阅读说明：本技术 根皮素糖苷类的精炼方法 (Refining method of phloretin glycosides ) 是由 铛史晶 中岛翔平 池田由香 于 2018-08-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及根皮素糖苷类的精炼方法。本发明的目的在于提供一种通过进一步提高纯度而能够精炼根皮素糖苷类的新技术。一种根皮素糖苷类的精炼方法,包括：向合成吸附树脂柱供给包含根皮素糖苷类的多酚,并将根皮素糖苷类吸附于该柱；以及在将乙醇的比例为整个溶液的0.1％以上且低于45％(V/V)的水与乙醇的混合溶液作为流动相而流动之后,将乙醇的比例为整个溶液的45％以上且低于100％(V/V)的水与乙醇的混合溶液、或者乙醇作为流动相而流动,得到包含根皮素糖苷类的馏分。(The invention relates to a refining method of phloretin glycosides. The purpose of the present invention is to provide a novel technique that enables phloretin glycosides to be refined by further increasing the purity. A method for refining phloretin glycosides, comprising: supplying a polyphenol containing phloretin glycosides to a synthetic adsorption resin column, and adsorbing phloretin glycosides to the column; and flowing a mixed solution of water and ethanol having an ethanol ratio of 0.1% or more and less than 45% (V/V) of the total solution as a mobile phase, and then flowing a mixed solution of water and ethanol having an ethanol ratio of 45% or more and less than 100% (V/V) of the total solution or ethanol as a mobile phase to obtain a fraction containing phloretin glycosides.)

根皮素糖苷类的精炼方法

技术领域

本发明涉及一种根皮素糖苷类的精炼方法。

背景技术

高尿酸血症是指，存在于血液中的尿酸的量比通常高的状态。尤其在发达国家中其患者数日益增加，在日本其患者数在过去几十年也一直在增加。高尿酸血症不仅成为痛风的原因，还被指出与高血压等心血管疾病也有关联。因此，被认为除了预防痛风之外，为了改善心血管疾病的状态，将尿酸水平进一步接近正常是很重要的。

另一方面，已知有苹果多酚具有通过抑制血液中的尿酸量来改善高尿酸血症的作用，该苹果多酚是来源于苹果果实的提取物(例如，专利文献1)。

在苹果多酚中包含有根皮苷等根皮素糖苷类、原花青素(procyanidin)、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、绿原酸、檞皮素(quercetin)等。

其中，作为根皮素糖苷类的精炼方法，例如已知有专利文献2的方法。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利文献特开2006-169227号公报；

专利文献2：日本专利文献特开2014-506567号公报。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过进一步提高纯度而能够精炼根皮素糖苷类的新技术。

通常，来源于苹果的根皮素糖苷类通过使用柱等而进行精炼。

本发明人潜心研究的结果，发现在使用该柱的精炼中，在预定的条件下，通过实施分离而能够得到以更高的比例包含根皮素糖苷类的馏分，并完成了本发明。

[1]一种根皮素糖苷类的精炼方法，包括：

向合成吸附树脂柱供给包含根皮素糖苷类的多酚，并将根皮素糖苷类吸附于相应柱；以及

在将乙醇的比例为整个溶液的0.1％以上且低于45％(V/V(volume per volume，容积比率))的水与乙醇的混合溶液作为流动相而流动之后，将乙醇的比例为整个溶液的45％以上且低于100％(V/V)的水与乙醇的混合溶液、或者乙醇作为流动相而流动，得到包含根皮素糖苷类的馏分。

