阅读说明：本技术 重组虹鳟i型干扰素、其原核表达和纯化方法及应用 (Recombinant rainbow trout type I interferon, prokaryotic expression and purification method and application thereof ) 是由 魏文燕 李良玉 汪开毓 刘家星 杨马 陈霞 杨倩 唐洪 刘韬 张小丽 陈健 杨 于 2019-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组虹鳟I型干扰素、其原核表达和纯化方法及应用,原核表达和纯化方法包括虹鳟I型干扰素基因的获取、虹鳟I型干扰素基因的筛选、原核表达载体的构建与筛选和重组蛋白的表达与纯化等几个步骤,制备得到的虹鳟I型干扰素具有良好的生物活性,安全、高效,能够用于水产养殖中预防病毒感染性疾病,具有良好的应用前景。(The invention discloses a recombinant rainbow trout type I interferon, a prokaryotic expression and purification method and application thereof, wherein the prokaryotic expression and purification method comprises the steps of obtaining rainbow trout type I interferon genes, screening the rainbow trout type I interferon genes, constructing and screening a prokaryotic expression vector, expressing and purifying recombinant protein and the like, and the prepared rainbow trout type I interferon has good biological activity, is safe and efficient, can be used for preventing virus infectious diseases in aquaculture and has good application prospect.)

重组虹鳟I型干扰素、其原核表达和纯化方法及应用

技术领域

本发明涉及生物工程基因领域，特别涉及重组虹鳟I型干扰素、其原核表达 和纯化方法及应用。

背景技术

目前，由于全球水产品的消费需求远远超过对海洋/淡水物种的可持续捕捞， 因而水产养殖必须满足人们对水产品消费的需求增加。水产养殖已成为世界上 增长最快的食品生产部门，目前占世界食用鱼的30％以上，预计到2030年这一 趋势将增加到50％。据统计，渔业产业给世界提供了17％的动物蛋白，给发展 中国家创造的出口收入超过了肉类、烟草、大米和食糖出口收入的总合。事实 上，对鱼类的营养、繁殖和疾病预防的研究使得每年的水产养殖产量显著增加。 为了保持这种增长速度，水产养殖业必须减少疾病对鱼类养殖所产生的重大影 响以及造成的经济损失。

鱼类的病原体，特别是RNA病毒，每年都会对水产养殖业造成破坏性的经 济影响。传染性造血组织坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV) 在很大程度上就是造成全球鲑鱼养殖业产生重大损失的原因。根据鱼的种类， 病毒株和环境条件，IHNV的暴发可能导致鲑鱼饲养场出现80-100％损失。疾病 暴发后，存活的鱼又可能成为病毒携带者而不会出现任何临床症状。虹鳟，属 鲑形目鲑科太平洋鲑属的一种鲑鱼，被誉为“水中人参”，具有肉多、刺软、少 腥味的特点，是一种颇受欢迎的食用鱼。IHNV是虹鳟养殖中要重点防治的一种 鱼病，由于采用抗生素和化学疗法的控制策略对病毒无效，需要无抗免疫制剂 进行病毒感染性疾病的预防，但水产养殖对免疫制剂提出的低剂量、低成本、 易用性和安全性的要求限制了它们的商业发展。

干扰素(IFN)是一类有高度种属特异性的糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞 增殖、调节免疫及抗肿瘤作用。根据干扰素的产生细胞、受体和活性等因素， 将干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型两种类型，I型IFN具有广谱的抗病毒活性，在病毒感 染早期发挥作用，I型干扰素还被认为是多向性细胞因子，通过作用于高度特化 的免疫细胞连接先天性和获得性免疫。例如，它们启动树突细胞的成熟并指导T 辅助细胞分化成Th1表型。有报道称发现典型的佐剂如弗氏(Freund's)佐剂通 过诱导介导Th1免疫应答的内源I型IFN起作用，说明I型IFN本身是强有力 的免疫刺激剂。

现有技术中，重组鱼类I型干扰素主要使用真核系统或通过体外翻译产生， 使得制备重组鱼类I型干扰素仍然需要较高的生产成本，难以实现规模化生产。 中文杂志《动物医学进展》(2013,34(4)：78-81)公开了一篇名为“虹鳟I型干 扰素基因的表达与纯化”的期刊论文，论文中采用原核表达的方式制备了虹鳟I 型干扰素，但按照该文献中的方法得到的虹鳟I型干扰素在生物活性方面并不理 想，无法应用于水产养殖中对病毒感染性疾病的预防。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种重组虹鳟I型干扰素的原 核表达和纯化方法，制备得到的虹鳟I型干扰素具有良好的生物活性，能够用于 水产养殖中预防病毒感染性疾病。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种重组虹鳟I型干扰素的原核表达和纯化方法，包括以下步骤：

S1.虹鳟I型干扰素基因的获取：从感染了传染性造血组织坏死病毒的虹鳟 的肾脏提取总RNA，采用RT-PCR反应合成cDNA。设计扩增虹鳟I型干扰素基 因的特异性引物，以合成的cDNA为模板，采用特异性引物对虹鳟I型干扰素 进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶进行回收纯化，得到DNA片段。进一 步的，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

S2.虹鳟I型干扰素基因的筛选：将DNA片段与pMD19-T载体连接，得到 第一连接产物，将第一连接产物转化到DH5α感受态细胞中，从转化后的细胞 菌落中挑取白色单一菌落进行初次PCR鉴定，所述初次PCR鉴定反应体系与步 骤S1中PCR扩增相同。从初次PCR鉴定为阳性的菌株中提取质粒，对提取得 到的质粒进行初次酶切反应鉴定，所述初次酶切反应鉴定包括单酶切体系和双 酶切体系的鉴定，初次酶切反应产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分析，所述单酶 切体系鉴定结果为一条3100～3200bp的条带时为鉴定成功，所述双酶切体系鉴 定结果为一条2650～2750bp的条带和一条400～500bp的条带时为鉴定成功， 对单酶切体系和双酶切体系结果均为鉴定成功的质粒进行测序分析。

S3.原核表达载体的构建与筛选：对测序鉴定正确的质粒进行酶切，回收虹 鳟I型干扰素基因片段，将虹鳟I型干扰素基因片段与pET-32a(+)载体连接，得 到第二连接产物，并将第二连接产物转化到BL21感受态细胞，对转化后的细胞 进行二次PCR鉴定和二次酶切反应鉴定。所述二次PCR鉴定包括一类鉴定和二 类鉴定，所述一类鉴定反应体系与步骤S1中PCR扩增相同，所述二类鉴定反 应体系中的引物采用T7和T7-ter。所述二次酶切反应鉴定的反应体系与初次酶 切反应鉴定相同，所述单酶切体系鉴定结果为一条6300～6400bp的条带时为鉴 定成功，所述双酶切体系鉴定结果为一条5850～5950bp的条带和一条400～500bp的条带时为鉴定成功。

