阅读说明：本技术 在抗体制造期间控制粉红色形成的方法 (Method of controlling pink color formation during antibody manufacture ) 是由 杜诚 A·U·博尔万卡尔 余骏昌 谭志俊 于 2018-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明是通过防止在制造和收获期间抗体的还原或抑制在制造和收获期间氰钴胺(CN?Cbl)转化为羟钴胺(HO?Cbl)来防止在抗体制造期间产生粉红色的方法。用红光替换细胞培养基制备和储存区域中的白光抑制CN?Cbl向HO?Cbl的转化。在收获时将过氧化物添加到澄清的物料中抑制抗体二硫键的还原。(The present invention is a method of preventing pink color generation during antibody production by preventing reduction of antibodies during production and harvesting or inhibiting the conversion of cyanocobalamin (CN-Cbl) to hydroxycobalamin (HO-Cbl) during production and harvesting. Replacing white light in the cell culture medium preparation and storage area with red light inhibited the conversion of CN-Cbl to HO-Cbl. Peroxide was added to the clarified material at harvest to inhibit reduction of antibody disulfide bonds.)

在抗体制造期间控制粉红色形成的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月9日提交的美国临时申请号62/503615的权益，将所述临时申请以其整体并入本文。

背景技术

单克隆抗体(mAb)治疗剂在多种人类疾病的治疗中变得更受欢迎。作为大分子，由于宽范围的翻译后修饰，mAb具有一定的异质性。成功控制制造过程对于确保治疗性蛋白质的产品质量和安全性以及批次之间的一致性是关键的。实际上，ICH Q6B指南要求产品外观规格。

正常抗体制造通常具有一些可接受的颜色变化(Derfus GE等人,MAbs2014,6(3):679-688；Prentice KM等人,MAbs 2013,5(6):974-981；Vijayasankaran N等人,Biotechnol Prog 2013,29(5):1270-1277；Xu J等人,Process Biochemistry 2014,49:130-1394)。然而，由于过程中杂质而导致的颜色变化是缺乏过程控制的问题。最终原料药中粉红色/红色的主要来源之一已经被鉴定为维生素B₁₂-mAb复合物(Derfus,2014；Prentice,2013)。尽管尚未阐明相互作用的性质，但是维生素B₁₂与蛋白质的附着似乎足够牢固以使得通过多个下游纯化步骤(包括蛋白质A亲和色谱、低pH病毒灭活、各种精制色谱以及超滤和渗滤)进行共洗脱。

抗体通常在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中产生，并且分泌到细胞外进入细胞培养基中。在培养过程结束时，在使用诸如离心、深度过滤或絮凝等方法澄清收获液的初步回收步骤期间，将细胞与培养基分离。在此过程期间，细胞经常经受各种压力，包括机械剪切、暴露于低溶解氧(DO)环境或温度和pH变化。这些压力导致细胞损伤，从而导致不希望的细胞内组分释放进入澄清液。这些胞质组分(如脂质和酶)可能潜在地影响产品质量，并且必须仔细监测或除去。例如，细胞内还原剂的释放可以导致抗体二硫键的还原(Mun M.等人Biotechnol Bioeng 2015；112:734-742；Ruaudel J等人BMC Proceedings2015；9(增刊9):第24页；Mullan B等人BMC Proc.2011；5(增刊8):第110页；Trexler-Schmidt M等人Biotechnol Bioeng.2010；106:452-461；Koterba,KL等人JBiotechnol.2012；157:261-267；Handlogten MW等人Biotechnol Bioeng.2017；114:1469-1477；Hutchinson N等人Biotechnol Bioeng.2006；95:483-491)。

在制造过程期间，在收获操作和/或蛋白质A色谱后观察到抗体大量还原。多种过程参数可能对抗体还原的程度有影响。例如，在收获期间保持高水平的溶解氧(DO)对于保持抗体分子完整至关重要(Mun M.2015；Trexler-Schmidt M,2010)。机械剪切力(其导致细胞裂解和细胞组分泄漏进入收获液中)也显著地导致还原(Kao YH等人BiotechnolBioeng.2010；107:622-632；Hutterer KM等人MAbs.2013；5:608-613)。其他过程参数(如收获保持时间(Chung WK等人Biotechnol Bioeng.2017；114:1264-12741)、培养基组分(如铜离子、半胱氨酸/半胱氨酸)以及pH和温度(Trexler-Schmidt M,2010；Chung,2017))也对二硫化物还原的程度有影响。

为了确保抗体产品质量，制造过程中控制对于由抗体二硫键还原形成的低分子量(LMW)种类的控制是必要的。因此，近年来已经提出了几种控制二硫化物还原的策略。已经测试了化学抑制剂可防止抗体还原，包括收获前和收获后用抗还原剂(如硫酸铜)(Chaderjian WB等人Biotechnol Prog.2005；21:550-553)、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫氧还蛋白抑制剂(美国专利号8,574,869)半胱氨酸、甲基蓝(WO 2015/085003)和辅酶Q类似物(Li WW等人J Am Chem Soc.2005；127:6140-614)处理。尽管历年来围绕缓解策略的知识和方法已经增加，但是在生产中这些方法的实施并非没有困难，如引入需要通过色谱步骤除去的化学副产物、处理时间增加和脱靶修饰或抗体产品损坏的风险。

发明内容

本发明是通过1)防止在制造和收获期间抗体的还原或2)抑制氰钴胺(CN-Cbl)转化为羟钴胺(HO-Cbl)或3)两者，防止在制造和收获期间抗体的还原和抑制氰钴胺转化为羟钴胺来防止在抗体制造期间产生粉红色的方法。

在本发明的一个实施方案中，在选自培养基制备、培养基储存、抗体生产和抗体收获的一个或多个时间期间，通过防止培养基暴露于可见光来抑制CN-Cbl转化为HO-Cbl。

在本发明的一个实施方案中，在选自培养基制备、培养基储存、抗体生产和抗体收获的一个或多个时间期间，仅使CN-Cbl暴露于UVA光。

在本发明的一个实施方案中，在培养基制备、培养基储存期间和任选地在抗体生产和抗体收获期间，仅使CN-Cbl暴露于红光(>6000nm)。

在本发明的一个实施方案中，在收获时通过将过氧化氢添加到澄清的物料中来防止抗体二硫键的还原。

本发明的另一个实施方案是在制造期间抑制维生素B₁₂与抗体结合的方法，其包括1)在制造和收获期间防止抗体二硫键的还原，或2)在细胞培养基制备、培养基储存、细胞培养过程或抗体收获期间抑制CN-Cbl向HO-Cbl的转化。

本发明的另一个实施方案是产生抗体的方法，其包括1)在红光(>600nm)条件下制备和储存细胞培养基，2)在红光条件下培养产生目标抗体的细胞，3)在红光条件下从细胞培养物中收获抗体，以及4)将过氧化氢添加到收获溶液中。

本发明的另一个实施方案是产生抗体的方法，其包括1)在红光(>600nm)条件下制备和储存细胞培养基，2)在红光条件下培养产生目标抗体的细胞，以及3)在红光条件下从细胞培养物中收获目标抗体。

本发明的另一个实施方案是产生抗体的方法，其包括1)培养产生目标抗体的细胞，2)从细胞培养物中收获目标抗体，以及3)将过氧化氢添加到收获溶液中。

附图说明

图1A-图1D示出了维生素B₁₂和两批mAb B的光谱吸收。1A是维生素B₁₂和两批mAb B的吸收光谱。在PBS中的5mg/L的维生素B₁₂(氰钴胺)(蓝线)，粉红色批次(红线)和无色批次(紫线)，从250nm到800nm。1B是(1A)的重缩放图，以显示详细信息。1D是一瓶具有可见的粉红色的mAb B的蛋白质A洗脱液。