[2]根据[1]所述的根皮素糖苷类的精炼方法，其中，包含根皮素糖苷类的多酚来源于苹果。

[3]根据[1]或[2]所述的根皮素糖苷类的精炼方法，其中，所述合成吸附树脂柱为芳香族类树脂柱。

[4]一种饮料，其中，将根皮素糖苷类包含60mg/l以上，将绿原酸包含120mg/l以下。

[5]一种饮料，其中，将根皮素糖苷类包含60mg/l以上，将原花青素类包含720mg/l以下。

[6]一种固体食物，其中，将根皮素糖苷类包含25g/kg以上，将绿原酸包含50g/kg以下。

[7]一种固体食物，其中，将根皮素糖苷类包含25g/kg以上，将原花青素类包含300g/kg以下。

根据本发明，能够提供一种通过进一步提高纯度而能够精炼根皮素糖苷类的新技术。

附图说明

图1是实施例的饮料的感官评价涉及的图表；

图2是实施例的固体组合物的感官评价涉及的图表。

具体实施方式

以下，对本发明的一个实施方式进行详细叙述。

本实施方式涉及根皮素糖苷类的精炼方法，其包括：向合成吸附树脂柱供给包含根皮素糖苷类的多酚，并将根皮素糖苷类吸附于该柱；以及在将乙醇的比例为整个溶液的0.1％以上且低于45％(V/V(容积比率，volume per volume))的水与乙醇的混合溶液(以下，称为0.1％以上且低于45％的乙醇)作为流动相而流动之后，将乙醇的比例为整个溶液的45％以上且低于100％(V/V)的水与乙醇的混合溶液、或者乙醇(以下，称为45％以上且低于100％的乙醇)作为流动相而流动，得到包含根皮素糖苷类的馏分。

根皮素糖苷类也被称为二氢查耳酮糖苷类，是将根皮素作为糖苷配基的糖苷的总称。作为根皮素糖苷类，能够举出根皮苷、根皮素木糖葡萄糖苷、根皮苷(根皮素-2'-葡萄糖苷)、根皮素-4'-葡萄糖苷、根皮素-4-葡萄糖苷、根皮素-2'，4'-二葡糖苷、根皮素-2'，4-二葡糖苷、根皮素-4，4'-二葡糖苷、根皮素-2'，4，4'-三葡糖苷、根皮素-2'-木糖葡萄糖苷、根皮素-4'-木糖葡萄糖苷、根皮素-4-木糖葡萄糖苷、根皮素-2'，4'-二木糖葡萄糖苷、根皮素-2'，4-二木糖葡萄糖苷、根皮素-4，4'-二木糖葡萄糖苷、根皮素-2'，4，4'-三木糖葡萄糖苷等。

关于根皮苷、根皮素木糖葡萄糖苷，例如能够利用实施例1所述的方法进行定量。另外，关于根皮素糖苷类，也可以通过酶来处理，并作为根皮素而进行定量。

在本实施方式中，包含根皮素糖苷类的多酚例如来源于苹果果实。苹果是蔷薇科苹果属植物，在本实施方式中，没有特别限定其品种等。例如，能够举出津轻、王林、富士、乔纳金、红玉、澳洲青苹、千秋、北斗、陆奥、蛇果(delicious)、三沙(sansa)、秋映、阳光、世界一号、红颜姬(Shinano Sweet)、旭、印度、国光、红星(starking)、北海道9号(HAC-9)等，可以使用其中的一种或两种以上。

另外，果实可以是成熟果实、幼果中的任意一种，对此没有特别限制。

此外，以下，针对包含来源于苹果的根皮素糖苷类的多酚举例说明，但不限于此，也可以将包含来源于其他物质的根皮素糖苷类的多酚用于本实施方式的精炼方法涉及的处理中。

关于本实施方式涉及的根皮素糖苷类，例如能够通过向柱供给苹果汁等包含根皮素糖苷类的来源于苹果汁的提取物并进行精炼而得到。

在本说明书中，果汁是指在将水果榨成汁时所得到的液体成分。榨汁是指从水果榨取液体成分而分离的操作。例如，通过将水果破碎为适当的大小并对该破碎物进行榨汁而得到果汁。在本实施方式中，对于是否对果汁实施浓缩或用水稀释等处理，没有特别限制，例如，本领域技术人员能够根据所使用的柱等而适当地设定。

