阅读说明：本技术 不同构型的glp-1类似肽修饰二聚体及其制备方法在治疗ii型糖尿病中的应用 (GLP-1 analog peptide modified dimer with different configurations and application of preparation method thereof in treating type II diabetes ) 是由 唐松山 罗群 张旭东 董玉霞 唐婧晅 杨莉 李玉华 葛平 戴小敏 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了不同构型新型胰高血糖素肽1脂肪酸修饰或非修饰二聚体在治疗II糖尿病中胰腺保护或降糖效果的应用。本发明的二聚体是两个相同含有半胱氨酸的GLP-1单体通过半胱氨酸氧化形成的二硫键连接而成。本发明的H型GLP-1同源二聚体(在肽链内部形成二硫键)在不降低活性情况下显著增加了GLP-1二聚体降糖持续时间,所提供的GLP-1类似物二聚体在体内持续活性长达19天,较阳性对照药利拉鲁肽体内活性为3天,或者和目前已经报道的长效GLP1类似肽比较,都有显著延长,极大地推动了长效GLP1类药物的技术进步和便利了其临床应用和推广。同时U型同源二聚体(在肽链C末端形成二硫键)不影响血糖,但可以明显保护胰腺腺泡和导管等外分泌部细胞,保护胰腺的功能。(The invention provides application of a novel glucagon peptide 1 fatty acid modified or unmodified dimer with different configurations in pancreatic protection or blood sugar reduction effect in treatment of diabetes II. The dimer is formed by connecting two identical GLP-1 monomers containing cysteine through a disulfide bond formed by oxidizing the cysteine. The H-type GLP-1 homodimer (disulfide bond is formed in the peptide chain) obviously prolongs the glucose-reducing duration time of the GLP-1 dimer under the condition of not reducing the activity, the provided GLP-1 analog dimer has the continuous activity in vivo for 19 days, and the activity in vivo is 3 days compared with that of a positive control drug liraglutide, or compared with long-acting GLP1 similar peptide reported at present, the GLP-1 analog dimer obviously prolongs the activity in vivo, and greatly promotes the technical progress of long-acting GLP1 drugs and facilitates the clinical application and popularization of the GLP-1 analog dimer. Meanwhile, the U-shaped homodimer (forming a disulfide bond at the C terminal of a peptide chain) does not influence blood sugar, but can obviously protect exocrine cells such as pancreatic acini, ducts and the like and protect the functions of pancreas.)

不同构型的GLP-1类似肽修饰二聚体及其制备方法在治疗II 型糖尿病中的应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及多种人新型GLP 1类似肽单体或同源二聚体制备及其治疗糖尿病中的应用。

背景技术

来自胰高血糖素原蛋白的胰高血糖素样肽1(GLP 1)是一种30氨基酸残基的肠促胰岛素类似肽，在营养摄入时由肠L细胞释放。它增强胰腺β细胞胰岛素分泌，增加胰岛素表达和外周葡萄糖利用，抑制β细胞凋亡，促进饱腹感和β细胞新生，减少胰高血糖素分泌，延缓胃排空。这些多重效应使GLP1受体激动剂治疗2型糖尿病有显著性意义。目前经FDA批准的GLP-1类似物有每日一次给药的Liraglutide(利拉鲁肽)、每日两次给药的Exenatide和每周一次给药Albiglutide,Dulaglutide,Exenatide LAR,Lixisenatide,Semaglutide,Taspoglutide。

Exendin-4是从Heloderma suspectum唾液中分离出的肠促胰岛素类似物，有39氨基酸，与GLP-1有53％序列同源性。Exenatide是一种Exendin-4合成分子，具有较长半衰期(3.3-4.0小时)和长效抗高血糖作用，每天给两次。

Liraglutide是一种GLP-1类似物，与天然人GLP-1有97％同源性。它包含Arg→³⁴Lys取代和在²⁶Lys增加谷氨酰棕榈酰链。皮下注射后，最终消除半衰期平均为13小时，允许每天一次给药，它的药代动力学特性不受年龄、性别、肾或肝功能的影响。

PB-105是通过在Exenatide的39位替换半胱氨酸和在半胱氨酸特异性聚乙二醇化修饰，制备PB-110(PEG5kd)、PB-106(PEG20kd)、PB-107(PEG30kd)和PB-108(PEG40kd)。PB-106的血浆T1/2约为PB-105的10倍，表现出更好的降糖活性，但单位毫克降糖活性(比活性)降低90％以上。