图2A-图2D显示维生素B₁₂与抗体的附着是二级反应。(2A)将两批无色mAb A(未检测到还原的抗体分子的批次(“好”批次)和具有大部分还原的抗体的另一批次(“坏”批次))与CN-Cbl或HO-Cbl混合。孵育后，除去过量的游离维生素B12。样品从左到右，好批次和CN-Cbl；坏批次和CN-Cbl；好批次和HO-Cbl；坏批次和HO-Cbl；以及坏批次首先用过氧化氢处理，然后与HO-Cbl混合。(2B)如CE SDS所示，过氧化氢可以氧化还原的抗体以重整抗体单体。(2C)2B中示出的mAb单体和各种低分子量种类在过氧化氢处理的和未处理的mAb中的定量。(2D)mAb A批次2材料在维生素B₁₂附着之前(蓝线)和之后(黑线)的非还原CE-SDS分析。在与维生素B₁₂一起孵育前后，个别峰型发生了变化，这很可能是由于游离巯基的氧化和空气中二硫键的重新形成。

图3A-图3C示出了用于鉴定维生素B₁₂偶联的质谱数据。(3A)来自HO-Cbl的m/z＝664.79和来自CN-Cbl的m/z＝678.29的MS/MS光谱。(3B)肽-钴胺复合物L19-钴胺和L18-19-钴胺的MS/MS光谱。(3C)IgG4抗体二硫键的图解。与维生素B₁₂结合的半胱氨酸残基标记为蓝色，并且形成二硫键的半胱氨酸残基对圈为红色。

图4A-图4E示出了实施例1中使用的滤色器的透光光谱(4A)。(4B)在标准品中的CN-Cbl和HO-Cbl；(4C)mAb A的新鲜培养基；(4D)暴露于红色光的培养基；以及(4E)暴露于绿色光的培养基在RP-UPLC上分离和在360nm处检测的色谱图。在(4D和4E)中，黑线、蓝线和红线分别代表30万、60万和120万勒克斯小时的曝光能量。

图5A-图5C示出了CB中的游离巯基水平和低分子量(LMW)。(5A)mAb1CB样品的游离硫醇水平和相应的蛋白质A纯化样品(PAVIB)中LMW的存在的相关性。通过NR_Caliper分析PAVIB的LMW种类。具有LMW≥5％的那些样品标记为“是”，否则标记为“否”。使用JMP软件进行分析。(5B)在不同的收获处理下CB中游离硫醇水平的测量。在不存在或存在硫酸葡聚糖的情况下，通过将pH降低至4.8来处理含有mAb 1的实验室规模生物反应器(5-L)的澄清的收获物料(CB)。在将样品深度过滤前，将CB样品在室温下孵育1小时。在深度过滤后，在测量游离巯基含量前，在添加或不添加1mM NAPDH的情况下，将每种样品的等分试样在37℃下孵育75分钟。还包括具有高LMW百分比的制造批次和代表批次(正常批次)用于比较。(5C)在(5B)的样品中完整抗体的百分比。在蛋白质A纯化后，通过NR_Caliper测量完整抗体。

图6A-图6F示出了氧化还原指示剂DCPIP处理和颜色变化的观察结果作为LMW产生的预测标记。(6A)DCPIP的结构和反应。(6B)左侧的具有>95％LMW的mAb2纯化的DS样品(每个抗体蛋白有3.1个巯基)用DCPIP处理后显示无色。右侧的具有超过98％完整抗体的mAb2样品(每个抗体蛋白有0.4个巯基)在DCPIP存在下显示紫色(在pH 5.5中)。(6C)不同培养条件下在mAb 2的CB中DCPIP的颜色变化。左侧两管的DCPIP变得完全无色，表明CB存在较高的还原潜力；中间两管中的DCPIP为蓝色，表明无还原事件；并且右管的DCPIP部分还原。(6D)游离硫醇浓度是细胞裂解的mAb 2百分比的函数。将mAb 2的100％细胞裂解物与常规CB混合以生成细胞裂解物的稀释曲线，并且测量游离硫醇浓度且将其报告为重复样品的平均值。用Excel计算线性回归方程和R方。(6E)用以测试DCPIP的颜色变化的顺序和游离硫醇量的研究设计。(6F)表7中研究的DCPIP测试结果的图像。在初次回收之前和期间，上图的样品接收了空气。在初次回收之前和期间，下图的样品进行了氮气吹扫。试管从左到右的顺序与表7中从上到下的顺序相同。

图7A-图7K示出了使用过氧化氢防止二硫键还原。将mAb 2实验室规模产生的CB等分到含有各种浓度的过氧化氢的容器中。容器内部的无空气条件是通过氮气吹扫产生的，并且在室温下放置一天。将所得样品在不进行蛋白质A纯化的情况下直接通过非还原(7A、7C、7E、7G、7I)和还原(7B、7D、7F、7H、7J)Caliper分析。(7A和7B)使未添加过氧化氢的CB暴露于空气作为对照。将具有0mM(7C和7D)、0.33mM(7E和7F)、1mM(7G和7H)和3mM(7I和7J)过氧化氢的CB保持在无空气条件下。(7K)mAb片段化的非还原Caliper结果的总结。由于存在从宿主细胞分泌的此mAb的过量轻链，轻链的量不作为片段包括在内。用于LMW种类的缩写：LC，轻链；HC，重链；HL，具有一条轻链和一条重链的半抗体；HHL，具有一条轻链和两条重链的部分抗体。

图8A-图8F示出了在最坏的情况下使用过氧化氢防止二硫键还原的评估。如实施例2所述，测试的mAb 2CB具有100％细胞裂解。有或没有空气的保持条件与图7相同。(8A)未经过氧化氢处理并且在空气中保持的CB样品作为对照。(8B)未经过氧化氢处理并且在无空气条件下保持的CB样品。(8C)在保持在无空气条件下之前，将5mM过氧化氢添加到CB样品中。(8C)在保持在无空气条件下之前，将10mM过氧化氢添加到CB样品中。将所得的CB样品(8A至8D)在不进行蛋白质A纯化的情况下直接通过非还原Caliper分析。(8E)来自未纯化的CB的mAb片段化的非还原Caliper结果的总结。(8F)通过蛋白质A色谱纯化并且通过非还原Caliper分析的样品8A至8D的完整抗体纯度的总结。

图9A-图9D示出了使用替代过氧化物防止抗体二硫键还原。在具有100％细胞裂解的mAb 2CB的最坏的情况下，使用过碳酸钠和过硼酸钠。(9A)不含任何过氧化物的保持在空气中的CB样品。(9B)不含任何过氧化物的在无空气条件下保持的CB样品。(9C)5mM过碳酸钠处理的CB样品的代表性结果。在保持在无空气条件下之前添加过碳酸钠。结果来自未纯化的CB的非还原Caliper(9A至9C)。(9D)过碳酸钠和过硼酸钠处理的总结。结果来自未纯化的CB的非还原Caliper。

