阅读说明：本技术 分离介质及其制备方法和应用 (Separation medium, preparation method and application thereof ) 是由 吕小林 胡新妹 杨克 黄学英 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种分离介质及其制备方法和应用。该分离介质具有如式I所示结构：<Image he="227" wi="700" file="DDA0002180825440000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中,SP为介质,R为间隔臂,rProtein A-cys为重组蛋白A。本发明提供的新的分离介质,其动态结合载量达到50mg/mL,分离效率高、分离效果好、成本低,适合工业化大规模分离纯化抗体及Fc融合蛋白。(The invention relates to a separation medium, a preparation method and application thereof. The separation medium has a structure as shown in formula I: wherein SP is a medium, R is a spacer arm, and rProtein A-cys is recombinant protein A. The novel separation medium provided by the invention has the advantages of dynamic binding capacity of 50mg/mL, high separation efficiency, good separation effect and low cost, and is suitable for large-scale industrialized separation and purification of the antibody and the Fc fusion protein.)

分离介质及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及填料合成技术领域，特别是涉及一种分离介质及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白A(Protein A)是存在于金黄色葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，其能与抗体的Fc区紧密结合，天然Protein A分子具有5个能与Fc区结合的同源结构域(E、D、A、B、C)，分子量为42kDa。在1978年，将Protein A作为亲和配体固定在介质上形成的Protein A填料首次实现商品化，并用于抗体亲和层析。第一个治疗性抗体Orthoclone于1986年批准上市，在纯化工艺中就是利用了Protein A层析作为捕获步骤。随着抗体药物的不断发展，用于抗体捕获阶段的Protein A填料也得到了快速发展，在随后的FDA申请中，86％的抗体在捕获步骤中使用了Protein A填料。

目前，将Protein A固定到介质上的方法分为两种：一是通过Protein A分子赖氨酸残基中的氨基与基质共价键合来实现，由于Protein A分子中有多个赖氨酸，因此这种方法被称为多点键合；二是利用基因工程对Protein A分子进行突变修饰，在其肽链的C端增加一个半胱氨酸(标记为rProtein A-cys)，然后通过巯基与介质共价键合来实现ProteinA分子的固定，这种方法被称为单点键合。虽然这两种方法都能实现Protein A分子的固定，但多点键合会将Protein A牢牢固定在介质上，影响Protein A与抗体分子的结合，而单点键合则不会有这种情况。

通过单点键合的方式将rProtein A-cys固定于介质表面一般是利用环氧基与巯基的反应来实现，介质表面的环氧基与巯基反应时一般需要较高的温度(大于37℃)，这会对rProtein A-cyss配体的活性造成不利影响。

发明内容

基于此，有必要针对传统的将rProtein A-cys固定于介质表面的方法会对rProtein A-cys配体的活性造成不利影响的问题，提供一种分离介质及其制备方法和应用。

一种分离介质，具有如式I所示结构：

其中，SP为介质，R为间隔臂，rProtein A-cys为重组蛋白A。

在其中一个实施例中，所述SP为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或琼脂糖微球；所述R的结构为或

本发明提供一种分离介质的制备方法，包括如下步骤：

在基础介质表面修饰氨基，得到中间体II，

用碘乙酸或者溴乙酸活化所述中间体II的氨基，得到中间体III，

将所述中间体III与rProtein A-cys偶联，得到式I所示的分离介质；

其中，SP为介质，R为间隔臂，rProtein A-cys为重组蛋白A。

在其中一个实施例中，所述基础介质为表面具有环氧基或邻二醇羟基的微球，所述微球为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或琼脂糖微球。

在其中一个实施例中，在基础介质表面修饰氨基所采用的修饰剂选自如下有机胺：乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺和3,3'-二氨基二丙胺中的至少一种。

在其中一个实施例中，在基础介质表面修饰氨基的步骤为：

若所述基础介质表面具有环氧基，将所述基础介质与所述有机胺发生开环反应得到中间体II，所述基础介质与所述有机胺的质量比为100:(20-80)；或者，若所述基础介质表面具有邻二醇羟基，将基础介质表面的邻二醇羟基氧化成醛基，然后与所述有机胺反应生成席夫碱，再将席夫碱还原得到中间体II，所述基础介质与所述有机胺的用量比为100g:(0.1-0.3)mol。

