阅读说明：本技术 一种观赏水草南极杉的组织培养方法 (Tissue culture method of ornamental water plant Antarctic fir ) 是由 不公告发明人 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种观赏水草南极杉的组织培养方法,包括以下步骤：(1)预处理；(2)将预处理的外植体切割成1-1.5cm长的外植体,切割后的每个外植体至少带一个腋芽；将切割后的外植体接入初代培养基进行初代培养；(3)分离初代培养基中的初代不定芽,使初代不定芽长度控制在2cm以内；将分离后的初代不定芽转入增殖培养基中培养；(4)将增殖培养基中长度大于3-4cm的植株转入生根培养基培养；(5)将带有完整根系的南极杉植株从生根培养基中取出,清水冲洗后移栽到生态缸中。该方法不受季节、温度、地域影响就能获得大量的新植株,快速建立南极杉无菌繁殖体系,为保持南极杉优良的种性提供技术支持,为广大的爱好者提供源源不断地无菌种苗。(The invention relates to a tissue culture method of ornamental float grass Antarctic fir, which comprises the following steps: (1) pre-treating; (2) cutting the pre-treated explants into 1-1.5cm long explants, each cut explant having at least one axillary bud; inoculating the cut explant into a primary culture medium for primary culture; (3) separating primary adventitious buds in the primary culture medium to control the length of the primary adventitious buds within 2 cm; transferring the separated primary adventitious bud into a multiplication culture medium for culture; (4) transferring the plant with the length of more than 3-4cm in the multiplication culture medium into a rooting culture medium for culture; (5) taking out the Antarctic fir plants with complete root systems from the rooting culture medium, washing with clear water, and transplanting into an ecological cylinder. The method can obtain a large number of new plants without being influenced by seasons, temperature and regions, quickly establish an Antarctic fir sterile propagation system, provide technical support for maintaining excellent seed properties of Antarctic fir, and provide continuous sterile seedlings for vast enthusiasts.)

一种观赏水草南极杉的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种观赏水草南极杉的组织培养方法。

背景技术

南极杉，是一种较常用的观赏水草。南极杉为沉水草本植物，车前科，双子叶植物，挺水性水草。野生情况下，每到花期，水面如花海般美丽，草缸培育也能看到它开花的情形。这种水草在水中颇能适应广泛的水质变化，在弱光下也能生长，但仍以较强光线培育为佳。南极杉在形态上比较像绿羽毛，区别在于前者是针状叶，后者是羽状叶。南极杉目前繁殖方式为插枝、侧芽繁殖。

但是，目前尚缺乏成熟的技术用于大规模繁殖优质的南极杉植株。

发明内容

针对现有技术存在的技术问题，本发明提出了一种观赏水草南极杉的组织培养方法，该方法是在无菌条件下，采取适宜培养环境、给予固定光照，诱导南极杉新的幼苗，逐步形成无菌苗体系，后期可常年提供大量无菌幼苗。该方法易行，操作方便，产量高，克服了南极杉在水族缸中不易繁殖、繁殖速度慢、植物种苗获得困难的问题。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种观赏水草南极杉的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)预处理：选择健康、无病虫害的南极杉植株经灭菌处理、清洗，得到消毒灭菌后的无菌外植体；

(2)初代培养：将消毒后的无菌外植体在无菌培养皿中切割成1-1.5cm长的外植体，切割后的每个外植体至少带一个腋芽；将切割后的外植体转接入初代培养基进行初代培养10-20天；

(3)增殖培养：分离初代培养基中的初代不定芽，使初代不定芽长度控制在2cm以内；将分离后的初代不定芽转入增殖培养基中进行增殖培养22-30天；

(4)生根培养：将增殖培养基中长度大于3-4cm的植株转入生根培养基，进行生根培养；

(5)移栽：将带有完整根系的南极杉植株从生根培养基中取出，清水冲洗后移栽到生态缸中。

进一步地，步骤(1)中外植体灭菌处理、清洗的具体方法为：流水冲洗外植体30min，75％酒精消毒15-30s，冲洗3次；1％次氯酸钠消毒10-20min，再用无菌水冲洗5次。

进一步地，所述初代培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+0.5-1.5mg/L激动素+0.05-0.5mg/L萘乙酸。

进一步地，所述增殖培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+1-2.5mg/L6-BA+0.5-1mg/L萘乙酸。