具体实施方式

生物制品制造的过程控制对于确保治疗性蛋白质的产品质量和安全性以及批次之间的一致性是关键的。了解在制造期间颜色产生的机制对于开发控制策略至关重要。诸位发明人发现，在抗体制造期间粉红色的产生是二级反应，这取决于还原的抗体上的游离巯基和羟钴胺(维生素B₁₂的活性形式)的浓度。两种反应物都是必需的，而且仅有任何一种都不足以产生粉红色。本发明是通过1)防止在制造和收获期间抗体的还原或2)抑制在制造和收获期间氰钴胺(CN-Cbl)转化为羟钴胺(HO-Cbl)来防止在抗体制造期间产生粉红色的方法。可替代地，本发明是通过1)防止在制造和收获期间抗体的还原和2)抑制在制造和收获期间氰钴胺转化为羟钴胺来防止在抗体制造期间产生粉红色的方法。

诸位发明人发现，维生素B₁₂的活性形式附着到位于重链134(HC134)、轻链214(LC214)、重链321(HC321)、重链367(HC367)和重链425(HC425)的半胱氨酸的游离巯基上。这五个半胱氨酸残基分布在Fab区和Fc区之间。在这五个半胱氨酸残基中有两对二硫键，LC214与HC134和HC367与HC425(图3c)。当这些特定的二硫键在制造和收获期间被还原时，二硫化物对中的两个半胱氨酸残基具有同等的羟钴胺附着可及性。

如本文所用，“氰钴胺”和“CN-Cbl”可互换使用，并且是指细胞培养基的维生素B₁₂(VB12)组分。同样，“羟钴胺”和“HO-Cbl”可互换使用，并且是指细胞培养基中维生素B₁₂(VB12)的活性形式，其可在制造和收获期间结合还原的抗体。

抗体通常在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中产生，并且分泌到细胞外进入细胞培养基中。在细胞培养过程结束时，在使用诸如离心、深度过滤或絮凝等方法澄清收获液的初步回收步骤期间，将细胞与培养基分离。

如本文所用，“澄清的物料(clarified bulk)”和“CB”可互换使用，并且是指在用于澄清细胞培养液的初次回收步骤(如离心、深度过滤或絮凝)之后收集的溶液。

如本文所用，“细胞培养基制备”、“细胞培养基储存”、“细胞培养过程”、“抗体制造”、“抗体生产”和“抗体收获”、“收获”是指产生抗体所需的许多步骤。每个步骤可能发生在制造设施内的不同位置。

在制造环境中使用红色光作为粉红色的控制策略。

由于粉红色产物的产生需要羟钴胺和还原的抗体二者，因此控制任一个或两个因素将防止粉红色产生。

光诱导的维生素B₁₂转化可以发生在培养基制备、培养基储存和细胞培养过程期间。在培养基制备、储存持续时间和细胞培养持续时间在玻璃生物反应器中使用透明的一次性生物处理袋会增加维生素B₁₂曝光和转化的风险。一般的控制策略(如使用适当的容器(例如，不锈钢容器)、用另外的层材料覆盖、避免不必要的曝光)可以提供避光保护。然而，这些策略的实施并非没有挑战，并且常常包括额外费用。

实施例1显示红光不诱导CN-Cbl转化为HO-Cbl。将还原的mAb A加标到暴露于白光或红光或绿光或保持在黑暗中的培养基中。孵育过夜后，将mAb通过蛋白质A柱纯化，并且通过ELISA测定测量结合的维生素B₁₂。如表7所示，维生素B₁₂偶联率的顺序为白光>绿光>红光和在黑暗对照中。

在本发明的一个实施方案中，在细胞培养基制备和储存区域以及任选地在细胞培养物制造和收获区域，通过将白光用红色光(波长>600nm)替换来抑制、减少或防止氰钴胺转化为羟钴胺。

在本发明的另一个实施方案中，在细胞培养基制备和储存区域以及任选地在细胞培养物制造和收获区域，通过将白光灯泡用红色LED光灯泡(波长>600nm)替换来抑制、减少或防止氰钴胺转化为羟钴胺。

在本发明的另一个实施方案中，在细胞培养基制备和储存区域以及任选地在细胞培养物制造和收获区域，通过将红色塑料片或可替代地红色管放置在白光灯泡上来抑制、减少或防止氰钴胺转化为羟钴胺。

在本发明的另一个实施方案中，通过将白光灯泡用红色LED光灯泡(波长>600nm)替换或将红色塑料片或可替代地红色管放置在白光灯泡上来将在细胞培养基制备和储存区域以及在细胞培养物制造和收获区域中的白光用红色光替换。

在本发明的另一个实施方案中，通过将白光灯泡用红色LED光灯泡(波长>600nm)替换或将红色塑料片或可替代地红色管放置在白光灯泡上来将在细胞培养基制备和储存区域以及在细胞培养物收获区域中的白光用红色光替换。

在本发明的另一个实施方案中，通过将白光灯泡用红色LED光灯泡(波长>600nm)替换或将红色塑料片或可替代地红色管放置在白光灯泡上来将在细胞培养基制备和储存区域以及在细胞培养物制造区域中的白光用红色光替换。

在蛋白质收获和初次回收期间防止抗体还原作为粉红色的控制策略。

由于粉红色产物的产生需要还原的抗体和羟钴胺二者，因此控制任一个或两个因素将防止粉红色产生。

在mAb制造期间二硫键的还原是酶促氧化还原反应，并且是在抗体制造过程期间低分子量种类(LMW)形成的根本原因。尽管尚未很好地了解LMW产生的原因，但是据信LMW的出现是由于细胞培养条件(如温度、溶解氧(DO)、pH、活力、细胞密度、裂解百分比等)的组合效应，这为抗体创造了还原环境。这通过将抗体保留在还原环境中的澄清的物料(CB)保持条件(例如，温度、持续时间、通气)进一步加剧。LMW的检测通常在澄清的物料或蛋白质A洗脱液合并步骤可视化。

实施例2显示如果游离硫醇水平低于100mM，则LMW产生的风险较低；100-200mM的游离硫醇水平是警告信号；并且高于200mM的游离硫醇水平是LMW产生的高风险。已经提出了许多防止抗体还原的缓解策略，以抑制氧化还原反应中涉及的酶或以氧化和耗尽关键的酶辅因子如NADPH(Mun M 2015；Trexler-Schmidt M 2010)。已经显示空气喷射是防止抗体还原的稳健方法。然而，总的游离硫醇水平仍然可以从制造期间的微摩尔水平到在没有空气的情况下保持CB后的毫摩尔水平变化(表7)。图8显示在澄清的物料条件的最坏的情况下，暴露于空气不能完全抑制抗体还原。

诸位发明人发现，在收获期间将过氧化物添加到澄清的物料中防止抗体二硫键还原和LMW种类的产生。使用过氧化物的益处包括1)过氧化物可以与水以任何比率混合，以及2)过量的过氧化物的除去不应该是下游纯化的负担。然而，尽管理论上将10mM的过氧化氢(H₂O₂)溶液完全分解为水和氧气可以产生5mM的氧气，但是此过程在不存在催化剂的情况下很慢。

实施例2显示将过氧化氢或替代无机或有机过氧化物(如过碳酸钠或过硼酸钠)添加到澄清的物料中可以有效地防止抗体二硫键还原。

在本发明的一个实施方案中，在收获时通过将过氧化氢添加到澄清的物料中来防止抗体二硫键还原。

在本发明的一个实施方案中，在收获时通过将无机或有机过氧化物(如过碳酸钠或过硼酸钠)添加到澄清的物料中来防止抗体二硫键还原。

在本发明的另一个实施方案中，在收获时通过维持澄清的物料的过氧化氢浓度≤10mM来防止抗体二硫键还原。

在本发明的另一个实施方案中，在收获时通过维持澄清的物料的过氧化氢浓度在3mM和10mM之间来防止抗体二硫键还原。

实施例

实施例1

维生素B12与mAb缔合

蛋白质贮液

在此研究中使用两种不同的治疗性IgG4分子(mAb A和B)。它们都在原始IgG4的铰链区基序CPSC中具有丝氨酸到脯氨酸的单点突变，类似于IgG1链间二硫键结构(Liu H等人:MAbs 2012,4(1):17-23；Aalberse RC等人Immunology 2002,105(1):9-19)。IgG4抗体在CHO细胞中产生，并且使用蛋白质A色谱、另外的精制色谱和最终的UF/DF过滤亲和纯化到基于组氨酸的缓冲液中。原料药(DS)的蛋白质浓度通过在280nm处的吸收确定。

