阅读说明：本技术 在试管中诱导月季开花的方法 (Method for inducing flowering of Chinese rose in test tube ) 是由 鹿金颖 陈瑜 史旺林 颜春凤 赵滢 张秀兰 周军 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物组织培养技术领域,涉及一种在试管中诱导月季开花的方法。该方法包括以下步骤：对月季的外植体进行消毒处理,获得无菌外植体；将无菌外植体接种于第一MS培养基诱导愈伤组织；第一MS培养基含有0.1-10mg/L的6-BA、0.1-2mg/L的NAA、4-10g/L的琼脂以及20-50g/L的蔗糖；将愈伤组织接种到第二MS培养基进行分化培养,获得幼茎；第二MS培养基含有0.01-2mg/L的6-BA、0.1-2mg/L的NAA、4-10g/L的琼脂以及20-50g/L的蔗糖；将幼茎接种到第三MS培养基光周期和暗周期交替进行生根开花培养；第三MS培养基含有0.1-10mg/L的IBA、0.1-2mg/L的NAA、0.01-1mg/L的纳米铁颗粒、4-10g/L的琼脂以及20-50g/L的蔗糖,pH值为3-7。该方法能够使月季在试管中开花。(The invention belongs to the technical field of plant tissue culture, and relates to a method for inducing Chinese rose to bloom in a test tube. The method comprises the following steps: sterilizing explants of Chinese roses to obtain sterile explants; inoculating the sterile explant to a first MS culture medium to induce callus; the first MS culture medium contains 0.1-10mg/L of 6-BA, 0.1-2mg/L of NAA, 4-10g/L of agar and 20-50g/L of sucrose; inoculating the callus to a second MS culture medium for differential culture to obtain a young stem; the second MS culture medium contains 0.01-2mg/L of 6-BA, 0.1-2mg/L of NAA, 4-10g/L of agar and 20-50g/L of sucrose; inoculating the young stem to a third MS culture medium, and alternately carrying out rooting and flowering culture in a photoperiod and a dark period; the third MS culture medium contains IBA 0.1-10mg/L, NAA 0.1-2mg/L, nano-iron particles 0.01-1mg/L, agar 4-10g/L and sucrose 20-50g/L, and has pH of 3-7. The method can make Chinese rose flower in test tube.)

在试管中诱导月季开花的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种在试管中诱导月季开花的方法。

背景技术

月季属于蔷薇科、蔷薇属、月季种(拉丁文名称Rosa chinensis Jacq.)。月季是一种重要的花卉植物，是世界四大切花之一，原产中国，世界分布范围分布广。月季四季开花可作为观赏植物，也可作为药用植物。同时月季又是生物科学研究中的一种重要实验材料。通过组织培养方法实现月季在试管中开花，可以为月季生物科学研究提供一个捷径。为进一步探索植物开花的原理机制，提供理论依据。

现有的月季组织培养主要是为了调节月季组织的分化增殖能力以提高月季试管苗的繁殖系数，或者是为了转基因实验的需要进行调控，当月季试管苗分化后就转到生根培养基中，生根后就移栽至土壤中。现有技术中的月季组织培养方法主要用于优良品种的快繁和月季转基因中的生物技术的基本操作，但是没有月季在试管中开花结果的组织培养方法的研发，因为月季在试管内开花结果不同于土壤中开花结果，试管是一个相对密闭的人为控制的微环境，难点在于对于光照、温度的控制和培养基中的营养成分和激素配比，以达到满足月季能在试管内开花的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种在试管中诱导月季开花的方法，以实现月季在试管中开花。

为了实现上述目的，本发明提供一种在试管中诱导月季开花的方法，所述方法包括以下步骤：

S1.对月季的外植体进行消毒处理，获得无菌外植体；

S2.将所述无菌外植体接种于第一MS培养基中诱导愈伤组织，获得愈伤组织；所述第一MS培养基含有0.1-10mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1-2mg/L的奈乙酸(NAA)、4-10g/L的琼脂、以及20-50g/L的蔗糖；

S3.将所述愈伤组织接种到第二MS培养基中进行分化培养，获得幼茎；所述第二MS培养基含有0.01-2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1-2mg/L的奈乙酸(NAA)、4-10g/L的琼脂、以及20-50g/L的蔗糖；

S4.将所述幼茎接种到第三MS培养基中光周期和暗周期交替进行生根开花培养；所述第三MS培养基含有0.1-10mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0.1-2mg/L的奈乙酸(NAA)、0.01-1mg/L的纳米铁颗粒、4-10g/L的琼脂、以及20-50g/L的蔗糖，并且所述第三MS培养基的pH值为3-7。

本领域技术人员可以采用现有的消毒手段对外植体进行消毒。优选地，在步骤S1中，所述对月季的外植体进行消毒处理包括以下步骤：首先对所述外植体进行冲洗，再置于1％-10％的吐温-20中浸泡2-10分钟，之后利用无菌水漂洗，然后利用3％-5％次氯酸钠消毒15min～30min，或者利用0.01％-1％升汞(HgCl₂)溶液表面灭菌2-10分钟，最后利用无菌水漂洗。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤S2中，所述第一MS培养基含有0.8-2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.5-1.5mg/L的奈乙酸(NAA)、5-8g/L的琼脂、以及25-35g/L的蔗糖。更优选地，所述第一MS培养基含有2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、1mg/L的奈乙酸(NAA)、6g/L的琼脂、以及30g/L的蔗糖。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤S3中，所述第二MS培养基含有1.5-2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.5-1.5mg/L的奈乙酸(NAA)、5-8g/L的琼脂、以及25-35g/L的蔗糖。更优选地，所述第二MS培养基含有1mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、1mg/L的奈乙酸(NAA)、6g/L的琼脂、以及30g/L的蔗糖。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤S4中，所述第三MS培养基含有0.8-1.5mg/L的吲哚丁酸(IBA)、1.5-2mg/L的奈乙酸(NAA)、0.5-1mg/L的纳米铁颗粒、5-8g/L的琼脂、以及15-20g/L的蔗糖，并且所述第三MS培养基的pH值为5.6-6.0。更优选地，所述第三MS培养基含有1mg/L的吲哚丁酸(IBA)、2mg/L的奈乙酸(NAA)、0.5mg/L的纳米铁颗粒、6g/L的琼脂、以及15g/L的蔗糖，并且所述第三MS培养基的pH值为5.8。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤S4中，所述光周期的时间为12-20小时；所述暗周期的时间为12-4小时。