S4.重组蛋白的表达与纯化：对二次PCR鉴定均为阳性且二次酶切反应均鉴 定成功的菌株进行液体培养，采用IPTG诱导表达，优选的，诱导表达采用IPTG 浓度为0.2～0.3mmol/L，诱导时间为4～4.5h。离心收集菌体，对菌体重悬后进 行超声破碎，优选的，所述超声破碎的功率为200W，工作2～3s，间隔1s，每 次持续20～22min，重复2～4次。超声后再次离心分别收集上清液和沉淀，对 沉淀进行洗涤后溶解，分别对上清液和沉淀的溶解液过滤。优选的，对所述沉 淀进行洗涤采用2mol/L的尿素溶液，对沉淀溶解采用8mol/L的尿素溶液。采 用中高压层析系统分别对上清液和沉淀的溶解液进行蛋白纯化，对纯化后的沉淀进行4～6℃梯度透析复性，透析梯度为6mol/L的尿素溶液、4mol/L的尿素 溶液、2mol/L的尿素溶液、1mol/L的尿素溶液和PBS缓冲液；对纯化后的上 清液采用PBS缓冲液进行4～6℃透析复性，复性后得到虹鳟I型干扰素的重组 蛋白。

本发明还提供一种重组虹鳟I型干扰素，该重组虹鳟I型干扰素由上述方法 制备得到。

本发明还提供重组虹鳟I型干扰素在预防水产养殖动物的病毒感染性疾病 的药物的应用。优选的，所述的水产养殖动物为虹鳟，所述的重组虹鳟I型干扰 素的应用浓度为0.2～0.5mg/ml。

本发明的有益效果是：

1)本发明的重组虹鳟I型干扰素能够通过原核表达制备得到具有良好生物 活性、且蛋白产物效价高的产物。本发明通过设计特异性引物获取目的基因的 基因片段，经过多次筛选和鉴定后，对选出的表达载体进行培养和诱导表达， 严格控制诱导、提取和复性条件，得到本发明能够用于水产养殖中预防病毒感 染性疾病的重组蛋白产物。

2)本发明的原核表达和纯化方法极大的控制了重组虹鳟I型干扰素的制备 成本，有效提高重组虹鳟I型干扰素的抗病毒生物活性，为后期的产业化生产提 供了最大的可能。

3)本发明的重组虹鳟I型干扰素的药用效果好，安全性高，具备有效改善 传染性造血器官坏死病发病急死亡率高的特点，有利于改善病毒感染性疾病对 水产养殖的重大威胁的现状，可用于预防水产养殖中的病毒感染性疾病，尤其 是传染性造血器官坏死病。

附图说明

图1为本发明实施例一的PCR扩增产物电泳分析图；

图2为本发明实施例一的初次酶切反应鉴定结果；

图3为本发明实施例一的二次PCR鉴定的二类鉴定结果；

图4为本发明实施例一的二次酶切反应鉴定结果；

图5为本发明实施例一的表达产物验证结果；

图6为重组IFNa的体外抗IHNV保护效果图；

图7为重组IFNa的生存曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有 其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合说明书附图和实施例描述本发明一种重组虹鳟I型干扰素的原核 表达和纯化方法，本发明中所用到的下列实验材料和所有试剂均可通过商业手 段购买。

菌株和质粒：

克隆载体19-T Simple Vector购买于宝生物工程(大连)有限公司；原核表达载体pET-32a(+)购买于英潍捷基公司(Invitrogen，CA,US)。大肠杆菌 (EscherichiaColi)DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购买于天根生化科技(北京) 有限公司。

主要试剂：

细菌培养：胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)购自英国OXOID 公司，氨苄青霉素(Amp，100mg/ml)购于生工生物工程(上海)股份有限公 司。

基因克隆：Total RNA提取试剂RNAiso Plus，Prime Script^TMRT reagent Kit(Perfect Real Time)购买于宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara中国)；2×TaqMaster Mix购买于北京擎科新业生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购 于天根生化科技(北京)有限公司；引物合成和基因测序均在生工生物工程(上 海)股份有限公司；质粒DNA小量提取试剂盒购于生工生物工程(上海)股份 有限公司。

核酸电泳：Biowest regular AGAROSE G-10(西班牙琼脂糖)购自成都硕研科技有限公司；核酸染料Gold view购自北京索莱宝科技有限公司；DNA marker购 于宝生物工程(大连)有限公司；6×loading buffer购于天根生化科技(北京) 有限公司。

蛋白表达：限制性内切酶EcoRI和XhoI购于德国Thermo Fisher公司；预染 的蛋白质marker、SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒购于生工生物 工程(上海)股份有限公司；IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactopyranoside)购自北 京索莱宝科技有限公司；Protein Loading Buffer(4X)购自博士德生物科技有 限公司。

蛋白纯化：Bio-ScaleTM Mini NuviaTM IMAC Ni-Charged(1×5ml)购自美国Bio-Rad公司；咪唑(Imidazole)购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

细胞培养:青霉素-链霉素溶液(100×)和0.25％胰蛋白酶购于美国Sigma公司；MEM营养液购于美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购买于Zeta Life公司；PBS 缓冲液购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要仪器：

5424R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；

905SS-ULTS型超低温冰箱(德国Thermo公司)；

Milli-Q Advantage A10超纯水仪(美国Milli-Q公司)；

C1000 Thermal Cycler PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；

琼脂糖核酸电泳仪&水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)；

Mini-Protean cell型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；

Power Pac 100型蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；

中高压层析系统(美国Bio-Rad公司)；

TS100倒置生物显微镜(Nikon公司)；

微量加样枪(德国Eppendorf公司)；

JY92-IIN超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；

AL204型电子天平(上海精密仪表有限公司)；

核酸蛋白仪(Bio-Rad公司)

主要试剂配方：

LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，加入ddH2O 溶解并定容至1000mL，调节pH值至7.0～7.3，121℃灭菌30min。

LB固体培养基(含Amp)：LB液体培养基中加入2.5％琼脂粉，121℃灭菌 30min，室温冷却至50℃左右，加入终浓度100μg/mL的Amp(100mg/mL)， 倒平板。