以下，针对在进行本实施方式的根皮素糖苷类的精炼方法的情况下的一个例子进行说明。

首先，向合成吸附树脂柱供给苹果汁，将根皮素糖苷类吸附于柱。

接着，将水与乙醇的混合溶液作为流动相而进行精炼处理，得到根皮素糖苷类。具体地说，得到通过以下的方式精炼出的根皮素糖苷类：将0.1％以上且低于45％的乙醇作为流动相而流动(第一洗脱处理)，然后，将45％以上且100％以下的乙醇作为流动相而流动(第二洗脱处理)，并回收通过该第二洗脱处理得到的馏分。

在本实施方式的精炼方法中，能够使用合成吸附树脂柱。用于该柱的合成吸附剂是具有大孔隙的不溶性三维交联结构聚合物，其通过范德瓦耳斯(van der Waals)力吸附各种有机物。

作为合成吸附树脂柱，能够举出苯乙烯-二乙烯基苯类和丙烯酸类等芳香族类树脂柱、丙烯酸类树脂柱、丙烯腈类树脂柱等，本领域技术人员能够适当地设定。其中，从能够进一步提高根皮素糖苷类的纯度的观点考虑，优选使用芳香族类树脂柱，更优选使用苯乙烯-二乙烯基苯类的芳香族类树脂柱。作为苯乙烯-二乙烯基苯类的芳香族类树脂柱，例如能够举出大孔吸附树脂(SEPABEADS，注册商标，以下相同)SP70、甲醛类树脂(DIAION，注册商标，以下相同)HP20(三菱化学株式会社制造)等。

在第一洗脱处理中，将0.1％以上且低于45％、优选5％以上且低于45％、更优选15％以上且40％以下、进一步优选20％以上40％以下的乙醇作为流动相而流动。此时，关于洗脱液的容量，例如能够设为空间速度SV(空间速度(space velocity，CV/h))＝1～3、CV(柱体积(树脂容量))＝1～4。

另外，对洗脱液的pH值，也没有特别限制，例如能够设为pH7以下。

在第二洗脱处理中，将45％以上且100％以下、优选50％以上且80％以下、更优选60％以上且80％以下的乙醇作为流动相而流动。此时，关于洗脱液的容量，例如能够设为SV＝1～3、CV＝2以上。另外，对洗脱液的pH值，也没有特别限制，例如能够设为pH7以下。

例如，对苹果浓缩果汁(Brix(白利度)60～70左右)进行3倍稀释，并向SP70柱供给该果汁，由此将根皮素糖苷类吸附于柱。具体地说，设为SV＝1并将果汁全部通液。接着，以SV＝1、CV＝1.5进行通水，清洗柱。在柱出口确认了Brix(白利度)降低至0.2％以下的情况之后，以SV＝1、CV＝3通液37％的乙醇(第一洗脱处理)，然后，以SV＝1、CV＝3通液70％的乙醇(第二洗脱处理)。

此外，对于吸附于柱的对象，以苹果汁为例子进行了说明，但并不限于此，例如，也可以是从苹果汁等得到的多酚粗制品。该多酚粗制品能够通过公知的方法得到，例如，能够通过在将包含于苹果汁的成分吸附于合成吸附树脂柱之后，使其供给至将乙醇的比例为整个溶液的5～40％(V/V)的水与乙醇的混合溶液作为流动相的洗脱处理而得到。

关于所得到的根皮素糖苷，除了可以直接使用以外，也可以在经过浓缩/干燥等工序之后，用于下一个工序。

对于本实施方式涉及的根皮素糖苷，没有特别限制，但能够为了制造包含根皮素糖苷的医药品、准药品(Quasi-Drugs)、饮食品等而使用。例如，能够将本实施方式涉及的根皮素糖苷作为有效成分使用的同时，与赋形剂、粘结剂、稳定剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、悬浮剂、涂层剂以及其他任意成分适当地混合并按照规定的方法使其制剂化。作为剂型，能够举出片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、糖浆剂等，从容易摄取的观点考虑，优选为片剂。

