阅读说明：本技术 一种美国红枫组织培养种苗繁育方法 (Tissue culture seedling breeding method for acer rubrum ) 是由 胡春宏 季翔 常苹 王婷婷 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种美国红枫组织培养种苗繁育方法,属于木本植物的组织培养技术领域,旨在提供一种实现种苗繁育工作的周年化、批次化、规范化的美国红枫组织培养种苗繁育方法,其技术方案要点是具体步骤如下：S1：外植体的选择；S2：外植体消毒；S3：启动培养；S4：增殖培育：S5：壮苗培育：S6：生根培育,其中,在S3中,将S2中消毒的外植体接入启动培养基中培养。本方法通过组织培养以芽繁芽的技术途径进行种苗快速繁殖,在培养过程中避免产生愈伤组织,避免了性状分离和变异,保持了母本的优良特性,种苗性状稳定。(The invention discloses a tissue culture seedling breeding method of American red maple, belongs to the technical field of tissue culture of woody plants, and aims to provide an annual, batched and standardized tissue culture seedling breeding method of American red maple, which realizes the seedling breeding work, and has the technical scheme key points that the method comprises the following specific steps: s1: selecting an explant; s2: sterilizing explants; s3: starting culture; s4: proliferation and cultivation: s5: strong seedling cultivation: s6: rooting culture, wherein in S3, the explants sterilized in S2 are inoculated into a starting medium for culture. The method carries out rapid propagation of the seedlings by tissue culture and a bud propagation technical way, avoids generating callus in the culture process, avoids character separation and variation, maintains the excellent characteristics of the female parent and has stable seedling characters.)

一种美国红枫组织培养种苗繁育方法

技术领域

本发明涉及木本植物的组织培养技术领域，特别涉及一种美国红枫组织培养种苗繁育方法。

背景技术

传统的美国红枫繁殖方法一般采用种播、扦插等方式进行种苗繁育。种播育苗会受到种子来源和育苗时间的限制，种子萌芽率也会受各种因素的制约而不够稳定，而且此方式存在较严重的性状分离，难以获得性状一致的优良种苗。而扦插育苗受季节限制，一年中只有短暂的5～9月份可以进行，且根系生长不好，枝条成活率较低；此外，扦插育苗需要从苗木上截取大量枝条，将会影响苗木的绿化造型，严重的将直接导致截枝后的苗木无法销售，失去商业价值。

目前主要有以下三种美国红枫的繁殖方法：

1.种子繁殖：种子成熟后带翅且较轻易飞散，最好随采随种，种子的成熟度较低，播前需挑选饱满的种子进行温水浸泡催芽，播种时的种子密度、合理行距及覆土厚度都受不同区域的土壤和气候限制，播种后的出苗期、间苗期、成长期，均要加强水肥及病虫害、杂草等田间管理。

2.扦插育苗：每年5-9月份，剪取半木质化的嫩枝插穗，截成15cm长的插条，保留上半部枝叶，其余枝叶全部去除，下端切口处蘸取配置好的生根粉或生根液，***已备好的插床上，管理好插床的温湿度，等插条生根后进行移植。

3.组织培养：

现有的文献报道，美国红枫的组织培养育苗方式多数采用器官直接再生和外植体脱分化和再分化的方式进行。器官直接再生是采取外植体进行消毒，无菌后接种到芽启动培养基上进行萌芽培养，萌出的芽再进行增殖培养、诱导生根等一系列过程，最终获得健全的苗木。外植体脱分化是将采取的外植体进行消毒，无菌后接种于愈伤组织诱导培养基进行脱分化诱导愈伤组织，愈伤组织再分化出不定芽，继而进行增殖和生根等一系列培养，获得无菌植株。对于美国红枫KW159的组培文献国内还没有相关报道。

但以上三种美国红枫的繁殖方法分别存在以下问题：

1.常规的种子繁殖速度过慢，需采种选种，贮藏、催芽播种，育苗管理等一系列较长周期的实施步骤，同时受季节的限制，播种时限较短；且种子成活率低，导致繁殖系数低；种子繁殖中，发生性状分离的概率高，难以获得性状一致的批量种苗。