10×TBE电泳缓冲液(贮存液)：加入Tris 108g，Na2.EDTA.2H2O 7.44g， 硼酸55g，加入去离子水充分溶解，调节pH 8.3并定容至1000mL。

1.0％琼脂糖凝胶：1.0g琼脂糖，加入90mL去离子水和10mL 10×TBE，微 波炉加热融化后制胶。

Binding Buffer(1L)PH 8.0：500mM NaH₂PO₄.2H₂O；300mM NaCl；5mM咪 唑，纯化沉淀时需加入8M脲素。

Elution Buffer(1L)PH 8.0：500mM NaH₂PO₄.2H₂O；300mM NaCl；400mM 咪唑，纯化沉淀时需加入8M脲素。

本发明提供一种技术方案：一种重组虹鳟I型干扰素的原核表达和纯化方法， 包括以下步骤：

S1.虹鳟I型干扰素基因的获取：从感染了传染性造血组织坏死病毒的虹鳟 的肾脏提取总RNA，采用RT-PCR反应合成cDNA。设计扩增虹鳟I型干扰素基 因的特异性引物，以合成的cDNA为模板，采用特异性引物对虹鳟I型干扰素 进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶进行回收纯化，得到DNA片段。

其中，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ IDNo.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

从感染了传染性造血组织坏死病毒的虹鳟的肾脏提取总RNA，具体操作如 下：提取20～30mg感染了IHNV的虹鳟的肾脏，立即在液氮40～80ml的条件 下将其研磨成粉末后倒入0.5～1ml RNAiso Plus中。然后将溶解有虹鳟肾脏组织 的RNAiso Plus于4～6℃，12000r/min的条件下离心5～6min，将上清液转移至 第一个RNAase-free的EP管中，加入其1/5体积的氯仿，手动上下震荡45～50s， 混匀后室温静置5～7min。在4～6℃，12000r/min，离心15～16min，吸取上清 液0.4～0.5ml至第二个RNAase-free的EP管中，加入等体积的异丙醇得到混合 液，颠倒混匀后室温静置10min。在4～6℃下，将加入异丙醇的混合液于12000r/min离心10～15min，去除上清液，保留沉淀，加入1～1.2ml预冷的75％ 的乙醇。在4～6℃，12000r/min离心5min，倒掉步骤S130中的乙醇溶液，室 温放置干燥。最后，向EP管加入30ul ddH₂O(RNAase-free)充分溶解RNA， -80℃保存备用。

采用RT-PCR反应合成cDNA的反转录反应体系为：5x Primer Scrip Buffer 2μl，Primer Scrip RT Enzyme mix 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 2μl， RNAfree ddH₂O 2μl，RNA 3μl；保持反转录反应的参数为：37℃，15min；反 转录酶的失活的反应参数为：85℃，5s；-20～-22℃保存备用。

对虹鳟I型干扰素进行PCR扩增的反应体系为：10pmol/ul的上游引物1.0μl，10pmol/ul的下游引物1.0μl，模板2μl，2×Taq Master Mix 10μl，H₂O 6μl；反 应条件均为：94℃，5min，循环次数为1次；(94℃，30s；57℃，30s；72℃， 45～60s)循环次数为35次；72℃，10min，循环次数为1次。

S2.虹鳟I型干扰素基因的筛选：将DNA片段与pMD19-T载体连接，得到 第一连接产物，将第一连接产物转化到DH5α感受态细胞中，从转化后的细胞 菌落中挑取白色单一菌落进行初次PCR鉴定，采用初次PCR鉴定反应体系与上 述PCR扩增反应体系相同。从初次PCR鉴定为阳性的菌株中提取质粒，对提取 得到的质粒进行初次酶切反应鉴定，初次酶切反应鉴定包括单酶切体系和双酶 切体系的鉴定，初次酶切反应产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分析，单酶切体系 鉴定结果为一条3100～3200bp的条带时为鉴定成功，双酶切体系鉴定结果为一 条2650～2750bp的条带和一条400～500bp的条带时为鉴定成功，对单酶切体 系和双酶切体系结果均为鉴定成功的质粒进行测序分析。

其中，DNA片段与pMD19-T载体连接的连接反应体系为：DNA片段4～ 5ul，19-T Simple Vector 1～2ul，Solution I 5～6ul，在15.5～16.5℃条件下 反应12～16h。

第一连接产物转化到DH5α感受态细胞中的具体过程如下：将第一连接产 物10～13ul加入到50～60ul的大肠杆菌(Escherichia Coli)DH5α感受态细胞中， 保持感受态细胞的完整性的前提下，将其吹打混匀后冰上孵育30～32min，42℃ 恒温孵育器加热90～95sec，再置于冰上静置5～6min，然后加入0.9～1.2ml LB 液体培养基，在36～37℃，于震荡频率150～160r/min条件下培养2～2.5h， 然后取200～250ul菌液均匀铺于Amp-LB琼脂平板，36～37℃培养12～12.5h， 得到菌落。

从初次PCR鉴定为阳性的菌株中提取质粒的具体操作如下：将PCR鉴定为 阳性的菌落接种于10～15mL的Amp-LB液体培养基中，在36～37℃于震荡 频率150～160r/min条件下培养16～18h；取4mL菌液，12000×g常温离心2～3min，弃上清，按照生工生物质粒小抽试剂盒说明书中的步骤提取 pMD19-T-IFNa质粒。

初次酶切反应中，单酶切体系的反应体系具体为：EcoRI 0.5μl， pMD19-T-IFNa 5μl，10×Green Buffer 1.0μl，ddH₂O 3.5μl，双酶切体系的反应体 系具体为：EcoRI 0.5μl，XhoI 0.5μl，pMD19-T-IFNa 5μl，10×Green Buffer 1μl， ddH₂O 3μl。将单酶切体系和双酶切体系的反应液配好后分别置于37℃条件下孵 育1～1.5h，单酶切体系和双酶切体系的反应条件均为：37～37.5℃静止反应 60～62min。采用1～1.5％的琼脂糖凝胶电泳对初次酶切反应产物进行分析。

S3.原核表达载体的构建与筛选：对测序鉴定正确的质粒进行酶切，回收虹 鳟I型干扰素基因片段，将虹鳟I型干扰素基因片段与pET-32a(+)载体连接，得 到第二连接产物，并将第二连接产物转化到BL21感受态细胞，对转化后的细胞 进行二次PCR鉴定和二次酶切反应鉴定。二次PCR鉴定包括一类鉴定和二类鉴 定，一类鉴定反应体系与步骤S1中PCR扩增相同，二类鉴定反应体系中的引 物采用T7和T7-ter。二次酶切反应鉴定的反应体系与初次酶切反应鉴定相同， 单酶切体系鉴定结果为一条6300～6400bp的条带时为鉴定成功，双酶切体系鉴 定结果为一条5850～5950bp的条带和一条400～500bp的条带时为鉴定成功。