在其中一个实施例中，用碘乙酸或者溴乙酸活化所述中间体II的氨基的步骤中，所述碘乙酸或者溴乙酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及所述中间体II的质量比为(8-15):(10-20):100。

在其中一个实施例中，将所述中间体III与rProtein A-cys偶联的具体步骤为：以每100g所述中间体III计，在7.1g-17.8g Na₂SO₄的作用下，控制pH值为7.5-8.5，每100g所述中间体III与0.5g-5g的rProtein A-cys在100mL-200mL磷酸盐缓冲溶液中反应2h-16h，保留固体产物。

在其中一个实施例中，还包括向偶联rProtein A-cys后的产物中加入封端剂进行端基封闭反应的步骤。

本发明提供一种所述的分离介质或任一项所述的分离介质的制备方法制得的分离介质在分离纯化中的应用。

本发明提供一种新的分离介质，其动态结合载量达到50mg/mL，分离效率高、分离效果好、成本低，适合工业化大规模分离纯化抗体及Fc融合蛋白。

且，本发明还开创了一种新的将rProtein A-cys固定于介质表面的方法，首先在基础介质上修饰氨基，然后采用碘乙酸或者溴乙酸将氨基活化得到中间体III，中间体III上的碘乙酰基或者溴乙酰基比环氧基的活性高，因此，在偶联rProtein A-cys时，中间体III上的碘乙酰基或者溴乙酰基与rProtein A-cys配体上的巯基反应时效率更高。且在偶联时，由于中间体III上的氮原子带有正电荷，而rProtein A-cys表面带有负电荷，因此，中间体III具有使rProtein A-cys向介质表面靠近的作用，使得偶联效率达85％以上。另外，偶联反应在室温条件下进行，很大程度上减弱了对rProtein A-cys配体的活性造成的不利影响，从而提高分离效率。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供一实施方式的一种分离介质，具有如式I所示结构：

其中，SP为介质，介质为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或琼脂糖微球。R为间隔臂，用于连接-NH-与介质SP，其结构为： rProtein A-cys为重组蛋白A，rProtein A-cys是Protein A分子进行突变修饰，在其肽链的C端增加一个半胱氨酸。

本发明还提供一种分离介质的制备方法，包括如下步骤：

S10、在基础介质表面修饰氨基，得到中间体II，

在其中一实施方式中，基础介质为表面具有环氧基或邻二醇羟基的微球，微球为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或琼脂糖微球。

在其中一实施方式中，在基础介质表面修饰氨基所采用的修饰剂选自如下有机胺：乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺和3,3'-二氨基二丙胺中的至少一种。

在其中一实施方式中，所得中间体II中，SP为介质，介质为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或琼脂糖微球。

当采用上述有机胺在基础介质表面进行修饰氨基时，有机胺的其中一个氨基与基础介质表面的基团反应，使得其与介质相连，间隔臂为R，结构为 另一个氨基即本步骤中在基础介质表面修饰的氨基，用于下一步的反应。

在其中一实施方式中，在基础介质表面修饰氨基的步骤为：

若所述基础介质表面具有环氧基，将基础介质与所述有机胺发生开环反应得到中间体II，所述基础介质与所述有机胺的质量比为100:(20-80)；

具体步骤为：以每100g的基础介质计，每100g基础介质与100g20wt％-80wt％的有机胺溶液反应4h-16h，保留固体产物，然后加入200mL0.4M-0.6M硫酸溶液，在30℃-50℃的温度下反应2-5h，保留固体产物。上述反应得到的固体产物用去离子水洗涤至中性。

若所述基础介质表面具有邻二醇羟基，将基础介质表面的邻二醇羟基氧化成醛基，然后与有机胺反应生成席夫碱，再将席夫碱还原得到中间体II，所述基础介质与所述有机胺的用量比为100g:(0.1-0.3)mol。

具体步骤为：以每100g的基础介质计，每100g基础介质与100mL 0.1M-0.3M NaIO₄溶液反应1h-3h，保留固体产物，然后加入含有1M-3M有机胺和0.2g-1g NaCNBH₃的0.1M磷酸盐缓冲溶液100mL反应2h-5h，保留固体产物。同样的，反应得到的固体产物用去离子水洗涤至中性。