2.扦插育苗过程中插穗生根比较难，且根系不够健壮，扦插时间短暂、扦插基质配比种类以及扦插微环境控制对生根率的影响比较大；且扦插育苗需要截取大量枝条，严重影响树势及；此外，植物病毒会随着扦插育苗而逐渐积累，随着扦插繁殖代数的增加，性状退化较为明显。

3.KW159的组培育苗技术还未研发报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种美国红枫组织培养种苗繁育方法，该方法立足于种苗工厂大规模商业生产，具有批次齐、重复性好、操作简单，生产效率高的优点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种美国红枫组织培养种苗繁育方法，具体步骤如下：

S1：外植体的选择；

S2：外植体消毒；

S3：启动培养；

S4：增殖培育：

S5：壮苗培育：

S6：生根培育，

其中，在S3中，将S2中消毒的外植体接入启动培养基中培养，启动培养基为MS+TDZ0.01～0.05mg/L+BA0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，启动培养基的pH为5.80。

通过采用上述技术方案，以芽繁芽的技术途径进行种苗快速繁殖，在培养过程中避免产生愈伤组织，避免了性状分离和变异，保持了母本的优良特性，种苗性状稳定。启动培养基能够快速打破腋芽休眠，促进腋芽萌发，同时能够有效避免愈伤组织的产生。

进一步的，在S3中，将外植体接入启动培养基后放入培养室暗培养48h，然后转入每天光照时间16h，黑暗8h，光强2000～3000lux，室温23～26℃，培养3～4周。

通过采用上述技术方案，培养3～4周的条件能够有效避免启动培养阶段植物材料出现应激反应，植物材料能够快速适应启动培养基，促使植物材料快速生长、芽体健壮。

进一步的，在S4中，将S3培养萌发的无菌苗腋芽茎段切下，接种于增殖培养基中，增殖培养基为MS+TDZ0.01～0.03mg/L+BA0.05～0.1mg/L+GA₃1.0～2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，增殖培养基的pH为5.80。

通过采用上述技术方案，该配方能够保障腋芽增殖人为可控，增殖倍率为3-4倍，且芽体健壮，重复性好。

进一步的，在S4中，将无菌苗腋芽茎段接种于增殖培养基中后，在培养室暗培养48h，然后每天光照16h，黑暗8h，培养温度均为23～26℃，光强2000～3000lux，培养4～6周。

通过采用上述技术方案，培养4～6周的条件能够有效避免增殖培养阶段植物材料出现应激反应，植物材料能够快速适应启动培养基，促使植物材料快速生长、芽体健壮。

进一步的，在S5中，将S4中诱导产生的丛生芽分成单芽切下，接种于壮苗培养基中，壮苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，壮苗培养基pH为5.80。

通过采用上述技术方案，该配方能够保障丛芽生长健壮，利于增殖和生根。此外，采用腋芽产生丛生芽的方式，避免从愈伤细胞再生植株，在保持母本优良性状的同时保障了所生产种苗的性状一致性，大大降低性状分离或变异的概率。

进一步的，在S5中，将丛生芽分成单芽切下，接种于壮苗培养基中后，在培养室暗培养48h，然后每天光照16h，黑暗8h，培养温度均为23～26℃，光强2000～3000lux，培养4～6周。

通过采用上述技术方案，培养4～6周的条件能够有效避免壮苗培养阶段植物材料出现应激反应，植物材料能够快速适应启动培养基，促使植物材料快速生长、芽体健壮。

进一步的，在S6中，将S5中壮苗后健壮的顶芽切下，接种于生根培养基中进行生根诱导，生根培养基为1/2MS+IBA0.8～1.0mg/L+活性炭0.2～0.5g/L+蔗糖15g/L+琼脂6.8g/L，生根培养基的pH为5.80。

通过采用上述技术方案，该配方能够促进植物产生的根与植物体结构相连，且培养的根短而粗壮，能够在移栽时降低损伤、提高移栽存活率。

进一步的，在S6中，将苗后健壮的顶芽切下，接种于生根培养基中后，在培养室先暗培养48h，然后每天光照16h，黑暗8h，光强2000～3000lux,培养温度均为23～26℃，培养3～4周。