进一步地，所述生根培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+0.1-0.5mg/L生长素。

更进一步地，所述生根培养基为：MS培养基+6-10g/L琼脂+10-30g/L蔗糖+0.1-0.5mg/L吲哚乙酸。

进一步地，所述初代培养条件为：光照周期为14h/d，温度25±2℃，光照2500Lux。

进一步地，所述增殖培养条件为：光照周期为14h/d，温度25±2℃，光照2500Lux。

进一步地，所述生根培养条件为：光照周期为14h/d，温度25±2℃，光照2500Lux。

因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)本发明提出的一种观赏水草南极杉的组织培养方法，是在无菌条件下，采取适宜培养环境，给予固定光照，直接诱导南极杉幼芽的生长，可不受季节、温度、地域影响，获得大量的新植株，快速建立南极杉无菌繁殖体系，为保持南极杉优良的种性提供技术支持，为广大的爱好者提供源源不断地优质无菌种苗。

(2)本发明的组织培养方法中所采用的各组培配方协同配合，组织繁殖周期短，繁殖率高，且通过本发明的组织培养方法无菌培养的南极杉苗，在自然水体中生根率达100％，植物成活率高达98％以上，实现了南极杉有效快速的无性繁殖，对于促进观赏水草的生产和新品种的培育、加快水族观赏水草产业的快速发展具有重要作用。

(3)本发明的南极杉无菌苗的组织培养方法简单易行，操作方便，产量高，克服了水族缸中不易繁殖、繁殖速度较慢、植物种苗获得困难的问题。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

步骤1：配制初代培养基、增殖培养基、生根培养基

1、本实施例中使用的初代培养基、增殖培养基和生根培养基均是采用的MS培养基作为基础培养基，MS培养基配方如下：mg/L

表1 MS培养基配方

序号	组分	含量(mg/L)	序号	组分	含量(mg/L)
						1	KNO<sub>3</sub>：	1900	11	CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O	0.025
2	NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>	1650	12	CoCL<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O	0.025
						3	MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	370	13	Na<sub>2</sub>-EDTA	37.3
4	KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	170	14	FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	27.8
						5	CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	440	15	甘氨酸	2.0
6	MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O	22.3	16	盐酸吡哆醇	0.5
						7	ZnSO4·7H<sub>2</sub>O	8.6	17	盐酸硫铵素	0.1
8	H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	6.2	18	烟酸	0.5
						9	KI	0.83	19	肌酸	100
10	Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.25

2、初代培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂7g、蔗糖30g、激动素(KT)0.5mg、萘乙酸(NAA)0.1mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

3、增殖培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂7g、蔗糖30g、6氨基嘌呤(6BA)1.0mg、萘乙酸(NAA)0.5mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

4、生根培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂7g、蔗糖30g、吲哚乙酸0.1mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

步骤2：外植体的清洗与消毒

从花鸟市场购买南极杉植株，带回实验室用洗涤剂简单清洗掉表面污渍和灰尘，在自来水下冲洗半小时；于超净工作台上，选用健康、无病虫害的植株作为外植体，用镊子剃掉大部分叶片后，经体积浓度为75％的酒精消毒15s，冲洗三次，然后用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒15min，再用无菌水冲洗5次待用。

步骤3：初代培养

将消毒后的外植体用灭菌纸片吸掉表面水分，转接入步骤1制备的初代培养基，置于培养箱中诱导培养16天，诱导培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度23℃。

步骤4：增殖培养

分离初代培养基中的不定芽，切割长度为2cm以内为宜，转入步骤1制备的增殖培养基中，增殖培养22天，增殖培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度25℃。

步骤5：生根培养

经过22天增殖培养后，将长度大于3-4cm的南极杉新植株切割下来，转入生根培养基生根。生根培养条件为：光照2500Lux，光照周期为12h/d，温度25℃。

步骤6：

待长出根长超过2cm，取出，用清水冲洗后，移栽到生态缸中，植物全部成活，成活率达到100％。

本实施例可以由一个外植体直接诱导出新植株，通过不断的分离增殖培养供应源源不断的南极杉种苗，一棵南极杉经过30天可以诱导出6棵新的子代植株，转入水族箱后存活率为100％。

实施例2

步骤1：配制初代培养基和增殖培养基、生根培养基

1、本实施例中配制的初代、增殖、生根培养基是采用的MS培养基作为基础培养基，MS培养基配方同实施例1所示。

2、初代培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂6g、蔗糖20g、激动素(KT)1.0mg、萘乙酸(NAA)0.05mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

3、增殖培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂6g、蔗糖20g、6氨基嘌呤(6BA)2.5mg、萘乙酸(NAA)0.75mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

4、生根培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂6g、蔗糖20g、吲哚乙酸0.5mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