维生素B₁₂ ELISA。

使用商业VB12测量试剂盒(Monobind Inc.，加利福尼亚州森林湖)用制造商推荐的步骤确定与纯化的蛋白质缔合的维生素B₁₂(VB12)的量。体外维生素B₁₂与原料药结合。

将在基于组氨酸的缓冲溶液中的mAb A或mAb B溶液(50mg/ml)与CN-Cbl(Sigma-Aldrich，V2876，储备溶液1mg/ml水)或HO-Cbl(Sigma-Aldrich，V5323，储备溶液1mg/ml水)以摩尔比率4:1至2:1(蛋白质:VB12)混合。反应在室温下且在黑暗中进行1天。通过50kDa截留Amicon离心过滤器实现与磷酸盐盐水缓冲液(PBS，Sigma-Aldrich，D5652)的缓冲液交换，直至流出液中无可见的颜色。使缓冲液交换的反应溶液经受肽图分析。

还原的抗体的过氧化氢氧化。

在制造期间，一批mAb A被部分还原了二硫键。在室温下将原料药与0.1％过氧化氢(30mM)混合4小时，并且如上所述通过缓冲液交换除去过量的过氧化氢。

曝光研究。

将新鲜制备的mAb A培养基用于曝光研究。将CN-Cbl添加到终浓度为10mg/L(来自1mg/ml储备溶液)。

将13W白光紧凑型荧光灯泡(CFL)用作可见光源。将以360nm为中心的13W可商购获得的黑光灯泡用作UV光源。将灯设置在每分钟流速为200立方英尺空气的通风橱中，以避免溶液加热。工作台表面是黑色的，以避免光反射。将样品放置在距离灯约12-13英寸处(灯管表面的平均强度为672勒克斯)，以模拟正常的室内光照条件(500-1,000勒克斯)。用光度计(分别用于UVA和可见光的Sper Scientific UVA/B光度计型号850009和Extech HD400)测量光强度。滤色器购自Arbor Scientific(Kit 33-0190)。图4中示出了滤色器的透射光谱。从五金店购买聚碳酸酯塑料片(厚度为2.4mm)，并且用于滤除UVA光。

使所有的培养基样品都暴露于光源，并且对于可见光以30万、60万和120万勒克斯小时(强度×曝光时间)或对于UVA光在71和212瓦每平方米下进行取样。

游离巯基测定。

所述方法使用埃尔曼试剂3,3’-二硫代-双(6-硝基苯甲酸)，3-羧基-4-硝基苯基二硫化物；2,2’-二硝基-5,5’-二硫代苯甲酸(DTNB)，对文献略有修改(Arner ES等人Methods Enzymol 1999,300:226-239)。简而言之，将10μL的原料药样品与15μL的TE缓冲液(50mM Tris-HCl、20mM EDTA，pH 7.6)在96孔板中混合。在使用前，将DTNB溶液(在乙醇中5mg/ml，来自Sigma-Aldrich，D8130)与8M盐酸胍在0.2M Tris(pH 8)中以体积比率1:9新鲜混合。然后将100μL的DTNB/胍溶液添加到每个孔中并且混合。测量在412nm处的光谱吸收，并且使用13,600M^-1cm^-1的摩尔消光系数值进行计算。抗体变性测试。

对于热变性，在Eppendorf试管中，将1mL mAb A(在蛋白质A亲和柱纯化后用Tris中和)在80℃下加热20分钟。加热和冷却后形成可见的沉淀。将管以18,000x g离心20分钟。将上清液用于蛋白质测定(OD 280)和维生素B₁₂ ELISA测定。对于SDS变性，将0.25mL的原料药与0.75mL 0.3％十二烷基硫酸钠(SDS)在磷酸盐盐水溶液(PBS)中混合，并且在室温下放置1天。通过50kDa截留Amicon离心过滤器与PBS进行缓冲液交换来除去多余的SDS。

使用LC/MS/MS对原料药-维生素B12反应混合物进行肽图分析。在不进行事先还原或烷基化的情况下，将含有mAb A和维生素B₁₂的样品用胰蛋白酶消化。在以1:25(重量/重量)的酶与蛋白质比率添加胰蛋白酶之前，使用消化缓冲液(50mM tris HCl、10mM氯化钙和2M尿素，pH 7.6)将缓冲液交换的反应混合物稀释至1mg/mL。在37℃下孵育后，使消化的混合物直接经受LC/MS/MS分析。在通过ThermoFisher Q-EXACTIVE PLUS Orbitrap质谱仪分析之前，将大约10μg的胰蛋白酶消化物使用Waters AcquityTMUPLC进行色谱分离。使用Waters Acquity BEH CSHTMC18柱(1.7μm，2.1x 100mm)进行分离(在45℃下)。使用在60min内1％至80％流动相B的线性梯度以流速0.2mL/min洗脱肽(流动相A：水中的0.1％甲酸和5mM甲酸铵；流动相B：乙腈中的0.1％甲酸和5mM甲酸铵)。将Orbitrap质谱仪在阳离子模式下以3.0kV的喷雾电压运行。加热器温度和毛细管温度分别设置为300℃和275℃。以70,000的分辨率进行MS采集，并且选择每个占空比中10个最强离子以17,500的分辨率用于MS/MS分析。动态排除功能已启用。使用25的归一化碰撞能量获得片段化光谱。

二硫化物还原的mAb和HO-Cbl二者都是产生粉红色所必需的。在mAb的制造期间，观察到通常在蛋白质A洗脱步骤中出现粉红色，在所述步骤中，mAb被浓缩并且除去了培养基成分的背景颜色。我们通过ELISA方法分析了维生素B₁₂含量，并且发现粉红色批次的维生素B₁₂比无色批次的维生素B₁₂高约20倍(表1，批次1与2)。

表1.mAb B的维生素B₁₂(VB12)附着和游离硫醇

基于维生素B₁₂和mAb的分子量和浓度，在47个mAb分子中有色材料具有大约一个维生素B₁₂分子。维生素B₁₂在360、420和550nm附近具有三个主要吸收峰。光谱扫描揭示，在320nm以上，粉红色批次比无色批次具有更高的吸收(图1A和图1B，红线与紫线)。

已经提出二硫键的还原和游离巯基的产生与粉红色的出现相关(Derfus GE等人MAbs 2014,6(3):679-688)。粉红色批次的mAb B中的游离巯基含量比无色批次具有更高的游离巯基水平(表1)。另一方面，一些具有高水平游离巯基含量的批次(对于mAb A N＝4，对于mAb B N＝2)在原料药中没有粉红色。例如，mAb A的批次2比批次1含有更高水平的游离巯基，但是两个批次均为无色并且具有相似水平的维生素B₁₂(表2)。这些结果表明，游离巯基是必需的，但是仅此不足以产生粉红色产物。

