阅读说明：本技术 一种黄曲霉毒素b1和辣椒素的同步富集净化方法 (Synchronous enrichment and purification method of aflatoxin B1 and capsaicin ) 是由 喻理 李培武 马飞 张兆威 王督 胡小风 姜俊 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黄曲霉毒素B1和辣椒素的同步富集净化方法。该方法包括如下步骤：将以不产毒的黄曲霉真菌孢子培养获得的负载还原氧化石墨烯的菌球与铁的前驱物混合,以抗坏血酸作为还原剂,水热法制备得到磁性复合纳米材料,将该材料加入到样品提取液中充分混合,吸附黄曲霉毒素B1和辣椒素；用磁铁吸附磁性复合纳米材料,去掉样品提取液；加入净化液,与磁性复合纳米材料充分混匀,用磁铁吸附磁性复合纳米材料,去掉净化液；最后加入洗脱液,充分混匀磁性复合纳米材料,用磁铁吸附磁性复合纳米材料,收集的洗脱液浓缩后即获得含有目标物的浓缩液。本发明方法操作简便,耗时短,成本低廉,能同步富集黄曲霉毒素B1和辣椒素。(The invention discloses a synchronous enrichment and purification method of aflatoxin B1 and capsaicin. The method comprises the following steps: mixing bacterium balls loaded with reduced graphene oxide and obtained by culturing non-toxic aspergillus flavus fungal spores with a precursor of iron, taking ascorbic acid as a reducing agent, preparing a magnetic composite nano material by a hydrothermal method, adding the material into a sample extracting solution, fully mixing, and adsorbing aflatoxin B1 and capsaicin; adsorbing the magnetic composite nano material by using a magnet, and removing a sample extracting solution; adding the purifying solution, fully and uniformly mixing with the magnetic composite nano material, adsorbing the magnetic composite nano material by using a magnet, and removing the purifying solution; and finally, adding the eluent, fully and uniformly mixing the magnetic composite nano material, adsorbing the magnetic composite nano material by using a magnet, and concentrating the collected eluent to obtain the concentrated solution containing the target object. The method has the advantages of simple operation, short time consumption and low cost, and can synchronously enrich aflatoxin B1 and capsaicin.)

一种黄曲霉毒素B1和辣椒素的同步富集净化方法

技术领域

本发明属于农产品质量安全检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1 和辣椒素的同步富集净化方法。

背景技术

经过政府征集，以及全国各相关研究机构学者们对餐厨废弃油脂的大量研究，发现由于国人的饮食特点，辣椒素类物质会残余在废弃油脂中，又因为辣椒素类物质的稳定特性，它们往往不易被移除，成为餐厨废弃油脂标志物之一。此外，餐厨废弃油脂由于经常从地沟类环境提取，因此也极易受黄曲霉毒素污染。如果能同步检测出辣椒素和黄曲霉毒素，那么其被判定为“餐厨废弃油脂”的可能性将极大。因此，研究同步检测辣椒素和黄曲霉毒素的检测方法具有重要意义。辣椒素是一种由辣椒的果实中分离而得到的辣椒碱，对其测定可以作为辣椒及其制品质量的重要依据，也可以作为判定是否是废弃油脂的标志物。黄曲霉毒素B1是所有黄曲霉毒素中毒性最强的一种，也是在中国最常见并含量较高的一种。因此，研究一种黄曲霉毒素B1和辣椒素的同步检测方法，对油脂质量安全和保障国人健康意义重大。

由于植物油脂中上述两种目标物含量都比较低，因此，在样品液进入分析仪器之前，必须将上述目标物富集净化。目前对黄曲霉毒素B1和辣椒素的富集净化主要利用免疫亲和柱，但是此类净化柱的单价较高，不能重复使用。对黄曲霉毒素B1和辣椒素同时具有富集净化功能的廉价固相萃取材料还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素B1和辣椒素的同步富集净化方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种黄曲霉毒素B1和辣椒素的同步富集净化方法，该方法包括如下步骤：