其中，对测序鉴定结果的分析，通过与NCBI中虹鳟IFNa1蛋白(登录号CAM28541.1)、IFNa3蛋白(登录号AAV39394.1)进行多序列比对得到，对比结果 的同源性在90％以上，表明克隆正确。

上述回收的虹鳟I型干扰素基因片段的具体操作为：对测序正确的质粒 pMD19-T-IFNa进行双酶切，双酶切反应体系为：EcoRI 5μl，XhoI 5μl， pMD19-T-IFNa 25μl，10×Green Buffer 5.0μl，ddH₂O 10μl。反应条件与步骤S2 中的双酶切体系相同，反应后采用1～1.5％琼脂糖凝胶电泳回收虹鳟I型干扰素 基因片段。在将虹鳟I型干扰素基因片段与pET-32a(+)载体连接前，对pET-32a(+) 也进行相同反应条件的双酶切，反应体系为：EcoRI5μl，XhoI 5μl，pET-32a(+) 25μl，10×Green Buffer 5.0μl，ddH₂O 10μl，反应后回收pET-32a(+)的线性片段。

虹鳟I型干扰素基因片段与pET-32a(+)载体连接的反应体系为：回收的虹鳟 I型干扰素基因片段3～3.5ul，pET-32a(+)线性片段2～2.5uL，Solution I 5～6ul， 15.5～16.5℃反应16～17h。

将第二连接产物转化到BL21感受态细胞的具体方法与第一连接产物转化 到DH5α感受态细胞中的方法相同。在该步骤中，同时设置转入pET-32a(+)空 质粒的BL21(DE3)菌株作为对照，pET-32a(+)空质粒的转化步骤与pET-32a (+)-IFNa一致。

二次PCR鉴定中二类鉴定采用引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG)、 T7-ter(TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)，反应条件为：先后按照94℃，5min反 应一个循环；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)反应35～37个循环，最后 于72℃，10min反应一个循环。其中，鉴定后出现一条650～750bp的条带的细 胞，为成功转入pET-32a(+)空质粒的空载对照菌株。鉴定后出现一条1150～ 1250bp的条带的细胞，为pET-32a(+)-IFNa阳性菌株。对二次PCR鉴定均为阳 性且二次酶切反应均鉴定成功的菌株行甘油保菌，-20～-22℃保存备用。

S4.重组蛋白的表达与纯化：对二次PCR鉴定均为阳性且二次酶切反应均鉴 定成功的菌株进行液体培养，采用IPTG诱导表达，诱导表达采用IPTG浓度为 0.2～0.3mmol/L，诱导时间为4～4.5h。离心收集菌体，对菌体重悬后进行超声 破碎，超声破碎的功率为200W，工作2～3s，间隔1s，每次持续20～22min， 重复2～4次。超声后再次离心分别收集上清液和沉淀，对沉淀进行洗涤后溶解， 对沉淀进行洗涤采用2mol/L的尿素溶液，对沉淀溶解采用8mol/L的尿素溶液， 分别采用0.45μm孔径的滤膜对上清液和沉淀的溶解液过滤，过滤。采用中高压 层析系统分别对上清液和沉淀的溶解液进行蛋白纯化，对纯化后的沉淀进行4～ 6℃梯度透析复性，透析梯度为6mol/L的尿素溶液、4mol/L的尿素溶液、2mol/L 的尿素溶液、1mol/L的尿素溶液和PBS缓冲液；对纯化后的上清液采用PBS 缓冲液进行4～6℃透析复性，纯化后的沉淀和上清液复性时间均为6～8h，复 性后得到虹鳟I型干扰素的重组蛋白。

其中，对二次PCR鉴定均为阳性且二次酶切反应均鉴定成功的菌株的液体 培养具体为：将菌株接种于10～15ml的Amp-LB液体培养基中，于150～160 r/min，37℃的条件下震荡培养至OD值0.6～0.65。诱导表达后，以转化pET-32a (+)空质粒的BL21(DE3)菌株作为对照以消除本底表达。

初次表达完成后，对表达产物进行验证：取1～1.5ml菌液，8000×g离心 2～3min，去上清液，收集菌体，使用40～50ul的PBS重悬菌体，再加入10～ 12.5ul的5×Loadingbuffer混匀，100～106℃加热10～12min，离心30～40sec， 取10ul上样，进行SDS-PAGE分析，电泳完毕后，取出凝胶，放入考马斯亮 蓝染色液中，染色3～3.5h，最后放入清水中煮沸15～20min后拍照观察，与对 照菌株对比，目的菌株PAGE结果比对照菌株多出一条条带，且位置大小与目 的蛋白预期的大小基本一致时，则表明目的蛋白成功表达。

对重组虹鳟I型干扰素复性完成后，采用10％SDS-PAGE对其进行检验， 用核酸蛋白仪检测其浓度，存储于-80℃备用。

实施例1

本实施例提供一种重组虹鳟I型干扰素的原核表达和纯化方法，包括以下步 骤：

S1.虹鳟I型干扰素基因的获取：

采用20mgIHNV成功感染虹鳟的肾脏，足够的量液氮迅速研磨成粉末后倒 入0.5mlRNAiso Plus中，采用氯仿法提取RNA。氯仿法提取RNA的主要过程 如下：

(1)、将所述溶解有虹鳟肾脏组织的RNAiso Plus于4℃，12000r/min的条 件下离心5min，将上清液转移至第一个RNAase-free的EP管中，加入其1/5体 积的氯仿，手动上下震荡45s，混匀后室温静置5min；

(2)、4℃，12000r/min，离心15min，吸取上清液0.4ml至第二个RNAase-free 的EP管中，加入等体积的异丙醇得到混合液，颠倒混匀后室温静置10min；

(3)、4℃，将步骤(2)中的混合液于12000r/min离心10min，去除上清 液，保留沉淀，加入1ml预冷的75％的乙醇；

(4)、4℃，12000r/min离心5min，倒掉步骤(3)中的乙醇溶液，室温放 置干燥；

(5)、向EP管加入30ul ddH₂O(RNAase-free)充分溶解RNA，-80℃保存 备用。

采用如表1所示的反转录反应体系，进行RT-PCR反应合成cDNA，合成条 件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存备用。