表2.mAb A的维生素B₁₂附着和游离硫醇

维生素B₁₂是哺乳动物细胞培养的必需辅因子。CN-Cbl(维生素B₁₂最稳定的形式)是细胞培养过程中使用的唯一来源。据报道，光可以将CN-Cbl转化为对mAb具有高反应性的HO-Cbl(Prentice KM等人:MAbs 2013,5(6):974-981)。为了证明在原料药中产生粉红色既需要蛋白质中的游离硫醇又需要反应性HO-Cbl，通过将CN-Cbl或HO-Cbl与具有低水平(批次1)或高水平(批次2)游离巯基含量的mAb A一起孵育来建立一组测试。将维生素B₁₂亚型和mAb混合，并且在室温下在黑暗中孵育1天。孵育后，然后通过过滤将游离维生素B₁₂除去。保留的维生素B₁₂的量(表2)表明(1)对于与同一批mAb复合，HO-Cbl比CN-Cbl活性高得多，(2)具有较高水平的游离巯基的原料药比具有较低水平游离巯基的原料药更有活性，以及(3)在HO-Cbl和具有高水平的游离巯基的原料药的存在下，发生最高的维生素B₁₂掺入，并且导致维生素B₁₂超过100倍的增加。每个样品中来自维生素B₁₂的量的颜色差异是肉眼可见的(图2a)。

游离巯基来自蛋白质中还原的二硫键。mAb A批次2原料药的每个蛋白质分子平均具有3.1个游离巯基(表2)，并且95％以上的抗体分子被还原(图2b和图2c)。将过氧化氢(0.1％v/v)添加到批次2材料中，并且将大部分(86.6％)的低分子量种类(LMW)转化为抗体单体(图2b和图2c)。再氧化的材料具有较低的游离巯基水平(在H2O2处理后和与HO-Cbl一起孵育前测量)和对HO-Cbl较低的反应性。这些结果证明，粉红色的产生是二级反应，其速率取决于两种反应物(即，游离巯基和HO-Cbl)的浓度。

维生素B₁₂与抗体共价结合。尽管有人提出维生素B₁₂附着的性质是非共价性质，但是之前的文献没有提供实验证据(Derfus等人,2014)。假定的非共价缔合将需要抗体结构和电荷与维生素B₁₂的互补性，因此天然蛋白质结构的破坏将释放结合的维生素B₁₂。使用两种变性方法，即加热和SDS处理。在85℃下加热20分钟导致mAb B粉红色材料变性和沉淀。几乎不含蛋白质的上清液仅具有起始蛋白质溶液总维生素B₁₂的3.5％(表1)。SDS通过与肽主链结合并且保持变性蛋白质在溶液中的溶解而使蛋白质变性。维生素B₁₂测定表明，大多数(即使不是全部)维生素B₁₂仍与变性蛋白质缔合(表1)。在非还原毛细管电泳-SDS(CE-SDS)中检测到有色材料的泳动率变动。由于二硫化物还原，最初的mAb A原料药和mAb A-维生素B₁₂有色复合物都在非还原CESDS上具有多个条带。除了与最初的材料中的相应峰重叠的峰外，有色材料还具有向更高分子量一侧移动的另外的峰，并且移动在低分子量峰(如单条轻链和重链)处更为明显(图2d)。此观察结果可以容易地解释为将维生素B₁₂分子添加到mAb中。总而言之，这些结果证明，维生素B₁₂与变性蛋白质缔合，并且在变性条件下与蛋白质共迁移。因此，维生素B₁₂和mAb之间的相互作用不太可能具有非共价性质。

通过LC/MS/MS分析，在胰蛋白酶消化物中观察到CN-Cbl和HO-Cbl二者。CN-Cbl和HO-Cbl的理论分子量分别为1254.567和1345.567Da。针对CN-Cbl观察到的主要离子是在m/z 678.293处的双电荷离子，对应于添加了两个质子的CN-Cbl。然而，针对HO-Cbl观察到的最主要的离子是在m/z 664.789处的双电荷离子，对应于OH配体离开配位化合物并且添加质子的B12-OH。来自HO-Cbl的m/z 664.789种类和来自CN-Cbl的m/z 678.293的MS/MS光谱分别示于图4A和图4B中。存在很多来自这两个MS/MS光谱的共同碎片离子，包括m/z值147.09、359.10、456.72、912.44和1124.45。CN-Cbl的MS/MS光谱中的m/z 997.48和1209.49源自没有丢失CoCN基团的具有m/z 912.44和1124.45的种类。

通过胰蛋白酶消化物的LC/MS/MS分析，通过与几个半胱氨酸残基配位发现了钴胺和IgG之间的配位共价键。每条轻链上有五个半胱氨酸残基，并且每条重链上有十一个半胱氨酸残基。然而，如表3中所列，通过MS仅观察到其中五个(L-C214、H-C134、H-C321、H-367、H-C425)与钴胺形成配位复合物。L-C214位于轻链的C末端，并且它是唯一参与配位共价键形成的轻链半胱氨酸残基。

表3在IgG-维生素B₁₂反应混合物的胰蛋白酶的消化物中观察到的含有半胱氨酸的肽-钴胺复合物

这通过针对C末端肽L₁₉-Cbl复合物(1635.646Da)和不完全消化的肽L_18-19-Cbl复合物(2139.894Da)观察到的质量的证明，质量精确度在2ppm之内。也通过MS/MS分析确认了这些配位复合物。这两种肽-Cbl复合物的MS/MS光谱高度相似，主要由来自钴胺的片段组成。大部分的MS/MS片段可以通过与来自HO-Cbl的m/z 664.789种类的MS/MS光谱进行比较来鉴定。如图4A和图4B所示，m/z 147.09、359.10、486.24与HO-Cbl的MS/MS光谱完全相同。此外，具有m/z 971.47和1183.48的种类由具有m/z 912.44和1124.45的相同结构加上钴(原子质量58.93Da)组成。

同样，已经鉴定重链上的四个半胱氨酸与钴胺形成配位键。H-C134是FAB区中的二硫键与L-C214的配对物。其他三个半胱氨酸残基H-C321、HC-C367和H-C425是重链Fc区上的三个C末端半胱氨酸。此外，HC-C367和H-C425在天然IgG4中是成对的二硫桥。

CN-Cbl向HO-Cbl的光转化和粉红色产物的过程控制。如上所讨论，粉红色反应是二级反应，其取决于还原的抗体分子和HO-Cbl的浓度。因此，需要过程控制策略来防止抗体分子的还原和/或HO-Cbl的产生。抗体产品还原的控制是非常复杂的过程，其可能涉及抗体的重新设计(Peters SJ等人J Biol Chem 2012,287(29):24525-24533；Aalberse RC等人,2002)、培养基组成(Trexler-Schmidt M等人Biotechnol Bioeng 2010,106(3):452-461)、过程参数(Mun M等人Biotechnol Bioeng 2015,112(4):734-742)和收获处理(Trexler-Schmidt M等人,2010)。通过避免可见光曝光来控制HO-Cbl的量是一种可替代的策略。然而，这些选项可能会导致操作不方便，并且可能是细胞系特异性的。

我们通过鉴定导致CN-Cbl转化的波长来解决此问题，并且通过从光源中除去有害波长来建立控制策略。维生素B₁₂具有UVA和可见光吸收(图1)。使新鲜制备的mAb A培养基暴露于(1)由具有500-1,000勒克斯强度的白色荧光灯管提供的常规实验室光下，或(2)由CFL荧光灯泡提供的增强的可见光下，或(3)以360nm为中心的增强的UVA光下。CN-Cbl和HO-Cbl通过RP-UPLC来分离和定量(图4B)。结果显示，主要导致CN-Cbl转化为HO-Cbl的是可见光，而不是UVA光(表4)。转化率随正常实验室光和高强度可见光的总照度(强度×时间)而变。

