tatagtgact gtgcctggga aatcgttcgt 480
gttgagattc gccgtagcct gtactacttc tacaaattca ctgcgctgtt tcgtcgcaag 540
<210> 5
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Ser Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp
1 5 10 15
Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu
20 25 30
Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln
35 40 45
Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met
50 55 60
Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp
65 70 75 80
Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala
85 90 95
Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp
100 105 110
Ala Lys Glu Ala Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val
115 120 125
Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp
130 135 140
Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
145 150 155 160
Arg Val Glu Ile Arg Arg Ser Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala
165 170 175
Leu Phe Arg Arg Lys
180
<210> 6
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
tctctggatt gtaatctgct gaacgtgcac ctgcgtcgtg tcacctggca aaatctgcgt 60
catctgagta gcatgagtaa ctctttccct gtggagtgtc tgcgcgagaa catcgccttc 120
gaactgccac aggaatttct gcaatacact caaccaatga aacgtgacat caagaaggct 180
ttctatgaga tgagtctgca agcgtttaac attttctctc aacatacttt caaatactgg 240
aaagaacgtc acctgaaaca gatccaaatc ggcctggatc aacaggccga gtacctgaat 300
caatgtctgg aagaggacaa gaatgaaaat gaggacgcga aagaagcaaa agagaacgaa 360
atgaagccat ctgaagcccg tgtaccgcaa ctgagtagtc tggagctgcg tcgctacttt 420
catcgtatcg acaacttcct gaaagagaag aaatacagtg actgcgcgtg ggagatcgta 480
cgtgtcgaaa ttcgtcgcag tctgtattac ttttacaaat tcactgccct gtttcgtcgc 540
aag 543
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
taagaaggag atatacatat gctggattgc aacctgctga ac 42
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
cggaacagag cagtgaattt gtagaagtaa tacagagaac ggcgaatttc aacacgt 57
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
gtggtggtgg tggtgctcga gttatttacg acggaacaga gcagtgaatt tgtag 55
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
taagaaggag atatacatat gagcctggat tgcaacctgc tgaac 45
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
ttcgcttctt tcgcatcctc attctcgttc ttatcttctt c 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
gaggatgcga aagaagcgaa agagaacgag atgaaaccgt c 41
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
gtggtggtgg tggtgctcga gttatttacg acggaacaga gcagt 45
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种环保的可逆的蛋白变性工艺