表1反转录反应体系

设计扩增虹鳟I型干扰素基因的上下游引物如表2所示：

表2 IFNa特异性引物序列

以反转录的虹鳟cDNA为模板，用Taq酶扩增IFNa基因序列，反应体系和 条件如表3和表4，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测和回收纯化，检 测结果如图1所示，图1中的1为PCR产物，2为阴性对照，M为Marker DL1000， 其中，1在453bp左右的位置检测到条带，表明成功克隆到目的基因片段。

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

S2.虹鳟I型干扰素基因的筛选：

将DNA片段与pMD19-T载体进行TA克隆连接反应得到第一连接产物， 连接反应体系为：DNA片段4ul，19-T Simple Vector 1ul，Solution I 5ul， 在15.5℃条件下反应12h。

将第一连接产物10ul加入到50ul的大肠杆菌(Escherichia Coli)DH5α感受 态细胞中，保持感受态细胞的完整性的前提下将其轻轻吹打混匀后冰上孵育30 min，注意不能用力过猛，感受态细胞很脆弱，不能收到强烈刺激，42℃恒温 孵育器加热90sec，再置于冰上静置5min，然后加入0.9ml LB液体培养基，在 36℃，于震荡频率150r/min条件下培养2h，然后取200ul菌液均匀铺于Amp-LB 琼脂平板，36℃培养12h，得到菌落，若pMD19-IFNa成功转化进入感受态，会 带有抗性，能够在氨苄平板上生长。

挑取白色单一菌落，加入预混好的PCR反应液中进行菌落PCR反应鉴定 (反应体系和条件同目的片段的PCR扩增，表3和表4所示)，将沾有阳性菌落 的移液枪枪头在此反应液中反复吹打，预混好的PCR反应液为：上下游引物各 0.5ul，2×Taq Master Mix 5ul，H₂O4ul。PCR鉴定为阳性的菌落接种于10mL的 Amp-LB液体培养基中，在36℃于震荡频率150r/min条件下培养16h。取4mL 菌液，12000×g常温离心2min，弃上清，提取菌株中的pMD19-T-IFNa质粒， 然后将提取的pMD19-T-IFNa质粒进行初次酶切反应鉴定。

初次酶切反应鉴定包括单酶切体系和双酶切体系鉴定，反应体系见表5，配 好反应液后置于37℃条件下孵育1h，反应条件为：37℃静止反应60min，然后 用1％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分析，若在核酸成像仪下观察到单酶切 后只出现1条条带，大小在3100～3200bp范围内；双酶切后出现2条条带，其 中一条大小在2650～2750bp范围内，另一条大小在400～500bp范围内，即表 明酶切鉴定成功为阳性质粒。初次酶切反应鉴定结果如图2所示，图2中的1 为单酶切产物，2为双酶切产物，M为Marker DL10000，鉴定结果显示，被鉴 定质粒为阳性质粒，将阳性质粒pMD19-T-IFNa送生工生物工程(上海)股份有 限公司进行测序分析。

表5酶切鉴定的反应体系

S3.原核表达载体的构建与筛选：

将质粒pMD19-T-IFNa的氨基酸序列分别和NCBI中虹鳟IFNa1蛋白(登录 号CAM28541.1)、IFNa3蛋白(登录号AAV39394.1)进行多序列比对，同源性分 别为94％和98％，表明克隆正确。将测序鉴定正确的质粒pMD19-T-IFNa和 pET-32a(+)分别进行EcoRI&XhoI双酶切，反应体系见表6，37℃静止反应60min， 1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收虹鳟I型干扰素基因片段和酶切后的pET-32a(+) 线性片段，将回收好的虹鳟I型干扰素基因片段和pET-32a(+)线性片段进行连 接得到第二连接产物，连接反应体系为：回收的虹鳟I型干扰素基因片段3ul， pET-32a(+)线性片段2uL，Solution I 5ul，15.5℃反应16h。

表6大量双酶切反应体系

按照第一连接产物转化到DH5α感受态细胞中的方法，将第二连接产物转 化到大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)感受态细胞中，同时设置转入 pET-32a(+)空质粒的BL21(DE3)菌株作为对照，pET-32a(+)空质粒的转化步 骤与pET-32a(+)-IFNa一致。

挑取菌落，对第二连接产物转化后的细胞进行二次PCR鉴定和二次酶切反 应鉴定，其中，二次PCR鉴定中的一类鉴定反应体系与步骤S1中PCR扩增相 同，二次酶切反应鉴定的反应体系与初次酶切反应鉴定相同。二次PCR鉴定中 的二类鉴定，其反应体系中的引物为T7(TAATACGACTCACTATAGGG)、T7-ter (TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)，反应条件为：先后按照94℃，5min反应一 个循环；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)反应35个循环，最后于72℃， 10min反应一个循环。二类鉴定结果中，pET-32a(+)空载对照菌株出现一条大小 在650～750bp的条带时，表明空质粒转入成功，pET-32a(+)-IFNa菌株出现一 条大小在1150～1250bp的条带时，表明为阳性。二次PCR鉴定中的二类鉴定结 果如图3所示，图3中的1为转入pET-32a(+)空质粒的鉴定结果，2为转入pET-32a (+)-IFNa的鉴定结果，M为MarkerDL2000，鉴定结果显示，pET-32a(+)空载质 粒和pET-32a(+)-IFNa质粒转入成功，为阳性。

二次酶切反应鉴定中，若单酶切后只出现1条条带，大小在6300～6400bp 范围内；双酶切后出现2条条带，其中一条大小在5850～5950bp范围内，另一 条大小在400～500bp范围内，即表明pET-32a(+)-IFNa酶切鉴定成功为阳性质 粒。二次酶切反应鉴定结果如图4所示，图4中的1为单酶切产物，2为双酶切 产物，M为Marker DL10000，鉴定结果显示，二次酶切反应鉴定成功。然后将 上述鉴定结果均为阳性的克隆菌株进行甘油保菌，-20℃保存备用。

S4.重组蛋白的表达与纯化：

初次表达：将上述鉴定结果均为阳性的BL21表达宿主菌接种于10ml的 Amp-LB液体培养基中，于150r/min，37℃的条件下震荡培养至OD值0.6， 然后加入0.2mM IPTG诱导4h，以转化pET-32a(+)空质粒的BL21(DE3)菌 株作为对照，并分别对pET-32a(+)-IFNa和pET-32a(+)空质粒进行不添加诱导剂 的相同条件培养(在不添加IPTG的情况下进行相同条件培养)。