在本发明的一种优选实施方式中，在所述生根开花培养的过程中，使用白色荧光照射所述幼茎，所述白色荧光的光强为65-80μE/m²/s。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤S4中，所述生根开花培养的温度为23-25℃。

在本发明中，第一MS培养基、第二MS培养基、第三MS培养基、以及第四MS培养基中除了激素、琼脂和蔗糖的含量不同以外，这四者的大量元素和微量元素均可以相同，由于MS培养基在植物组织培养中应用广泛，本发明在此不做赘述。

在本发明中，由无菌外植体诱导愈伤组织所需的时间为20-30天；由愈伤组织分化成幼茎所需要的时间为7-14天；有幼茎生根开花所需的时间为20-30天。

本发明所使用的月季的外植体包括月季的茎尖、侧芽和茎段中的至少一种。

本发明提供的在试管中诱导月季开花的方法，通过对诱导愈伤组织所使用的培养基，分化所使用的培养基，以及生根开花所使用的培养基的选择，实现在月季在试管中开花。

本发明对培养基中激素种类和浓度、营养成分进行了改进，激素调节主要为了月季试管苗在试管中实现由营养生长向生殖生长转化达到开花的目的，因此在激素的种类和浓度以及营养成分与现有的月季组织培养不同。由于试管内开花不受季节限制，可以随时诱导，组培试管成花具有成花率高、重复性好、技术稳定等优点，因此，本发明的方法可被大量用于成花研究和试管花卉应用中。

本发明提供的在试管中诱导月季开花的方法，诱导月季实现在试管中开花。

本发明的其它特征和优点将在随后

具体实施方式

部分予以详细说明。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1

S1.以微型月季品种Hula Girl田间生长的茎尖作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中5分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl₂)表面灭菌4分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗4-5次，获得无菌外植体。

S2.将无菌外植体接种到培养基，诱导愈伤组织：MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg/L+奈乙酸(NAA)1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，诱导愈伤25-30天。

S3.将愈伤组织转到MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg/L+奈乙酸(NAA)1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH值5.8，培养7-10天，愈伤组织分化为幼茎。

S4.将幼茎接种到MS培养基+吲哚丁酸(IBA)1mg/L+奈乙酸(NAA)2mg/L+纳米铁颗粒0.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖15g/L，pH值5.8，组织培养室培养温度23-25℃，白色荧光光强65μE/m²/s，16小时的光周期，8小时的暗周期。7天后生根，14天形成花蕾，20天开花。

实施例2

S1.将月季品种Kori田间生长的茎尖作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中5分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl₂)表面灭菌4分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗4-5次，获得无菌外植体。

S2.将无菌外植体接种到培养基，诱导愈伤组织：MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg/L+奈乙酸(NAA)1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，诱导愈伤25-30天。

S3.将愈伤转到MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg/L+奈乙酸(NAA)1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH值5.8，培养7-10天，愈伤组织分化为幼茎。

S4.将幼茎接种到MS培养基+吲哚丁酸(IBA)1mg/L+奈乙酸(NAA)2mg/L+纳米铁颗粒0.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖15g/L，pH值5.8，组织培养室培养温度23-25℃，白色荧光光强65μE/m²/s，16小时的光周期，8小时的暗周期。7天后生根、20天形成花蕾，30天开花。

对比例1

S1.以微型月季品种Hula Girl田间生长的茎尖作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中5分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl₂)表面灭菌4分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗4-5次，获得无菌外植体。

S2.将无菌外植体接种到培养基，诱导愈伤组织：MS培养基+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，诱导愈伤25-30天。

S3.将愈伤组织转到MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH值5.8，培养30天，愈伤组织分化为幼茎。

S4.将幼茎接种到MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.2mg/L+奈乙酸(NAA)0.1mg/L+琼脂6g/L+蔗糖15g/L，pH值5.8，组织培养室培养温度23-25℃，白色荧光光强65μE/m²/s，16小时的光周期，8小时的暗周期。30天后生根，无花蕾形成。

对比例2

S1.以微型月季品种Hula Girl田间生长的茎尖作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中5分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl₂)表面灭菌4分钟，用高温高压灭菌的蒸馏水漂洗4-5次，获得无菌外植体。

S2.将无菌外植体接种到培养基，诱导愈伤组织：MS培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.02mg/L+奈乙酸(NAA)0.01mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，诱导愈伤25-30天。

S3.将愈伤组织转到MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.01mg/L+奈乙酸(NAA)0.01mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH值5.8，培养20天，愈伤组织分化为幼茎。

S4.将幼茎接种到MS培养基+吲哚丁酸(IBA)0.01mg/L+奈乙酸(NAA)0.02mg/L+纳米铁颗粒0.005mg/L+琼脂6g/L+蔗糖15g/L，pH值5.8，组织培养室培养温度23-25℃，白色荧光光强65μE/m²/s，16小时的光周期，8小时的暗周期。15天后生根，无花蕾形成。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。