S20、用碘乙酸或者溴乙酸活化中间体II的氨基，得到中间体III，

在其中一实施方式中，用碘乙酸或者溴乙酸活化中间体II的氨基的步骤中，碘乙酸或者溴乙酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及中间体II的质量比为(8-15):(10-20):100。

在其中一实施方式中，用碘乙酸或者溴乙酸活化中间体II的氨基的具体步骤为：以每100g上述中间体II计，每100g上述中间体II与含8g-15g碘乙酸的0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液100mL(pH值为4.7-5)混合，加入10g-20g EDC，室温避光反应2h-5h，保留固体产物。

S30、将中间体III与rProtein A-cys偶联，得到式I所示的分离介质；

在其中一实施方式中，将中间体III与rProtein A-cys偶联的具体步骤为：以每100g中间体III计，在7.1g-17.8g Na₂SO₄的作用下，控制pH值为7.5-8.5，每100g中间体III与0.5g-5g的rProtein A-cys在100mL-200mL磷酸盐缓冲溶液中反应2h-16h，保留固体产物。

更具体地，以每100g中间体III计，每100g上述中间体III、7.1g-17.8g Na₂SO₄和100mL含10mg/mL-25mg/mL rProtein A-cys、8mM-10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲溶液室温避光反应2h-16h，保留固体产物。

在上一实施方式中，反应所得固体产物用pH值为7.0的0.1M磷酸盐缓冲溶液洗涤。

在其中一实施方式中，还包括向偶联rProtein A-cys后的产物中加入封端剂进行端基封闭反应的步骤。

具体地，端基封闭反应的步骤为：以每100g分离介质I计，加入100mL含20mM-70mM封端剂的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，在室温条件下搅拌反应0.5h-2h，保留固体产物，依次用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)、100mL 1M NaCl、100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)洗涤。

在其中一实施方式中，封端剂为巯基乙醇、巯基甘油和半光氨酸的至少一种。

本发明还提供上述的分离介质或任一项上述的分离介质的制备方法制得的分离介质在分离纯化中的应用。

以下为具体实施例。

以下实施例中，动态结合载量(DBC)的测试条件为：20mM PBS+150mM NaCl+2mg/mL人免疫球蛋白，pH7.4、4min结合时间、10％流穿时。

实施例1

本实施例采用的聚甲基丙烯酸酯微球(粒径为30μm，孔径为100nm，表面含有大量环氧基)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司，其余原料均为市售。

称取100g聚甲基丙烯酸酯微球，转移至500mL三口烧瓶中，加入100g50wt％的3,3'-二氨基二丙胺水溶液，在室温下，100rpm机械搅拌反应16h，反应结束后用去离子水抽滤洗涤微球至中性，然后加入300mL 0.5M H₂SO₄溶液，在40℃条件下，100rpm机械搅拌反应4h，反应结束后用去离子水抽滤洗涤微球至中性。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含12g碘乙酸的0.1M2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液(pH值为4.7)、10g EDC，在室温且避光条件下，100rpm机械搅拌反应2h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含18mg/mL rProtein A-cys和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，接着加入14.2g Na₂SO₄，在室温且避光条件，100rpm下机械搅拌反应16h，结束后抽滤微球并收集滤液，接着用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球10次并收集前三次滤液，用HPLC检测反应前后rProteinA-cys配体的质量差并计算偶联量。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含50mM巯基乙醇的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，在室温条件下，100rpm机械搅拌反应0.5h，结束后依次用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)、100mL 1M NaCl、100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球各5次，即得分离介质。

本实施例制备的分离介质，其rProtein A-cys配体偶联量为15.0mg/g介质，动态结合载量(DBC)为50mg/mL。

实施例2：

本实施例采用的聚甲基丙烯酸酯微球(粒径为30μm，孔径为100nm，表面含有大量邻二醇羟基)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司，其余原料均为市售。