或者，虽不受特别限制，但在作为饮食品的形态进行制造时，除了通常的饮食品以外，也可以是特定保健用食品等特殊用途食品或营养功能食品等。作为饮食品的具体例，例如能够举出营养辅助食品(片剂形态的营养增补剂(supplement)等)、清凉饮料、酸奶、果冻、糖果、面包、饼干、梳打饼(cracker)、比萨饼皮、黄油蛋糕、冰激凌、橡皮糖、口香糖等糕点/面包类、流食、患者用食品等。

另外，对于饮料，例如能够设为罐装饮料。另外，也可以构成为添加酒精的酒精饮料。

此外，不局限于用于人类的食品等，例如，也可以添加到家禽用的饲料中。

以上，根据本实施方式，能够提供一种通过进一步提高其纯度而能够精炼根皮素糖苷类的新技术。

在本实施方式中，根皮素糖苷通过在对来源于苹果等的多酚进行柱精炼之后，洗出吸附于树脂的根皮素糖苷而得到。以往，通过使用40％左右的乙醇进行一次洗脱处理来精炼根皮素糖苷，但在本实施方式的方法中，根据以往没有过的想法、即有效利用迄今为止按废物处理的馏分的方法进行制造。使用此方法得到的根皮素糖苷是通过现有技术无法得到的高纯度的根皮素糖苷馏分。由于在通常的苹果汁中所含的根皮素糖苷的浓度下无法得到降低尿酸值等的药理作用，因此即使溶解提高了根皮素糖苷浓度的多酚馏分提取材料，并调整至高浓度，但因夹杂物的影响而在味道方面(多为苦味、涩味)存在问题，并且存在还产生褐变等的问题。另一方面，使用本实施方式的高纯度根皮素糖苷而首次可以制造出得到充分药理作用的饮料。

作为在苹果多酚中降低味道或引起褐变的物质，已知有绿原酸和原花青素类。

此外，在本说明书中，绿原酸是指3-咖啡酰奎宁酸。

另外，原花青素类是指儿茶素类的n聚合物(n>1，但n为整数)或者它们的总称，不包含n＝1的儿茶素类。作为儿茶素类，包括儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素，但不限于此。作为原花青素类，只要是儿茶素类的n聚合物或者它们的混合物，则不受特别限制。另外，也可以是天然的原花青素类，还可以是被合成的原花青素类。

绿原酸能够根据实施例1所述的定量方法进行定量，另外，原花青素类能够根据日本专利文献特开2009-156813号公报所述的方法进行定量。

例如，根据本实施方式，能够构成如下饮料：将根皮素糖苷类、优选根皮苷以及根皮素木糖葡萄糖苷以总含量包含60mg/l以上，绿原酸的含量为120mg/l以下和/或原花青素类的含量为720mg/l以下。即，根据本实施方式的精炼方法，能够将绿原酸的含量设为120mg/l以下和/或将原花青素类的含量设为720mg/l以下，并将根皮素糖苷类的含量设为60mg/kg以上，因此，能够提供一种通过抑制苦味、涩味而改善味道，还抑制褐变的包含更多根皮素糖苷的饮料。

另外，以往，通过一次柱处理未能对根皮素糖苷类进行充分的精炼，因此为了构成针对血液中的尿酸浓度下降具有效果的片剂形态的营养增补剂，需要反复进行多次精炼。其结果为，从成本等方面考虑，实际上未能制造出该营养增补剂。

另一方面，根据本实施方式，能够得到更高纯度的根皮素糖苷类，因此能够制造出更廉价的营养增补剂。即，根据本实施方式，能够有助于实现包含能够降低血液中的尿酸浓度的根皮素糖苷类的营养增补剂。