将以不产毒的黄曲霉真菌孢子培养获得的负载还原氧化石墨烯的菌球与铁的前驱物混合，以抗坏血酸作为还原剂，水热法制备得到磁性复合纳米材料；将磁性复合纳米材料加入到样品提取液中充分混合，吸附黄曲霉毒素B1和辣椒素；磁吸附富集黄曲霉毒素B1和辣椒素后的磁性复合纳米材料；加入净化液，充分混匀磁性复合纳米材料，用磁铁吸附磁性复合纳米材料，去掉净化液；最后加入洗脱液，充分混匀磁性复合纳米材料，用磁铁吸附磁性复合纳米材料，收集的洗脱液浓缩后即获得含有目标物的浓缩液。

按上述方案，所述的磁性复合纳米材料是通过如下方法制备得到的：

步骤(1)：将不产毒的黄曲霉真菌孢子培养得到菌丝球；

步骤(2)：将上述制备的菌丝球，转入氧化石墨烯水溶液中，摇床室温震荡，待菌丝完全吸附氧化石墨烯后，过滤出菌球洗涤去掉游离的氧化石墨烯片层至滤液成无色透明；

步骤(3)：将步骤(2)得到的负载还原氧化石墨烯的菌球与铁的前驱物混合，以抗坏血酸作为还原剂，水热法制备得到磁性复合纳米材料。

按上述方案，所述的磁性复合纳米材料和样品提取液中的质量体积比为 5～10mg/mL，优选10mg/mL。

按上述方案，所述的样品提取液为乙醇水或甲醇水溶液，甲醇或乙醇的体积百分比为3～10％，优选甲醇水溶液。

按上述方案，所述的净化液为去离子水，磁性复合纳米材料在净化液中的浓度为20～50mg/mL。

按上述方案，所述的洗脱液为90％以上的甲醇水或乙腈水，优选为0.1％甲酸的甲醇水溶液或0.1％甲酸的乙腈水溶液(甲醇或乙腈：水：甲酸＝9：1： 0.01)。

按上述方案，所述步骤(1)的培养基为经过115℃灭菌20min的液体沙氏培养基；所述的真菌孢子在液体培养基中的浓度为2×10⁴～5×10⁵个/ml；所述的培养条件：28℃摇床上振荡培养4～5d。

按上述方案，培养结束后，用200～400目的尼龙布将菌丝球过滤出来，用水冲洗干净菌球，转入无水乙醇洗涤5～7次，烘干，得到菌丝球备用。

按上述方案，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为4～10mg/mL，摇床室温震荡 1～3d。

按上述方案，所述的步骤(3)为：以三氯化铁或六水合三氯化铁和碳酸氢钠为原料，抗坏血酸为还原剂，水热反应合成负载还原氧化石墨烯的Fe₃O₄磁性菌球复合材料,三氯化铁或六水合三氯化铁以三氯化铁计量，所述负载还原氧化石墨烯的菌球：三氯化铁：抗坏血酸的质量比为1～1.5：4.8：1.32。

上述碳酸氢钠的最佳用量为按三氯化铁：碳酸氢钠的质量比计为4.86： 7.56，即两者摩尔比为理论摩尔比1：3，可使六水合三氯化铁或三氯化铁充分转化生成Fe(OH)₃沉淀，在抗坏血酸作用下转化为Fe₃O₄磁性菌球。

按上述方案，步骤(3)的水热反应条件为：140～160℃反应6～8h。

按上述方案，待水热反应结束后，将反应釜中的菌球用尼龙布滤出，先用大量水冲洗，再用无水乙醇冲洗5-7次，以除去易溶于有机溶剂的杂质，再改用去离子水冲洗，最后进行冷冻干燥得到。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明通过多元材料的集成提供的磁性复合纳米材料，可以作为同步富集黄曲霉毒素B1和辣椒素的磁固相萃取材料，实现了多元目标对象的同步快速检测，且具有磁响应快，易溶于有机溶剂，富集效率高等特点。进而提供的净化富集方法可用于黄曲霉毒素B1和辣椒素的同步富集，操作简单，耗时短，实用性强，特别适合用于餐厨废弃油脂的鉴别，具有广泛的应用前景。