表4.可见光而非UVA光负责CN-Cbl转化

*能量单位对于可见光是千勒克斯小时，并且对于UVA光是瓦/平方米。

接下来，我们研究了可能导致随能量变化的CN-Cbl转化的可见波长(或颜色)的范围。选定的滤色器用于产生具有特定波长截止值的光，以分离光谱的某些区域(图4A)。如表5所示，CN-Cbl转化的程度随不同颜色的光的曝光时间而变。由于聚碳酸酯玻璃可以阻挡大多数的UVA光，同时对可见光透明，因此其无法防止CN-Cbl转化。暴露于波长大于600nm的红光具有最低的CN-Cbl转化率(图4d)。相比之下，绿光(图4e)和蓝光都具有高得多的CN-Cbl转化率。CN-Cbl在420nm和500-550nm区域具有吸收峰，其与本研究中使用的蓝色和绿色光谱重叠。这些结果提供了有力的证据来支持我们的观点，即不同颜色的光对CN-Cbl转化具有不同的影响，并且只有大于<600nm的波长可以引起CN-Cbl转化。

表5.彩色光对CN-Cbl转化的影响

在制造环境中使用红色光作为粉红色的控制策略。在实验室环境中测试了使用红光代替普通的白色荧光灯。以与收获时的真实细胞培养物相似的mAb A浓度，将还原的mAbA(表2中的批次2产品)加标到培养基中。先前使培养基暴露于白光、红光或绿光(120万勒克斯小时)。在黑暗中孵育过夜(20小时)后，将mAb通过蛋白质A柱纯化，并且通过ELISA测定测量结合的维生素B₁₂。如表6所示，与暴露于红光的培养基和黑暗对照相比，暴露于白光和绿光的培养基中存在更多的维生素B₁₂附着。这些结果表明，红光确实可以保护CN-Cbl不被转化。

表6.mAb A原料药加标到暴露于各种颜色的光的CB中

实施例2

在制造过程期间使用过氧化氢防止抗体二硫键还原

蛋白质贮液

在此研究中使用两种IgG4分子(1和2)和两种IgG1分子(3和4)。IgG4分子在原始IgG4的铰链区基序CPSC中具有丝氨酸到脯氨酸的单点突变，类似于IgG1链间二硫键结构CPPC(Liu H等人MAbs.2012；4:17-23；Aalberse RC等人Immunology 2002；105:9-19)。所有的mAb都在细胞活力范围为50％至90％的CHO细胞培养物中产生。澄清的物料(CB)通常通过深度过滤产生，除非另有说明，在这种情况下，它是通过离心产生的。在一些情况下，在深度过滤之前，将mAb 1细胞培养物用低pH加硫酸葡聚糖处理。下游纯化通过蛋白质A色谱、另外的精制色谱步骤和最终超滤/渗滤步骤进入基于组氨酸-糖的缓冲液中完成。蛋白质浓度通过Dropsense-96光谱仪(Trinean NV，比利时根特9050)通过在280nm(A280)处的吸收确定。

游离巯基含量(硫醇)测定

所述方法使用2,2’-二硝基-5,5’-二硫代苯甲酸(DTNB)，对文献略有修改(ArnerES等人Methods Enzymol 1999；300:226-239)。简而言之，将10mL的澄清的物料或原料药(DS)样品与15mL的TE缓冲液(50mM Tris-HCl、20mM EDTA，pH 7.6)在96孔板中混合。在使用前，将DTNB溶液(在乙醇中5mg/ml，Sigma-Aldrich，D8130)与8M盐酸胍在0.2M Tris(pH 8)中以1:9的体积比率新鲜混合。将100mL的DTNB/胍溶液添加到每个孔中并且混合。测试重复样品。测量在412nm处的光谱吸收，并且使用13,600M^-1cm^-1的摩尔消光系数值进行游离硫醇含量的计算。

氧化还原指示剂测定

将2,6-二氯酚吲哚酚(D2932，Spectrum Chemical MFG Corp，加利福尼亚州加迪纳)溶解于水中，以制成新鲜的1％储备溶液。2,6-二氯酚吲哚酚的氧化形式在中性pH下呈蓝色，并且当还原时变为无色。在酸性pH下，2,6-二氯酚吲哚酚的氧化形式为紫色，并且当还原时变为无色。为了确定还原的和非还原的样品的DCPIP颜色范围，将100％mAb 2细胞裂解物与通过离心产生的普通澄清的物料混合，以产生细胞裂解物的一系列0、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％和70％稀释液。立即测量每种稀释液的游离硫醇含量，并且将其绘制为稀释度的函数(图6D)。将DCPIP(10mL)添加到系列细胞裂解物稀释液(室温下为1mL)中，以通过视觉检查确定哪一种稀释液在几秒钟至几分钟的持续时间内显示颜色变化。

非还原和还原Caliper

根据制造商的建议，将LabChip GXII Touch HT系统(PerkinElmer)用于在还原(R_Caliper)和非还原(NR_Caliper)条件下的mAb纯度分析。NR_Caliper是分离和定量抗体片段(包括2条重链1条轻链(HHL)、1条重链1条轻链(HL)、重链(HC)和轻链(LC))的最便捷的高通量工具。将尺寸排阻色谱用于监测完整mAb和高分子量(HMW)种类。

针对mAb的抗体氧化的质谱测量

将来自mAb 2和3的样品通过二硫苏糖醇还原，通过碘乙酰胺烷基化并且用胰蛋白酶消化。在通过Thermo Scientific Orbitrap Q-EXACTIVETM PLUS质谱仪(德国不来梅)分析前，使用Waters ACQUITY UPLC系统(美国马萨诸塞州米尔福德)对胰蛋白酶消化物进行色谱分离。使用Waters Acquity BEH C18柱(1.7mm，2.1￡150mm)进行分离(在40℃下)。使用在110min内2％至80％流动相B的线性梯度以流速0.2mL/min洗脱肽(流动相A：水中的0.1％甲酸；流动相B：乙腈中的0.1％甲酸)。

将Q Exactive Plus质谱仪在数据相关模式下运行，以在MS和MS/MS采集之间切换。使用40的鞘气流速、10的辅助气体流速、3kV的喷雾电压、275℃的毛细管温度和60的S-Lens RF水平产生离子。对于调查扫描和MS/MS事件，分辨率分别设置为70,000(AGC目标3e6)和17,500(AGC目标1e5)。用单次重复计数，使用10s的动态排除持续时间。在调查扫描的选定的离子色谱图中，通过将氧化肽的峰面积除以天然肽和氧化肽之和获得相对定量。

过氧化氢和其他过氧化物处理

在使用前，将过氧化氢的30％贮液(Sigma-Aldrich目录号216763，密度1.11g/mL)用水新鲜稀释至3％贮液(v/v，等于980mM)。根据需要将3％贮液添加到细胞培养物或CB中，至终浓度为0.1至20mM。为了测试过氧化氢对抗体二硫化物还原的影响，将过氧化氢贮液以0、0.1、0.33、1、3、5、10或20mM的终浓度添加到CB中。

也测试了两种含有过氧化氢的无机化学品，即过碳酸钠(Sigma-Aldrich，目录号371432，2Na2CO3 3H2O2)和过硼酸钠(Sigma-Aldrich，目录号372862，NaBO3 H2O)。过碳酸钠和过硼酸钠在与水接触时都会发生水解，分别生成过氧化氢和碳酸或硼酸。