初次表达鉴定：分别取上述四种菌液各1ml，8000×g离心2min，去上清 液，收集菌体，使用40ul的PBS重悬菌体，再加入10ul的5×Loading buffer 混匀，100℃加热10min，离心30sec，取10ul上样，进行SDS-PAGE分析， 电泳完毕后，取出凝胶，放入考马斯亮蓝染色液中，染色3h，最后放入清水中 煮沸15min后拍照观察。

对重组蛋白的可溶性分析：将鉴定正确的阳性BL21表达菌株接种到100mL 100μg/mL Amp-LB(1:100)液体培养基中，于150r/min，37℃培养至OD值 0.6，然后加入0.2mM IPTG诱导4h，将诱导表达后的菌液8000×g常温离心10 min，弃上清，收集菌体，加入50mlPBS缓冲液重悬，然后用超声波破碎仪器 进行破碎，于200W，工作2sec，间隔1s，每次持续20min，重复2次，直至 菌液清亮为止，然后于8000×g，4℃离心40min，分离上清液和沉淀。采用用8mol/L的尿素溶解沉淀后，分别取上清和沉淀溶解液各10ul上样，进行SDS-PAGE 分析。

初次表达鉴定和可溶性分析结果如图5所示，图5中的1为BL21-pET-32a (+)-IFNa经诱导后的表达结果，2为BL21-pET-32a(+)-IFNa没有加诱导剂的表 达结果，3为BL21-pET-32a(+)对照经诱导后的表达结果，4为BL21-pET-32a(+) 对照没有加诱导剂的表达结果，5为可溶性分析中上清液的表达情况，6为可溶 性分析中沉淀的表达情况，M为蛋白质Marker。由鉴定和分析结果可见，图5 中的1比2、3、4均明显多出一条大小约36.5KDa的条带，该条带在5和6中 均有明显表达，证明BL21-pET-32a(+)-IFNa的诱导表达成功，表达得到的重组 蛋白既能以可溶形式表达于细胞周质，也能以包涵体形式表达。

按照上述液体培养的方法将IFNa阳性菌株扩大培养4L，采用与对重组蛋白 的可溶性分析相同的方法对菌液进行诱导表达和处理，经过超声破碎和离心后 得到上清液和沉淀，沉淀用含2mol/L的尿素的包涵体洗涤液洗涤3次，最后用 8mol/L的尿素溶解，将溶解后的沉淀和上清液分别用0.45μm孔径的滤膜进行 过滤，4℃保存备用。

采用中高压层析系统分别对上清液和沉淀的溶解液进行蛋白纯化，将纯化 后的沉淀分别在含6mol/L的尿素、4mol/L的尿素、2mol/L的尿素、1mol/L的 尿素和PBS缓冲液中进行4℃梯度透析复性；将纯化后的上清液置于PBS缓冲 液中进行4℃透析复性，复性时间均为6h。透析后的蛋白经10％SDS-PAGE进 行检验，用核酸蛋白仪检测浓度，本实施例的蛋白复性率为25％蛋白浓度为 0.5mg/ml，分装存储于-80℃备用。

实施例2

本实施例提供一种重组虹鳟I型干扰素的原核表达和纯化方法，包括以下步 骤：

S1.虹鳟I型干扰素基因的获取：

采用30mgIHNV感染虹鳟的肾脏，液氮迅速研磨成粉末后倒入1ml RNAiso Plus中，采用氯仿法提取RNA。氯仿法提取RNA的主要过程如下：

(1)、将所述溶解有虹鳟肾脏组织的RNAiso Plus于6℃，12000r/min的条 件下离心6min，将上清液转移至第一个RNAase-free的EP管中，加入其1/5体 积的氯仿，手动上下震荡50s，混匀后室温静置7min；

(2)、6℃，12000r/min，离心16min，吸取上清液0.5ml至第二个RNAase-free 的EP管中，加入等体积的异丙醇得到混合液，颠倒混匀后室温静置10min；

(3)、6℃，将步骤(2)中的混合液于12000r/min离心15min，去除上清 液，保留沉淀，加入1.2ml预冷的75％的乙醇；

(4)、6℃，12000r/min离心5min，倒掉步骤(3)中的乙醇溶液，室温放 置干燥；

(5)、向EP管加入30ul ddH₂O(RNAase-free)充分溶解RNA，-80℃保存 备用。

采用如表1所示的反转录反应体系，进行RT-PCR反应合成cDNA，合成条 件：37℃15min，85℃5s，-20℃保存备用。

设计扩增虹鳟I型干扰素基因的上下游引物如表2所示。

以反转录的虹鳟cDNA为模板，用Taq酶扩增IFNa基因序列，反应体系和 条件如表3和表4，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测是否有 目的基因片段的条带产生。

S2.虹鳟I型干扰素基因的筛选：

将带有目的基因的DNA片段与pMD19-T载体进行TA克隆连接反应得到 第一连接产物，连接反应体系为：回收的模板DNA片段5ul，19-T Simple Vector 2ul，SolutionI 6ul，在16.5℃条件下反应16h。

将第一连接产物13ul加入到60ul的大肠杆菌(Escherichia Coli)DH5α感受 态细胞中，保持感受态细胞的完整性的前提下将其吹打混匀后冰上孵育32min， 42℃恒温孵育器加热95sec，再置于冰上静置6min，然后加入1.2ml LB液体培 养基，在37℃，于震荡频率160r/min条件下培养2.5h，然后取250ul菌液均 匀铺于Amp-LB琼脂平板，37℃培养12.5h，得到菌落。

挑取白色单一菌落，加入预混好的PCR反应液中进行菌落PCR反应鉴定 (反应体系和条件同目的片段的PCR扩增，表3和表4所示)，预混好的PCR反 应液为上下游引物各0.5ul，2×Taq Master Mix 5ul，H₂O 4ul，PCR鉴定为阳性 的菌落接种于15mL的Amp-LB液体培养基中，在37℃于震荡频率160r/min 条件下培养18h。取4mL菌液，12000×g常温离心3min，弃上清，提取菌株 中的pMD19-T-IFNa质粒，然后将提取的pMD19-T-IFNa质粒进行初次酶切反应 鉴定。

初次酶切反应鉴定包括单酶切体系和双酶切体系鉴定，反应体系见表5，配 好反应液后置于37℃条件下孵育1.5h，反应条件为：37.5℃静止反应62min， 然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分析，将酶切鉴定结果为阳性的 质粒pMD19-T-IFNa送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