Lixisenatide是新型长效GLP-1R激动剂，包含44个氨基酸，结构上与Exendin-4相似，不同之处在于在位置38处没有脯氨酸，在位置39处增加6个赖氨酸残基。在24周临床用药中，Lixisenatide每日一次注射显著降低活性，Lixisenatide组与对照组治疗副反应的比例相似(Lixisenatide 2.5％和安慰剂1.9％)，症状性低血糖率为(Lixisenatide 3.4％和安慰剂1.2％)。

BPI-3016对人GLP-1在8位(Ala)和8-9位(GLU)之间的键(DIM)进行了结构修饰。⁸Ala中的-CH3侧链被置换成-CF3，键中的羰基被转化为甲基，采用棕榈酰化Lys→²⁶Arg替代和增加C端Gly。单次给药后，BPI-3016对糖尿病食蟹猴的半衰期超过95小时，药后一周明显降低FPG和餐后血糖(PPG)，降低体重指数(BMI)、体脂、改善了葡萄糖耐受性，显示出胰岛素增加效应。

Albiglutide是一种重组融合蛋白，由两个人GLP-1基因与人白蛋白基因串联的连锁拷贝组成。Gly→⁸Ala取代赋予对DPP-4水解的抗性，允许每周给药一次。研究表明，Albiglutide可降低血糖参数(HbA1c、PPG和FPG)，从而增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌和减缓胃排空。

Dulaglutide是一种融合到Fc片段的GLP-1类似物，其结构为Gly⁸Glu²²Gly³⁶-GLP-1(7-37)-(Gly₄Ser)₃-Ala-Ala^234,235Pro²²⁸-IgG4-Fc。Dulaglutide每周一次给药。与安慰剂、二甲双胍、甘精胰岛素、西他列汀和Exenatide相比，Dulaglutide显示出较高的HbA1c降低。Dulaglutide在治疗T2D中具有减轻体重、降低肾病进展、降低心肌梗死发生率、降低血压等多种疗效。

Semaglutide是GLP 1长效类似肽，它有Aib→⁸Ala取代和²⁶Lys一个更长的连接头(2xAEEAC-δ-glutamyl-α-oleic diacid)。它维持了94％的GLP1同源性。与Liraglutide比较，Semaglutide活性有3倍降低，但白蛋白结合力增加，推算有165–184小时半衰期(7天)。Semaglutide显示了显著性HbA1c和体重降低。

Taspoglutide含有α-氨基异丁酸Aib→⁸Ala和³⁵Gly的hGLP-1(7-36)NH₂。Taspoglutide与GLP-1R有较强亲合常数，对氨基二肽酶完全抗性。在24周临床研究中，Taspoglutide对HbA1c、FPG和体重显著降低。但是副作用明显。

GLP-1类似物研究仍然需要进行优化，因为目前的长效激活剂在比活性(单位毫克的降糖效果)、给药剂量、体重降低和副反应方面，已证明都不如Liraglutide或天然GLP1有效，比如在26周的试验中，Albiglutide体重减轻0.6公斤而Liraglutide为2.2公斤，Dulaglutide组的体重下降为2.9千克而Liraglutide组为3.6千克。在啮齿类动物中，Semaglutide会引起剂量依赖性和治疗持续时间依赖性的甲状腺C细胞肿瘤。临床研究表明，肾功能正常者占57.2％，轻度受损者占35.9％，中度受损者占6.9％。与安慰剂组相比，服用Semaglutide的患者出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛和便秘等胃肠道不良反应的频率更高(安慰剂组15.3％，Semaglutide组0.5和1mg组32.7和36.4％)。Semaglutide与磺酰脲类药物联合使用时，0.8-1.2％患者出现严重低血糖，注射部位不适和红斑为0.2％，患者平均淀粉酶增加13％，脂肪酶增加22％。胆石症发生率分别为1.5％和0.4％。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种胰高血糖素样肽1类似肽单体及其同源二聚体。

本发明的第一个目的在于提供一种胰高血糖素样肽1类似肽单体，所述胰高血糖素样肽1类似肽的氨基酸序列为以下四种中的任意一种：

(1)

His-X₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Cys-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X₂₆-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X₃₄-X₃₅-Arg-X₃₇；或

(2)

His-X₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Cys-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X₂₆-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X₃₄-X₃₅-Arg-X₃₇；或

(3)

His-X₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Cys-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X₂₆-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X₃₄-X₃₅-Arg-X₃₇；或

(4)

His-X₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X₂₆-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X₃₄-X₃₅-Arg-Gly-Cys-OH；