(2)磁固相萃取材料制备成本低廉，制备条件绿色温和，价钱低于现有的亲和柱，无需填料成柱。

附图说明

图1为本发明的净化流程图。

图2为不同溶剂富集体系对合成磁性复合纳米材料对黄曲霉毒素B1和辣椒素吸附率的影响。

图3为富集体系中不同合成的磁性复合纳米材料的用量对黄曲霉毒素B1 和辣椒素回收率的影响。

图4为不同洗脱剂对黄曲霉毒素B1和辣椒素回收率的影响。

图5(a)-(c)为不同放大倍数的磁性复合纳米材料的扫描电镜图，(e)为磁性复合纳米材料的XRD图，(d)为黄曲霉真菌孢子培养获得的菌球负载氧化石墨烯的菌球的SEM图。从图5可见，制备的磁性复合纳米材料呈微米球状，直径在3mm左右，由菌丝组成，菌丝直径在2μm左右，长度超过20μm，进一步放大后发现菌丝体上有负载大量细沙状颗粒，应该是Fe₃O₄磁性颗粒纳米材料。

具体实施方式

实施例一

第一步，制备磁性复合纳米材料：

取50g液体沙氏培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)溶解于1L蒸馏水中，115℃高压灭菌20min，备用。取一定体积的不产毒的黄曲霉真菌孢子液加入到50mL灭菌后的液体沙氏培养基中，使得真菌孢子在液体培养基中的浓度为5×10⁵个/mL，将锥形瓶密封后在28℃摇床上振荡培养5d，得到直径在1-2mm的菌丝球。将菌丝球用200目的尼龙布过滤出来，用大量水冲洗干净菌球，转入无水乙醇洗涤7次，洗涤方式为每次用100mL无水乙醇浸泡菌球30min后，再用200目的尼龙布过滤，最后将洗涤干净的菌球用60℃烘箱烘干。称1g上述制备的菌球于100mL锥形瓶中，加入80mL氧化石墨烯水溶液(4.5mg/mL)，摇床上振摇3天，用200目的尼龙布过滤掉氧化石墨烯水溶液。再改用大量蒸馏水冲洗菌球，直到滤液为无色透明。不产毒的黄曲霉真菌可为黄曲霉菌NAFFHN396，已于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10927。或黄曲霉菌株A051，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期： 2008年6月24日，保藏号：CGMCC No.2556。

将过滤洗干净的菌球倒入500mL的锥形瓶中。称40.545g FeCl₃ 6H₂O，用蒸馏水定容至500mL，配成0.3M的溶液，备用。称18.9025g的NaHCO₃，用蒸馏水定容至500mL，配成0.45M的溶液，备用。在有菌球的锥形瓶中加入 100mL配置好的FeCl₃溶液，摇床摇1天(摇床温度28℃，转速为 180rpm/min)。然后在体系中缓慢滴加200mL NaHCO₃溶液，边滴边搅，再继续搅拌2h。称1.32g抗坏血酸用20mL蒸馏水溶解，混匀。向体系加入抗坏血酸水溶液，边滴边搅，再搅拌0.5h。将搅拌好的混合体系转入反应釜中，放入150℃烘箱反应8h。待水热反应结束后，将反应釜中的菌球用尼龙布滤出，先用大量水冲洗，再用无水乙醇冲洗7次，每次100mL无水乙醇浸泡30min后过滤，以除去易溶于有机溶剂的杂质，再改用去离子水冲洗，最后进行冷冻干燥，即得到。