S3.原核表达载体的构建与筛选：

将测序鉴定正确的质粒pMD19-T-IFNa和pET-32a(+)分别进行EcoRI&XhoI 双酶切，反应体系见表6，37.5℃静止反应62min，1.5％琼脂糖凝胶电泳后， 切胶回收虹鳟I型干扰素基因片段和酶切后的pET-32a(+)线性片段，将回收好 的虹鳟I型干扰素基因片段和pET-32a(+)线性片段进行连接得到第二连接产物， 连接反应体系为：回收的虹鳟I型干扰素基因片段3.5ul，pET-32a(+)线性片段 2.5uL，Solution I 6ul，16.5℃反应17h。

按照第一连接产物转化到DH5α感受态细胞中的方法，将第二连接产物转 化到大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)感受态细胞中，同时设置转入 pET-32a(+)空质粒的BL21(DE3)菌株作为对照，pET-32a(+)空质粒的转化步 骤与pET-32a(+)-IFNa一致。

挑取菌落，对第二连接产物转化后的细胞进行二次PCR鉴定和二次酶切反 应鉴定，其中，二次PCR鉴定中的一类鉴定反应体系与步骤S1中PCR扩增相 同，二次酶切反应鉴定的反应体系与初次酶切反应鉴定相同。二次PCR鉴定中 的二类鉴定，其反应体系中的引物为T7(TAATACGACTCACTATAGGG)T7-ter (TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)，反应条件：先后按照94℃，5min反应一个 循环；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)反应37个循环，最后于72℃，10min反应一个循环。将鉴定为阳性的克隆菌株进行甘油保菌，-22℃保存备用。

S4.重组蛋白的表达与纯化：

将上述鉴定结果均为阳性的BL21表达宿主菌接种于6L的Amp-LB液体培 养基中，于160r/min，37℃的条件下震荡培养至OD值0.65，然后加入0.3mM IPTG诱导4.5h，以转化pET-32a(+)空质粒的BL21(DE3)菌株作为对照以消 除本底表达。将诱导表达后的菌液8000×g离心13min，去上清液，收集菌体， 使用60ml的PBS缓冲液重悬菌体，然后用超声波破碎仪器进行破碎，于200W， 工作3sec，间隔1s，每次持续22min，重复4次，直至菌液清亮为止，然后于8000×g，5℃离心50min，分离上清液和沉淀，沉淀用含2mol/L的尿素的包 涵体洗涤液洗涤4次，最后用8mol/L的尿素的缓冲液溶解，将溶解后的沉淀和 上清液分别用0.45μm孔径的滤膜进行过滤，6℃保存备用。

采用中高压层析系统分别对上清液和沉淀的溶解液进行蛋白纯化，将纯化 后的沉淀分别在含6mol/L的尿素、4mol/L的尿素、2mol/L的尿素、1mol/L的 尿素和PBS缓冲液中进行6℃梯度透析复性，将纯化后的上清液置于PBS缓冲 液中进行6℃透析复性，复性时间均为8h。透析后的蛋白经10％SDS-PAGE进 行检验，用核酸蛋白仪检测浓度，本实施例的蛋白复性率为21％蛋白浓度为 1mg/ml，分装存储于-80℃备用。

实施例3

本实施例提供一种重组虹鳟I型干扰素的原核表达和纯化方法，包括以下步 骤：

S1.虹鳟I型干扰素基因的获取：

采用25mgIHNV感染虹鳟的肾脏，液氮迅速研磨成粉末后倒入0.8ml RNAiso Plus中，采用氯仿法提取RNA。氯仿法提取RNA的主要过程如下：

(1)、将所述溶解有虹鳟肾脏组织的RNAiso Plus于5℃，12000r/min的条 件下离心5.5min，将上清液转移至第一个RNAase-free的EP管中，加入其1/5 体积的氯仿，手动上下震荡48s，混匀后室温静置6min；

(2)、5℃，12000r/min，离心15.5min，吸取上清液0.45ml至第二个 RNAase-free的EP管中，加入等体积的异丙醇得到混合液，颠倒混匀后室温静 置10min；

(3)、5℃，将步骤(2)中的混合液于12000r/min离心13min，去除上清 液，保留沉淀，加入1.1ml预冷的75％的乙醇；

(4)、5℃，12000r/min离心5min，倒掉步骤(3)中的乙醇溶液，室温放 置干燥；

(5)、向EP管加入30ul ddH₂O(RNAase-free)充分溶解RNA，-80℃保存 备用。

采用如表1所示的反转录反应体系，进行RT-PCR反应合成cDNA，合成条 件：37℃15min，85℃5s，-21℃保存备用。

设计扩增虹鳟I型干扰素基因的上下游引物如表2所示。

以反转录的虹鳟cDNA为模板，用Taq酶扩增IFNa基因序列，反应体系和 条件如表3和表4，PCR产物用1.25％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测是否 有目的基因片段的条带产生。

S2.虹鳟I型干扰素基因的筛选：

将带有目的基因的DNA片段与pMD19-T载体连接反应得到第一连接产物， 连接反应体系为：回收的模板DNA片段4.5ul，19-T Simple Vector 1.5ul， Solution I5.5ul，在16℃条件下反应14h。

将第一连接产物12ul加入到55ul的大肠杆菌(Escherichia Coli)DH5α感受 态细胞中，保持感受态细胞的完整性的前提下将其吹打混匀后冰上孵育31min， 42℃恒温孵育器加热92sec，再置于冰上静置5.5min，然后加入1.0ml LB液体 培养基，在36.5℃，于震荡频率155r/min条件下培养2.3h，然后取220ul菌液 均匀铺于Amp-LB琼脂平板，36.5℃培养12.3h，得到菌落。

挑取白色单一菌落，加入预混好的PCR反应液中进行菌落PCR反应鉴定 (反应体系和条件同目的片段的PCR扩增，表3和表4所示)，预混好的PCR反 应液为上下游引物各0.5ul，2×Taq Master Mix 5ul，H₂O 4ul，PCR鉴定为阳性 的菌落接种于13mL的Amp-LB液体培养基中，在36.5℃于震荡频率155r/min 条件下培养17h。取4mL菌液，12000×g常温离心2.5min，弃上清，提取菌 株中的pMD19-T-IFNa质粒，然后将提取的pMD19-T-IFNa质粒进行初次酶切反 应鉴定。