称取100g聚甲基丙烯酸酯微球，转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL0.2M NaIO₄溶液，室温下，100rpm机械搅拌反应1.5h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤介质，然后加入100mL含1.52M 3,3'-二氨基二丙胺的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.2)，同时加入0.63g NaCNBH₃，室温下，100rpm机械搅拌反应4h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含10g碘乙酸的0.1M2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液(pH值为4.7)、10g EDC，在室温且避光条件下，100rpm机械搅拌反应5h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含15mg/mL rProtein A-cys和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，接着加入14.2g Na₂SO₄，在室温且避光条件，100rpm下机械搅拌反应10h，结束后抽滤微球并收集滤液，接着用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球10次并收集前三次滤液，用HPLC检测反应前后rProteinA-cys配体的质量差并计算偶联量。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含50mM巯基乙醇的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，在室温条件下，100rpm机械搅拌反应0.5h，结束后依次用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)、100mL 1M NaCl、100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤介质各5次，即得分离介质。

本实施例制备的分离介质，其rProtein A-cys配体偶联量为13.0mg/g介质，动态结合载量(DBC)为40mg/mL。

实施例3：

本实施例采用的聚甲基丙烯酸酯微球(粒径为60μm，孔径为100nm，表面含有大量环氧基)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司，其余原料均为市售。

称取100g聚甲基丙烯酸酯微球，转移至500mL三口烧瓶中，加入100g质量分数为25％的3,3'-二氨基二丙胺水溶液，在室温下，100rpm机械搅拌反应16h，反应结束后用去离子水抽滤洗涤介质至中性，然后加入300mL 0.5M H₂SO₄溶液，在40℃条件下，100rpm机械搅拌反应4h，反应结束后用去离子水抽滤洗涤介质至中性。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含12g碘乙酸的0.1M2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液(pH值为4.7)、10g EDC，在室温且避光条件下，100rpm机械搅拌反应2h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含12mg/mL rProtein A-cys和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，接着加入14.2g Na₂SO₄，在室温且避光条件，100rpm下机械搅拌反应16h，结束后抽滤微球并收集滤液，接着用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球10次并收集前三次滤液，用HPLC检测反应前后rProteinA-cys配体的质量差并计算偶联量。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含50mM巯基乙醇的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，在室温条件下，100rpm机械搅拌反应0.5h，结束后依次用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)、100mL 1M NaCl、100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球各5次，即得分离介质。

本实施例制备的分离介质，其rProtein A-cys配体偶联量为10.5mg/g介质，动态结合载量(DBC)为35mg/mL。

实施例4：

本实施例采用的琼脂糖微球(粒径为60μm，6％高度交联，表面含有大量邻二醇羟基)；生产厂家为苏州赛分科技有限公司，其余原料均为市售。

量取100mL琼脂糖微球，转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL 0.2M NaIO₄溶液，室温下，100rpm机械搅拌反应1.5h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球，然后加入100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液，含1.52M的3,3'-二氨基二丙胺(pH值为7.2)，同时加入0.63g NaCNBH₃，室温下，100rpm机械搅拌反应5h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含10g碘乙酸的0.1M2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH值为4.7)、10g EDC，在室温且避光条件下，100rpm机械搅拌反应5h，反应结束后用至少10倍体积去离子水抽滤洗涤微球。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL含20mg/mL rProtein A-cys和10mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为8.5)，接着加入14.2g Na₂SO₄，在室温且避光条件，100rpm下机械搅拌反应10h，结束后抽滤介质并收集滤液，接着用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球10次并收集前三次滤液，用HPLC检测反应前后rProteinA-cys配体的质量差并计算偶联量。

将所得微球转移至500mL三口烧瓶中，加入100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液，包含50mM巯基乙醇，pH值为8.5，在室温条件下，100rpm机械搅拌反应0.5h，结束后依次用100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)、100mL 1M NaCl、100mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)抽滤洗涤微球各5次，即得分离介质。

本实施例制备的分离介质，其rProtein A-cys配体偶联量为18.0mg/g介质，动态结合载量(DBC)为32mg/mL。

对比例1

本对比例1的分离介质的制备方法同实施例1，区别在于，加入100g 10wt％的3,3'-二氨基二丙胺水溶液，最终rProtein A-cys配体的偶联量减少为5.5mg/g介质，动态结合载量(DBC)降低到15mg/mL。

对比例2

本对比例1的分离介质的制备方法同实施例1，区别在于，加入4.26g Na₂SO₄，rProtein A-cys配体的偶联量减少为4.0mg/g介质，动态结合载量(DBC)降低到10mg/mL。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。