例如，根据本实施方式，能够提供一种食品(固体食品)，该食品为将根皮素糖苷类、优选根皮苷和根皮素木糖葡萄糖苷以总含量包含25g/kg以上，绿原酸的含量为50g/kg以下和/或原花青素类的含量为300g/kg以下的片剂等固体。

另外，苦味、涩味更加得到抑制而进一步改善味道，且更加抑制褐变，因此，优选为如下固体食品：将根皮素糖苷类、优选根皮苷和根皮素木糖葡萄糖苷以总含量包含25g/kg以上，绿原酸的含量为20g/kg以下和/或原花青素类的含量为150g/kg以下。

实施例

根据以下的实施例，进一步具体说明本发明，但本发明不限于此。

实施例1

苹果多酚粗制品的制备

将从苹果(富士)的幼果得到的苹果汁供给到填充有SEPABEADS SP-70(三菱化学株式会社制造)的柱处理。使用纯水清洗了被吸附的化合物之后，使用乙醇(EtOH)-水(H₂O)(37：63，w/w(重量比，weight in weigh))进行洗脱。通过浓缩洗脱馏分而进行喷雾干燥，得到粉末状的多酚提取物。

第一洗脱处理和第二洗脱处理

将10g多酚提取物溶解于水之后，使用氢氧化钠水溶液调整至PH7.0。将多酚水溶液供填充有Diaion HP-20(180mL，三菱化学株式会社制造)的柱使用，并使用720mL水进行清洗。

回收未被吸附的馏分，通过盐酸(HCI)调整至PH2.7，并通过固相萃取进行脱盐。

被吸附的化合物通过使用水与乙醇进行阶段洗脱而分馏。

首先，流通21％的乙醇(v/v、540mL)流动，并进行洗脱处理(第一洗脱处理)。

接着，流通70％的乙醇(v/v、360mL)流动，并进行洗脱处理(第二洗脱处理)。

进行浓缩、冻结干燥，并将所得到的各馏分作为非晶粉末而得到(未吸附的馏分(PA)：2.47g、24.7％，通过第一洗脱处理得到的馏分(FV)：4.83g、48.2％，通过第二洗脱处理得到的馏分(DC)：1.95g、19.5％)。

定量分析

在以下的条件下，利用反相超高效液相色谱法(RP-UPLC：Reversed Phase Ultra-high Performance Liquid Chromatography)，对所得到的各馏分中的内含物的比例进行了分析。结果如表1所示。

柱：ACQUITY UPLC(商标)BEH(乙烯桥联杂交，Ethylene Bridged Hybrid)C18(沃特世公司制造)1.7μmφ2.1x100mm(配备VANGUARD BEH C18保护住(沃特世公司制造))

流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA：trifluoroacetic acid)水溶液

流动相B：乙腈(acetonitrile)

流速：0.5mL/min

柱温度：45℃

注入量：2μL

二极管阵列检测：280nm、305nm

荧光检测：激发光波长(Ex：Excitation wavelength)为276nm、发射光波长(Em：Emission wavelength)为316nm

梯度程序：0-3分钟，8％的流动相B；3-7分钟，8-40％的流动相B；7-8分钟，40-90％的流动相B；8-10分钟，90％的流动相B；10-13分钟，8％的流动相B

[表1]

AP：供给至洗脱处理的多酚提取物

从表1能够理解到，在通过第二洗脱处理得到的馏分(DC)中，与其他馏分相比，能够得到纯度非常高的根皮素糖苷类(二氢查耳酮)。

实施例2

对从苹果(富士)的幼果得到的苹果浓缩果汁(Brix60～70)60g进行3倍稀释，并以SV＝1向填充有60mL的SEPABEADS SP-70(三菱化学株式会社制造)的柱全部通液。接着，以SV＝1、CV＝1.5通液纯水，清洗柱。在确认柱出口的Brix降低至0.2％以下之后，以SV＝1、CV＝3通液EtOH-H₂O(37：63，w/w)(第一洗脱处理)，然后，以SV＝1、CV＝3通液70％的乙醇(v/v)(第二洗脱处理)。对洗脱液进行浓缩、冻结干燥，并将所得到的各洗脱液获取为粉末(通过第一洗脱处理得到的馏分(第一馏分)：7.5g、8.3％，通过第二洗脱处理得到的馏分(第二馏分)：0.92g、0.09％)。