其中，X₈为L-ɑ-丙氨酸(Ala)或β-丙氨酸(βAla)或α-或β-氨基异丁酸(ɑ或βAib)；

X₂₆为赖氨酸、侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸或侧链ε氨基上烷酸基修饰的赖氨酸；

X₃₄为Arg、Lys或侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸；

X₃₅为Gly或Ala或β-丙氨酸或ɑ-氨基异丁酸或β-氨基异丁酸；

X₃₇为Gly-COOH(甘氨酸羧基末端)或Gly-NH₂(甘氨酸酰胺化末端)或NH₂(第36位精氨酸酰胺化末端)或OH(第36位精氨酸羧基末端)结构；或为变构的如第一个目的所提供的前7-36位氨基酸序列以1个相似重复序列拷贝构成，重复序列中的第8位(X₈)丙氨酸以甘氨酸或ɑ-或β-氨基异丁酸(Aib)替换，半胱氨酸以丝氨酸或甘氨酸替换，重复序列中的X₂₆为精氨酸；或为由C末端酰氨基与聚乙二醇分子连接形成PEG化修饰，所述PEG分子量为0.5-30KD。

优选地，当所述X₂₆为侧链ε氨基上烷酸谷氨酰【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰的赖氨酸时，其结构式如式1所示；当所述X₂₆为侧链ε氨基上烷酸基修饰的赖氨酸时，其结构式如式2所示；式1、2中n＝14或16：

本发明的第二个目的在于提供一种高血糖素样肽1类似肽同源二聚体，所述二聚体由两个如上所述相同的单体通过半胱氨酸形成的二硫键连接而成，构成H型或U型胰高血糖素样肽1类似肽同源二聚体。

优选地，所述二聚体的氨基酸序列为以下四种中的任意一种：

其中，X₈为L-ɑ-丙氨酸(Ala)或β-丙氨酸(βAla)或α-或β-氨基异丁酸(ɑ或βAib)；

X₂₆为赖氨酸、侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸或侧链ε氨基上烷酸基修饰的赖氨酸；

X₃₄为Arg、Lys或侧链ε氨基上烷酸谷氨酰修饰的赖氨酸；

X₃₅为Gly或Ala或β-丙氨酸或ɑ-或β-氨基异丁酸(Aib)；

X₃₇为Gly-COOH(甘氨酸羧基末端)或Gly-NH₂(甘氨酸酰胺化末端)或NH₂(第36位精氨酸酰胺化末端)或OH(第36位精氨酸羧基末端)结构；或为变构的如第一个目的所提供的前7-36位氨基酸序列以1个相似重复序列拷贝构成，重复序列中的第8位(X₈)丙氨酸以甘氨酸或ɑ-或β-氨基异丁酸(Aib)替换，半胱氨酸以丝氨酸或甘氨酸替换，重复序列中的X₂₆为精氨酸；或为由C末端酰氨基与聚乙二醇分子连接形成PEG化修饰，所述PEG分子量为0.5-30KD。

优选地，当所述X₂₆为侧链ε氨基上烷酸谷氨酰【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰的赖氨酸时，其结构式如式1所示；当所述X₂₆为侧链ε氨基上烷酸基修饰的赖氨酸时，其结构式如式2所示，式1、2中n＝14或16。

本发明的第三个目的在于提供如上所述的单体胰高血糖素样肽1类似肽或者如上所述的二聚体GLP 1类似肽在制备治疗II糖尿病中胰腺保护或/和降糖药物中应用。

本发明的第四个目的在于提供一种保护胰腺或治疗II糖尿病药物，该药物以如上所述的单体胰高血糖素样肽1类似肽或如上所述的二聚体胰高血糖素样肽1类似肽作为活性成份。

本发明的优势效果：本发明的H样GLP-1类似物同源二聚体在活性不降低的情况下，显著增加保护单体GLP-1肽的降糖作用时间延长达2-4倍(即二聚体肽明显提高了比活性)，显著延长被FDA批准GLP-1R激活剂药物。所提供的GLP-1类似物同源二聚体在体内的活性维持时间最长达19天，较阳性药Liraglutide明显延长，明显促进技术升级，极大地便利了其临床应用和市场推广。U样二聚体不影响血糖水平，但明显保护胰腺腺泡和导管等外分泌部细胞，保护胰腺功能，可用于胰腺相关疾病的治疗。