见图5。本发明的磁性复合纳米材料为微球结构，包括由黄曲霉菌菌丝缠绕成的负载还原氧化石墨烯的黄曲霉菌菌丝球和均匀地分散在菌丝球上、尺寸均一的Fe₃O₄磁性纳米颗粒。微球粒径为3mm左右。黄曲霉菌菌丝直径2μm 左右，长度为20μm以上。黄曲霉真菌孢子培养获得的菌球负载还原氧化石墨烯的菌球的SEM见图5(d)，图5(d)可以看出：菌丝上负载有氧化石墨烯片层。

第二步，称取5g植物油，依次加入0.05mL的1μg/mL的黄曲霉毒素B1 甲醇标准溶液和0.1mL的10μg/mL辣椒素的甲醇标准溶液，静置30min以上，待甲醇溶液挥发后，加入20mL70％甲醇水，超声30min，4000r离心30min，取样品提取液10mL，用水稀释到70mL，混匀。在上述稀释后的样品提取液 14mL，在其中加入0.14g制备的磁性复合纳米材料，涡旋混匀5min，用磁铁吸附磁性复合纳米材料，去掉样品提取液，加入5mL去离子水，涡旋混匀5min，用磁铁吸附磁性复合纳米材料，去掉去离子水，再加入1mL的含有0.1％甲酸甲醇水溶液(体积比甲醇：水：甲酸＝9:1:0.01)，涡旋混匀5min，用磁铁吸附磁性复合纳米材料，收集0.1％甲酸甲醇水溶液，上机。测得黄曲霉毒素B1和辣椒素的加标回收率分别为95％和82％。

实施例二同步富集净化方法中参数条件的确定：

(1)富集体系的溶剂选择

称取辣椒素5mg用纯甲醇稀释定容到500mL容量瓶中，配置得到 10μg/mL的标准溶液。取1mg黄曲霉毒素B₁用纯甲醇稀释定容到1000mL容量瓶中，配置得到1μg/mL的标准溶液。分别取上述辣椒素标准溶液40μL和黄曲霉毒素B₁标准溶液50μL，在10mL离心管中，氮吹至尽干，加入10mL的3％的甲醇水溶液配成提取液。依照上面步骤调整加入的甲醇水的比例为5％，10％， 20％，30％，50％和70％。同样选择不同乙醇水配比提取液。在每个提取液中加入100mg合成的磁性复合纳米材料，充分混合5min，磁性分离后，检测上清的标样含量，计算吸附率。吸附率＝(加标量-上清标样含量)/加标量×100％。由图2可见，采用3-10％甲醇水的时候吸附率可以达到80％以上。

(2)关于富集体系中合成的磁性复合纳米材料用量的研究

称取辣椒素5mg用纯甲醇稀释定容到500mL容量瓶中，配置得到 10μg/mL的标准溶液。取1mg黄曲霉毒素B₁用纯甲醇稀释定容到1000mL容量瓶中，配置得到1μg/mL的标准溶液。分别取上述辣椒素标准溶液40μL和黄曲霉毒素B₁标准溶液50μL，在10mL离心管中，氮吹至尽干，加入10mL的 10％的甲醇水溶液配成提取液。分别加入50mg、100mg、150mg、200mg和250mg的合成的磁性复合纳米材料，充分混合5min，磁性分离后，检测上清的标样含量，计算吸附率。吸附率＝(加标量-上清标样含量)/加标量×100％。由图3可见，当富集体系中合成的磁性复合纳米材料的浓度大于5mg/mL时，吸附率达到80％以上的平台区，因此，要求体系中合成的磁性复合纳米材料浓度不低于5mg/mL，可在5-10mg/mL。

(3)关于洗脱溶剂选择

选择100mg合成的磁性复合纳米材料，将(2)步骤操作后的吸附材料分别选择用1mL甲醇、乙腈、90％甲醇水、90％乙腈水和含有0.1％甲酸的90％甲醇水进行洗脱，洗脱时间5min，用磁铁分离磁性复合材料，把洗脱液上色谱检测其含量，计算回收率。回收率＝洗脱液含量/(加标量-上清标样含量)×100％。由图4可见，当洗脱溶剂为含有0.1％甲酸的90％甲醇水时最宜。