二硫键还原的小规模模型

将装有吸气盖的500mL瓶(FlexBioSys，目录号FXB-500M-0005)填充300mL澄清的物料。可替代地，将50mL BioProcess袋(ThermoFisher，目录号SH30658.11)填充30mL澄清的物料。将容器连接到纯氮气供应线，并且在室温下用氮气(≤5psi)吹扫1至2小时，然后在无空气条件下保持密封1天。保持后，在通过NR_Caliper分析前，将样品立即通过游离硫醇测定分析或将其与碘乙酰胺混合(终浓度20mM)。

为了产生抗体二硫键还原的最坏情况，通过机械破坏人工诱导100％细胞破坏。将细胞培养物离心(500g持续20min)，将细胞沉淀以原始体积的1/10重悬于RIPA缓冲液(ThermoFisher，目录号8990，25mM Tris、150mM NaCl、0.1％SDS、1％脱氧胆酸钠、1％NP-40，pH 7.6)中，并且在室温下振荡裂解30分钟，然后在冰上冷却并且高速通过组织均质器持续3min。假定这些步骤实现了完全细胞裂解。然后将裂解的材料添加回离心的上清液中。如上所述，将此细胞裂解物填充到有或没有过氧化氢的50mL袋中，然后用氮气吹扫并且在室温下在无空气条件下保持1天。孵育后，将细胞裂解物在4℃下在3,000g下离心60分钟离心两次，并且通过0.2微米过滤器，并且如上所述进行分析。

过氧化氢处理及其对产品质量属性的影响

对于mAb 4，将来自实验室规模生物反应器的细胞培养液用于以下两个实验。在第一个实验中，使用0.2微米过滤器通过离心和过滤产生澄清的物料。将所得的澄清的物料或者(a)在4℃下储存4天作为对照，或者(b)与过氧化氢合并至终浓度为10mM过氧化物，并且在4℃下储存4天。在第二个实验中，将过氧化氢添加到细胞培养液(带有细胞)中，在离心前在室温下孵育1小时。将所得的澄清的物料或者(a)在4℃下储存4天作为对照，或者(b)在第三天在室温下放置并且用氮气吹扫，并且在室温下再保持一天。

将所有所得的样品都通过蛋白质A色谱处理，然后使用过程中心点条件进行低pH病毒灭活和中和步骤。通过尺寸排阻超高效液相色谱分析完整抗体和团聚体水平，通过成像的毛细管等电点聚焦分析电荷变体分布，并且在还原和非还原条件下通过Caliper分析纯度，以评估产品质量属性。通过ELISA估计宿主细胞蛋白质的过程杂质，并且通过qPCR估计残留DNA的过程杂质。

对于mAb 2，将过氧化氢添加到澄清的物料中，至终浓度为0、3、5和10mM，然后在氮气吹扫下在室温下保持1天。在分析前，将所得的样品通过高通量蛋白质A色谱处理。

在制造期间二硫键还原

在工艺开发中，在澄清的物料(CB)或蛋白质A洗脱液(PAE)中，针对几种IgG1和IgG4抗体分子已经观察到mAb的还原。

与其他组相同，在收获和初次回收期间，在澄清的物料中，我们观察到总游离硫醇的积累(WO 2015/085003；Ruaudel J等人BMC Proceedings2015；9(9):24)。显示二硫化物还原的mAb 1澄清的物料的样品与不显示二硫键还原的样品之间游离硫醇浓度的差异显著(图5A)。就mAb 1而言，当澄清的物料中的游离硫醇水平低于100mM时，低分子量产生的风险较低；游离硫醇水平为100-200mM形成潜在风险；并且高于200mM的游离硫醇水平是低分子量产生的高风险。值得注意的是，除了蛋白质中的游离巯基外，埃尔曼试剂(2,2’-二硝基-5,5’-二硫代苯甲酸；DTNB)还与都来自含有巯基的小分子(如还原型谷胱甘肽、半胱氨酸和硫辛酸)的巯基反应。因此，游离硫醇水平的基线水平取决于细胞系、培养基组成(含有巯基的小分子)和细胞活力。然而，当二硫键还原发生时，游离硫醇水平往往比基线高得多。

澄清的物料中的游离硫醇水平是非常动态的，并且与组成和处理过程有关。除了空气暴露外，其他因素(如储存温度和pH)也有助于动力学。将mAb 1澄清的物料的pH从7调节到4.8，然后通过深度过滤除去细胞，导致游离硫醇水平和观察到的低分子量百分比小幅下降(图5B和图5C)。当将细胞收获物用pH 4.8和硫酸葡聚糖的组合处理时(0.05g/L，并且混合60分钟，然后离心和过滤)，游离硫醇水平显著下降，这与絮凝除去宿主细胞蛋白质(包括Trx/TrxR和Glu/GR)并且也可以除去一些含有巯基的小分子的观察结果一致。游离硫醇的水平也随温度而变化。将对照澄清的物料在37℃下孵育75min，导致游离硫醇含量下降60％。然而，如果在37℃孵育之前，将1mM NADPH(TrxR和GR反应的必需组分)添加到溶液中，则在对照和pH调节的CB中看到游离硫醇水平的增加(图5A)。这些动态变化表明，为了更好地预测低分子量产生的风险，应该在收获前到收获后的步骤中监测游离硫醇水平。

使用氧化还原指示剂预测二硫键还原

由于二硫键还原是氧化还原反应，可以将氧化还原指示剂作为简单、快速且稳健的方法来代替DTNB测试，并且预测在收获和回收期间低分子量形成的潜在风险。氧化还原指示剂以类似于pH指示剂在特定的pH下发生颜色变化的方式在特定的电极电位下发生确定的颜色变化。为了找到适当的氧化还原指示剂，测试了大量可商购获得的氧化还原指示剂，并且其中一些被鉴定为可以用于生物制品制造过程的最佳潜在候选物。

氧化还原指示剂的例子是2,6-二氯酚吲哚酚(DCPIP，图6A)。在具有高百分比的低分子量的mAb 2纯化的原料药中，其颜色发生了变化(图6B)，并且其颜色在具有高、中和低水平游离硫醇的澄清的物料中可以分别完全改变或部分改变或不改变(图6C)。为了确定DCPIP的颜色变化范围，将DCPIP储备溶液添加到具有已知游离硫醇浓度的mAb 2细胞裂解物的系列稀释液中(图6D)。在具有3％-5％细胞裂解物和80-100mM范围的游离硫醇浓度的mAb 2CB中，DCPIP发生了颜色变化。因此，当澄清的物料样品具有高于100mM的游离硫醇浓度时，DCPIP会改变颜色，并且此特征使DCPIP成为快速且易于使用的预测在制造期间二硫键还原的风险的方法。

设计了研究，以检查DCPIP的颜色变化是否与游离硫醇水平相关，以及是否能够正确预测低分子量的产生(图6E)。在处理之前，通过用空气或用氮气吹扫过滤器系列的深度过滤来产生mAb 3澄清的物料。使用氮气吹扫产生“无空气”条件，在收获过程期间，在这种条件下没有氧气暴露于液体。将所得的澄清的物料等分到具有0、20％、50％和100％的空气覆盖顶部空间体积比液体体积的小容器中，并且在4℃、24℃和37℃下孵育一天。如表7所示，在收获和回收期间空气的存在对于防止低分子量产生至关重要。在这种情况下，与无空气条件(207mM)相比，起始澄清的物料具有更低的游离硫醇浓度(51mM)，并且即使在空气覆盖百分比的保持条件期间和在不同温度下，溶解氧(DO)水平(≥37％)也足以抑制低分子量产生。