通过采用上述技术方案，培养3～4周的条件能够有效避免生根培养阶段植物材料出现应激反应，植物材料能够快速适应启动培养基，促使植物材料快速生长、芽体健壮。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本申请通过组织培养以芽繁芽的技术途径进行种苗快速繁殖，在培养过程中避免产生愈伤组织，避免了性状分离和变异，保持了母本的优良特性，种苗性状稳定。

2、本申请只需要少量外植体材料，不再需要采集大量枝条，避免了对成品苗木的取枝伤害；也不依赖于植物种子，能够根据订单需要按批周年生产。

3、本申请中涉及的培养基配方，能够保持3-4倍的增殖倍率，重复性好，性状稳定，且丛生芽健壮、大小一致，符合商业生产对种苗健壮度、整齐度、重复性的要求。

附图说明

图1是美国红枫组织培养种苗繁育方法的流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例：一种美国红枫“KW159”组织培养种苗繁育方法，如图1所示，本方法主要针对于品种为“KW159”的美国红枫。

1.外植体的选择：

春季4月份，选择晴朗的天气，选取美国红枫“KW159”植株健壮、性状纯正、无病虫害的新抽出的幼态嫩梢，从顶芽起向下截取约2～3个带腋芽茎段的枝条，去除叶片，切取单节带腋芽茎段作为外植体，每根茎段带2个腋芽，每根茎段长1.5～2cm。

2.外植体消毒：

在无菌操作台上，将外植体用医用酒精棉擦拭干净，立即倒入漂白水与无菌水按1：4的体积比制成的漂白水中50～60min，期间均需不停震荡，最后用无菌水分别洗涤3次，每次漂洗2～5分钟。

其中白猫漂白水为上海白猫(集团)有限公司生产的“白猫”牌家用漂白水。

3.启动培养：

在操作工作台上，将消毒后的外植体上下两端分别切除0.3～0.5cm，接入启动培养基中，启动培养基为MS+TDZ 0.01～0.05mg/L+BA0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，启动培养基的pH为5.80。接种后放入培养室暗培养48h，然后转入每天光照时间16h，黑暗8h，光强2000～3000lux，室温23～26℃，培养3～4周，腋芽开始萌发，无菌苗株长高约2～3cm。

4.增殖培养：

将萌发后的无菌苗腋芽茎段切下，并将腋芽取出切成单个芽接种于增殖培养基中，增殖培养基为MS+TDZ0.01～0.03mg/L+BA0.05～0.1mg/L+GA₃1.0～2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，增殖培养基的pH为5.80。接种后在培养室暗培养48h，然后每天光照16h，黑暗8h，培养温度均为23～26℃，光强2000～3000lux，培养4～6周可诱导产生从生芽约2～4个，芽丛高度约1～2cm，增殖率达到3～4倍。

5.壮苗培养

将丛生芽分成单芽切下，接种于壮苗培养基中，壮苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，壮苗培养基pH为5.80。接种后在培养室暗培养48h，然后每天光照16h，黑暗8h，培养温度均为23～26℃，光强2000～3000lux，培养4～6周，单芽长高变壮，株高约3～5cm。

6.生根培养

将壮苗后健壮的顶芽切下，接种于生根培养基中进行生根诱导，生根培养基为1/2MS+IBA0.8～1.0mg/L+活性炭0.2～0.5g/L+蔗糖15g/L+琼脂6.8g/L，生根培养基的pH为5.80。接种后在培养室先暗培养48h，然后每天光照16h，黑暗8h，光强2000～3000lux,培养温度均为23～26℃，培养3～4周可生根，植株长高约至2～3cm，健壮，主根为2～5条，长度约2～6cm。

本发明所指MS培养基是Murashige和Skoog研制的培养基，其成分配方表见表1。

1/2MS培养基是指大量元素含量为MS培养基的一半，其他成分用量相同。

表1、MS培养基成分表

本发明涉及的植物生长调节剂有：6-BA—6-苄氨基嘌呤；GA₃—赤霉素；IBA—吲哚丁酸，NAA—萘乙酸。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。