步骤2：外植体的清洗与消毒

从花鸟市场购买南极杉植株，带回实验室用洗涤剂简单清洗掉表面污渍和灰尘，在自来水下冲洗半小时；于超净工作台上，选用健康、无病虫害的植株作为外植体，用镊子剃掉大部分叶片后，经体积浓度为75％的酒精消毒30s，冲洗三次，然后用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒12min，再用无菌水冲洗5次待用。

步骤3：初代培养

将消毒后的外植体用灭菌纸片吸掉表面水分，转接入步骤1制备的初代培养基，置于培养箱中诱导培养20天，诱导培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度23℃。

步骤4：增殖培养

分离初代培养基中的不定芽，切割长度为2cm以内为宜，转入步骤1制备的增殖培养基中，增殖培养26天，增殖培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度25℃。

步骤5：生根培养

经过4周培养后，将长度大于3-4cm的南极杉新植株切割下来，转入生根培养基生根。生根培养条件为：光照2500Lux，光照周期为12h/d，温度25℃。

步骤6：待长出根长超过2cm，取出，用清水冲洗后，移栽到生态缸中，植物全部成活，成活率达到98％。

本方法可以由一个外植体直接诱导出新植株，通过不断的分离增殖培养供应源源不断的南极杉种苗，一棵南极杉经过30天可以诱导出10棵新的子代植株，转入水族箱后存活率大于98％。

实施例3

步骤1：配制初代培养基和增殖培养基、生根培养基

1、本实施例中配制的初代、增殖、生根培养基是采用的MS培养基作为基础培养基，MS培养基配方同实施例1所示。

2、初代培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂10g、蔗糖10g、激动素(KT)1.5mg、萘乙酸(NAA)0.5mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

3、增殖培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂10g、蔗糖10g、6氨基嘌呤(6BA)1.75mg、萘乙酸(NAA)1.0mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

4、生根培养基配制

1L上述MS培养基中添加琼脂10g、蔗糖10g、吲哚乙酸0.3mg制备固体培养基，在98kPa、115-125℃条件下灭菌20min待用；分装入组培瓶中，培养基高度已1-1.5cm为最佳。

步骤2：外植体的清洗与消毒

从花鸟市场购买南极杉植株，带回实验室用洗涤剂简单清洗掉表面污渍和灰尘，在自来水下冲洗半小时；于超净工作台上，选用健康、无病虫害的植株作为外植体，用镊子剃掉大部分叶片后，经体积浓度为75％的酒精消毒30s，冲洗三次，然后用质量浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒20min，再用无菌水冲洗5次待用。

步骤3：初代培养

将消毒后的外植体用灭菌纸片吸掉表面水分，转接入步骤1制备的初代培养基，置于培养箱中诱导培养10天，诱导培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度23℃。

步骤4：增殖培养

分离初代培养基中的不定芽，切割长度为2cm以内为宜，转入步骤1制备的增殖培养基中，增殖培养30天，增殖培养条件为：光照2500Lux，光照周期为14h/d，温度25℃。

步骤5：生根培养

经过30天培养后，将长度大于3-4cm的南极杉新植株切割下来，转入生根培养基生根。生根培养条件为：光照2500Lux，光照周期为12h/d，温度25℃。

步骤6：待长出根长超过2cm，取出，用清水冲洗后，移栽到生态缸中，植物全部成活，成活率达到95％。

本方法可以由一个外植体直接诱导出新植株，通过不断的分离增殖培养供应源源不断的南极杉种苗，一棵南极杉经过30天可以诱导出8棵新的子代植株，转入水族箱后存活率大于95％。

对比例

目前南极杉的培育主要集中在观赏植物培育基地或者商店，主要方法为在透明玻璃水缸中扦***一定长度的植株，加水淹没植物至少5厘米，给予一定光照，通过水泵保持缸内水体的流动性，待植物长到一定长度后，通过打顶、截短的方式获得新的无形枝条，进行下一轮繁殖，经过一轮生长的时间范围在30-50天之间，植物约生长出3个新的侧芽，在扦插15天后开始生根，生根数4根左右，根长度不一，经过30天生长，根平均长度可以达到3厘米左右。将该方法培育的南极杉苗移栽到生态缸中后的成活率是90％。

实施例1-3的试验结果详见表2。

表2实施例1-3和对比例的试验结果

由表2可知，本发明的组织培养方法中所采用的各组培配方协同配合，组织繁殖周期短，繁殖率高，且通过本发明的组织培养方法无菌培养的南极杉苗，在自然水体中生根率达100％，植物成活率高达95％以上，实现了南极杉有效快速的无性繁殖。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。