初次酶切反应鉴定包括单酶切体系和双酶切体系鉴定，反应体系见表5，配 好反应液后置于37℃条件下孵育1.3h，反应条件为：37.3℃静止反应61min， 然后用1.3％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分析，将酶切鉴定结果为阳性的 质粒pMD19-T-IFNa送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

S3.原核表达载体的构建与筛选：

将测序鉴定正确的质粒pMD19-T-IFNa和pET-32a(+)分别进行EcoRI&XhoI 双酶切，反应体系见表6，37.2℃静止反应61min，1.25％琼脂糖凝胶电泳后， 切胶回收虹鳟I型干扰素基因片段和酶切后的pET-32a(+)线性片段，将回收好 的虹鳟I型干扰素基因片段和pET-32a(+)线性片段进行连接得到第二连接产物， 连接反应体系为：回收的虹鳟I型干扰素基因片段3.3ul，pET-32a(+)线性片段 2.25uL，Solution I 5.5ul，16℃反应16.5h。

按照第一连接产物转化到DH5α感受态细胞中的方法，将第二连接产物转 化到大肠杆菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)感受态细胞中，同时设置转入 pET-32a(+)空质粒的BL21(DE3)菌株作为对照，pET-32a(+)空质粒的转化步 骤与pET-32a(+)-IFNa一致。

挑取菌落，对第二连接产物转化后的细胞进行二次PCR鉴定和二次酶切反 应鉴定，其中，二次PCR鉴定中的一类鉴定反应体系与步骤S1中PCR扩增相 同，二次酶切反应鉴定的反应体系与初次酶切反应鉴定相同。二次PCR鉴定中 的二类鉴定，其反应体系中的引物为T7(TAATACGACTCACTATAGGG)T7-ter (TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)，反应条件：先后按照94℃，5min反应一个 循环；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)反应36个循环，最后于72℃，10min反应一个循环。将鉴定为阳性的克隆菌株进行甘油保菌，-21℃保存备用。

S4.重组蛋白的表达与纯化：

将上述鉴定中鉴定均为阳性的BL21表达宿主菌接种于5L的Amp-LB液体 培养基中，于155r/min，37℃的条件下震荡培养至OD值0.62，然后加入 0.25mM IPTG诱导4.2h，以转化pET-32a(+)空质粒的BL21(DE3)菌株作为 对照以消除本底表达。将诱导表达后的菌液，8000×g离心12min，去上清液， 收集菌体，使用55ml的PBS重悬菌体，然后用超声波破碎仪器进行破碎，于 200W，工作2.5sec，间隔1s，每次持续21min，重复3次，直至菌液清亮为止， 然后于8000×g，4.5℃离心45min，分离上清液和沉淀，沉淀用含2mol/L的尿 素的包涵体洗涤液洗涤4次，最后用8mol/L的尿素的缓冲液溶解，将溶解后的 沉淀和上清分别用0.45μm孔径的滤膜进行过滤，5℃保存备用。

采用中高压层析系统分别对上清液和沉淀的溶解液进行蛋白纯化，将纯化 后的沉淀分别在含6mol/L的尿素、4mol/L的尿素、2mol/L的尿素、1mol/L的 尿素和PBS缓冲液中进行5℃梯度透析复性，将纯化后的上清置于PBS缓冲液 中进行5℃透析复性，复性时间均为7h。透析后的蛋白经10％SDS-PAGE进行 检验，用核酸蛋白仪检测浓度，本实施例的蛋白复性率为23％蛋白浓度为 0.8mg/ml，分装存储于-80℃备用。

重组虹鳟I型干扰素的活性验证：

1.重组虹鳟I型干扰素的体外抗IHNV效果评价：

将本发明实施例一制备的重组蛋白稀释为100ug/mL，10ug/mL，1ug/mL 和0.1ug/mL四个浓度，准备24孔细胞培养板，铺满单层细胞后，分别加入上述 四个浓度的重组蛋白，以pET-32a(+)标签蛋白作为空白对照，用以排除标签蛋 白的干扰，孵育12h。去掉培养基，PBS清洗1遍，接种100TCID₅₀ IHNV病毒 液100ul，于16℃孵育1h，随后补加400ul的2％FBS的MEM培养基，MEM 培养基含1％羧甲基纤维素。于16℃继续培养，感染5d后，弃去上层培养基，PBS清洗1遍，加入4％的多聚甲醛固定30min，去掉甲醛溶液，加入结晶紫溶 液染色10min后观察结果。

如图6所示，图6中标注“正常”的一列为未接种IHNV病毒液的正常组， 呈现纯紫色(图中表现为均匀一致的灰色)的完整或几乎完整的细胞层；标注 “空白对照”的一列是用pET-32a(+)标签蛋白代替重组蛋白的对照组，呈现众 多白色小点为病毒造成的噬斑；其他标注“100ug/mL”、“10ug/mL”、“1ug/mL” 和“0.1ug/mL”的四列为分别加入这四种浓度的重组蛋白的试验组。试验结果 表明，浓度为100ug/mL的重组蛋白能够完全保护细胞不受病毒影响，浓度为 0.1ug/mL的重组蛋白能够保护半数细胞不受病毒影响。

2.动物保护实验：

将60尾健康虹鳟鱼苗随机分成三组，分别为对照组，试验组和空白组，其 中，试验组腹腔注射200ul实施例一制备的重组虹鳟I型干扰素蛋白(0.5mg/ml)， 对照组注射相同体积的PBS溶液,空白组注射相同体积浓度的pET-32a(+)标签 蛋白，16℃水温饲养12h后,腹腔注射200ul 10³TCID₅₀的IHNV毒液进行攻毒。 16℃水温继续饲养观察2w，记录每天的死亡率并绘制生存曲线。

如图7所示，对照组和空白组均在IHNV攻毒后的第2.5d出现死亡，而重 组IFNa试验组在第5.5d才出现死亡。在第8.5d时，对照组和空白组的死亡率 均达到100％，而试验组在第14d时，仍有45％的存活率。说明原核表达重组IFNa 在一定程度上能够延缓IHNV的发病时间，并具有一定的抗IHNV保护作用。

按照上述试验方法对实施例二和实施例三制备的重组蛋白进行验证，结果 证明实施例二和实施例三制备得到的蛋白也具有相关活性，对体外细胞和试验 动物均有与实施例一相当的保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所 披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改 和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知 识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围， 则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 成都市农林科学院

四川农业大学

<120> 重组虹鳟I型干扰素、其原核表达和纯化方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcgact ggatccgaca ccactac 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcgaggta catctgtgcc gcaaggat 28