定量分析

在与实施例1相同的条件下，利用RP-UPLC，对所得到的各馏分进行了分析。所得到的各馏分中的内含物的比例如表2所示。

[表2]

从表2能够理解到，在通过第二洗脱处理得到的馏分中，与第一洗脱馏分相比，能够得到纯度非常高的根皮素糖苷类(二氢查耳酮)。

实施例3

在与实施例2相同的条件下，进行了洗脱处理。

比较例1

除了仅实施一次洗脱处理、且以SV＝1、CV＝2通液80％的EtOH(80％的EtOH洗脱馏分；2.5g)以外，在与实施例2相同的条件下进行了处理。

表3表示实施例3与比较例1中所得到的各馏分中的内含物的比例。关于定量分析，通过与实施例1和2相同的方法进行。

[表3]

在实施例3中，进行了第二洗脱的馏分(第二馏分)的根皮素糖苷类为68.7％，与此相对，在比较例1中使用80％的EtOH而进行了一次洗脱的提取物的根皮素糖苷类为10.7％。

感官评价和吸光度测定

分别使用在实施例3中得到的第一洗脱馏分与第二洗脱馏而制造饮料和固体组合物，供感官评价使用。此外，关于原花青素类，根据日本专利文献特开2009-156813号公报所述的方法确定了其含量。

(1)饮料的制备

以表4的组成比，在1L的水中加入第一洗脱馏分、第二洗脱馏分、根皮苷二水合物试剂(phloridzin dihydrate，西格玛(SIGMA)，7061-54-3)，供感官评价使用。

将使用第一洗脱馏分而得到的饮料作为比较例2，将使用第二洗脱馏分而得到的饮料作为实施例4。

[表4]

(2)营养增补剂(固体组合物)的制备

加入第一洗脱馏分、第二洗脱馏分、根皮苷二水合物试剂(phloridzindihydrate，西格玛(SIGMA)，7061-54-3)，供感官评价使用。

[表5]

(3)感官评价

针对能够识别基本5味的专门小组成员6名，实施了关于“苦味”、“涩味”、“颜色(浓度)”、“褐色(是否为褐色)”的强度的7阶段评价并使他们自由回答。对于“苦味”、“涩味”，将最强的设为7，最弱的设为1。对于颜色，将最深的设为7，最浅的设为1。对于褐色，将能够识别为最接近褐色的设为7，将能够识别为最不接近褐色的设为1。另外，在7阶段评价中，将尺度的间隔假定为等间隔。

在评价各样品期间，为了恢复感觉疲劳，使用水和梳打饼，一边清口一边争取了3分钟的间隔。每一个样品提取50mL或5g，饮用顺序通过事先决定而取得了均衡。

图1表示饮料的结果，图2表示固体组合物的结果。

从图1能够理解到，实施例4的饮料相对于比较例2的饮料，在所有组之间具有显著差异。由此能够理解到，能够将与以往相比更没有苦味、涩味、且颜色以及褐色较浅的高浓度含有根皮苷的饮料作为实施例而制造出。

另外，从图2能够理解到，实施例5的营养增补剂相对于比较例3的营养增补剂，在所有项目中也具有显著差异。由此能够理解到，能够将与以往相比更没有苦味、涩味，且颜色以及褐色浅的高浓度含有根皮苷的营养增补剂作为实施例而制造出。

(4)吸光度测定

对使用实施例4、比较例2、以及根皮苷二水合物试剂制造的饮料进行了吸光度测定。表6表示其结果。结果表示实施例4的饮料与比较例2的饮料相比褐色更浅。

[表6]