表7.在各种空气和无空气条件下产生并且保持的mAb 3澄清的物料中的游离硫醇浓度和DCPIP颜色变化。

NA：不适用

相比之下，在维持期间的空气覆盖％对在无空气条件下产生的澄清的物料变得重要。最坏的情况是无空气收获和无空气保持，其中完整mAb单体从96.5％下降到81.6％。另外，当空气覆盖为20％或更高时，没有发生二硫化物还原。孵育温度对游离硫醇浓度有不同的影响。最高游离硫醇浓度和最大还原发生在24℃保持下。在4℃保持后游离硫醇量接近保持前的量。推测保持在37℃下保持是TrxR和GR酶活性的最佳温度。然而，这普遍导致所有条件下的游离硫醇量的下降，并且数据与如图5所示的mAb1结果一致。

在1天的保持研究结束时，将每个样品与DCPIP储备溶液混合。通过视觉观察评估颜色变化(图6F)。表7显示颜色变化的顺序与游离硫醇浓度强烈相关；游离硫醇浓度越高，DCPIP颜色变化发生的越快。在充气条件下收集的所有样品都没有显示任何颜色变化。

还以类似方式测试了具有不同标准还原潜力的另外的氧化还原指示剂，并且发现硫堇和亚甲蓝分别在600-800和>1,000mM的游离硫醇水平上发生了颜色变化(数据未显示)。可以将这些染料放在一起以包括指示剂阶梯，从而快速预测在制造期间的风险水平。

重演在收获和初次回收期间的二硫键还原的按比例缩小模型

大量证据表明，二硫键还原与在收获操作期间的细胞裂解相关，并且与澄清的物料随时间推移在室温下保持在没有足够量的空气的密闭容器(例如，一次性袋)中相关(MunM等人Biotechnol Bioeng 2015；112:734-742)。因此，开发了小规模模型来模拟此现象，通过在可密封的容器中填充少量的澄清的物料(10至300mL)，并且通过氮气吹扫产生无空气条件并且保持在室温下，然后通过NR_Caliper分析低分子量(图7)。

在细胞损伤以及从收获前到收获后的各个步骤的保持时间方面，由于来自制造操作的澄清的物料可能因批次而异，因此低分子量含量可以在从百分之几到接近100％的宽范围内变化。为了模拟小规模研究，产生了最坏的情况情境(在以上材料和方法中有描述)，其中将CHO细胞的细胞裂解物与细胞培养物原始体积的上清液混合以模拟100％细胞裂解，并且即使在空气存在下，仍导致低分子量的产生(图8A)，填充到可密封的容器中，用氮气吹扫并且在室温下孵育1天。在这些条件下，在澄清的物料中所有完整的mAb 2抗体分子都完全片段化(图8B和图9B)。测得100％细胞裂解澄清的物料中的游离硫醇含量为1至3mM，其比正常操作的游离硫醇含量至少高10倍。

过氧化氢可以抑制二硫键的还原

控制mAb中二硫键的还原的一种方法是在mAb还原之前消除澄清的物料中所含的还原潜力。测试了为此目的H2O2的使用。如图7所示，在室温下在无空气条件下保持1天后，对照mAb 2澄清的物料产生约20％的低分子量(图7C)。在无空气保持之前，将过氧化氢以0.33、1和3mM的浓度添加到相同的澄清物料中。结果显示，3mM(约0.01％)的过氧化氢可以完全防止低分子量的产生(图7E、图7G和图7I)。这些结果表明，过氧化氢有效地防止二硫键还原。

为了确定在最坏的情况下抑制低分子量产生所需的H₂O₂的最低浓度，使用上述100％裂解的细胞培养物模型。在此研究中，在0、5或10mM H2O2存在下，将100％裂解的细胞培养物保持在无空气条件下。保持1天后，没有剩下完整的mAb2抗体分子，并且低分子量种类以轻链和重链为主，有少量半聚体，这表明与暴露于空气的对照样品相比，几乎完全还原(图9A和图9B)。添加5mM和10mM的H2O2可以分别部分抑制(图8C)和完全抑制(图8D)低分子量产生。这些来自未纯化的CB的NR_Caliper结果总结在图8E中。蛋白质A纯化后，根据NR_caliper结果，具有0、5和10mM H2O2的样品分别具有0、10.1％和98.3％纯的抗体单体(图8F)。暴露于空气的样品具有83％纯的抗体单体。这些结果证实，在澄清的物料处理的最坏情况下，10mM H2O2可以有效地防止mAb还原。

存在许多可以取代过氧化氢的无机或有机的含有过氧化物的化合物。测试了两种无机形式(过碳酸钠和过硼酸钠)作为过氧化氢的替代品。结果显示，两种过氧化物均能以浓度依赖性方式有效地抑制二硫键的还原(图9)。

过氧化氢处理和抗体分子的氧化

使用过氧化氢的一个主要问题是其氧化mAb的潜力。甲硫氨酸残基最容易受到过氧化氢的氧化。(Luo Q等人J Biol Chem.2011；286:25134-25144；Stracke J等人MAbs.2014；6:1229-1242)。在各种过氧化氢处理后，通过质谱分析了mAb 2和3(分别属于IgG4和IgG1亚类)的甲硫氨酸氧化。对于这两种分子，在添加H2O2(1mM至10mM)并在室温下孵育1天后，在所述过氧化氢处理下的同一批样品中，观察到依赖于H2O2浓度的氧化的小幅增加(表8和表9)。然而，H2O2诱导的氧化变化对于mAb 2和3均不明显，因为胰蛋白酶肽图和LC-MS/MS方法具有1％的差异。

表8.过氧化氢处理后mAb 2甲硫氨酸残基的氧化

表9.过氧化氢处理后mAb 3甲硫氨酸残基的氧化

这些结果表明，在最佳的过氧化物浓度下，由过氧化氢或其他过氧化物介导的mAb氧化没有显著增加，并且可以控制氧化水平。

过氧化氢处理对产品质量属性的影响

除了氧化外，还在实验室规模研究中评估了过氧化氢对其他原料药质量属性和下游纯化过程的潜在影响。实验设计包括mAb 2(IgG4)和mAb 4(IgG1)。对于mAb 4，将过氧化氢添加到收获前的细胞培养液和收获后的澄清的物料(无细胞)中。在各种过氧化氢处理后，将所得的澄清的物料通过蛋白质A色谱处理，然后在分析前使用中心过程点条件进行低pH病毒灭活和中和步骤。表10中显示的mAb 4的分析结果表明，在过氧化氢处理的和未处理的样品之间测试的所有属性均无明显变化。过程杂质(宿主细胞蛋白质和残留DNA)也与对照相当，并且在工艺范围内是可接受的(数据未显示)。对于在室温下用0、3、5和10mM H₂O₂处理1天的mAb 2，也获得了相似的结果(表10)。

表10.过氧化氢处理对mAb 2和4的产品质量属性的影响。

*对于mAb 4，处理是在收获前的细胞培养液或澄清的物料步骤进行的，所得的澄清的物料通过蛋白质A色谱和低pH病毒灭活和中和(PAVIB)步骤(使用过程中心点条件)进行处理。分析结果来自PAVIB样品。对于mAb 2，在分析之前，将过氧化氢处理的和对照澄清的物料样品通过高通量蛋白质A柱纯化。ND，未确定。

因此，这些结果表明，过氧化氢处理(最高10mM)不会明显改变在除去细胞前后用过氧化氢处理的样品中测试的所有属性。