附图说明

图1为单一OGTT的血糖测试结果示意图。

图2为多次OGTT试验中的2G2-2G8体重变化示意图。

图3为2G3治疗T2D模型时体重变化示意图。

图4为2G3治疗T2D模型中的降糖效应示意图。

图5为T2D模型治疗胰腺组织H-E染色结果示意图。

图6为二聚体2G3治疗T2D模型中的Ki67蛋白表达示意图。

图7为二聚体2G1治疗T2D模型中的Ki 67蛋白表达示意图。

图8为TUNEL染色分析结果示意图。

图9为GLP-1R染色分析结果示意图。

图10为Western blot分析GLP-1R结果示意图。

图11为胰岛素染色分析结果示意图(A：胰岛素染色；B：胰岛素染色分析；C：胰岛数目分析)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1单体肽和二聚体的制备

一、单体肽固相合成过程：手工固相多肽合成操作步骤。

1、树脂溶涨：将二氯树脂(C末端羧基的用二氯苯甲基树脂)或氨基树脂(C末端酰胺化序列用氨基树脂)(购自天津市南开合成科技有限公司)，放入反应锅中，加二氯甲烷(DCM，Dikma Technologies Inc.)15ml/g树脂，振荡30min。SYMPHONY型12通道多肽合成仪(SYMPHONY型号，软件Version.201，Protein Technologies Inc.)。

2、接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤除去溶剂，加入3倍摩尔的C端第一个Fmoc-AA氨基酸(所有的Fmoc-氨基酸由苏州天马医药集团精细化学品有限公司提供)，再加入10倍摩尔量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，最后加入二甲基甲酰胺(DMF)(购自Dikma Technologies Inc.)溶解，振荡30min。用醋酸酐封闭。

3、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶-DMF溶液(15ml/g)，5min，过滤去掉溶剂，再加20％哌啶-DMF溶液(15ml/g)，15min。哌啶由国药集团上海化学试剂公司提供。

4、检测：抽掉溶剂。取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN和苯酚溶液各一滴，105-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

5、洗树脂：依次DMF(10ml/g)洗两次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。

6、缩合：根据具体合成条件，以下方法可以在多肽合成中单独或混搭使用：

方法a：三倍量的保护氨基酸和三倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，均用尽量少DMF溶解，加入反应锅中。立刻加入十倍量的N-甲基吗啉(NMM，苏州天马医药集团精细化工有限公司).反应30min，检测呈阴性。

方法b：三倍量的保护氨基酸FMOC-AA和三倍量1-羟基苯并***(HOBt，苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入三倍量的N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC).反应30min.，检测呈阴性。7、洗树脂：依次DMF(10ml/g)洗一次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。

8、重复2至6步操作，如表1中氨基酸没有侧链修饰的GLP-1肽，或者具有侧链修饰的GLP-1肽所示，从右到左依次连接相应氨基酸。带有K₂₆或K₃₄修饰的，按照如下9方法合成。

9、合成K₂₆和/或K₃₄【N-ε-(N-α-烷酸-L-γ-glutamyl)】：加入10ml 2％水合肼反应30min去除Fmoc-Lys(Dde)-OH的保护基Dde，侧链氨基裸露，用DMF和甲醇交替洗涤六次，茚三酮检测为蓝色。称取550mg的Fmoc-GLU-OTBU，HOBT 250mg，用DMF溶解，并且加入0.3ml的DIC，混匀，加入到反应器中与赖氨酸侧链氨基反应1h，抽干，DMF洗涤4次，茚三酮检测为无色。向反应器中加入5ml 20％哌啶DMF溶液反应20min，去除Fmoc-GLU-OTBU的氨基保护集团Fmoc,用DMF和甲醇交替洗涤六次，茚三酮检测为蓝色；称取300mg棕榈酸，HOBT 250mg，用DMF溶解，并且加入0.3ml的DIC，混匀，加入到反应器中反应1h，抽干，DMF洗涤4次，茚三酮检测为无色；用甲醇洗涤2次抽干。合成K₂₆和/或K₃₄【N-ε-(N-α-烷酸)】：需要合成K【N-ε-(烷酸)】的，省略加入上述Fmoc-γ-Glu(tbu)-OH一系列反应步骤，在Dde-Lys(fmoc)脱fmoc基团后，直接接上烷酸基。用含2％水合肼反应30min去除序列赖氨酸保护基Dde，经过步骤8接上K₂₆和/或K₃₄修饰残基。

10、将缩合完成的多肽经过DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，抽干10min。茚三酮检测阴性。

11、脱除肽链最后N端氨基酸的FMOC保护基，检测呈阳性，溶液抽干备用。

12、按照下列方法洗树脂，依次DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，10min抽干。

13、从树脂上切割多肽：配制切割液(10毫升/g)：TFA 94.5％(J.T.BakerChemical Company)；水2.5％，ethanedithiol(EDT,Sigma-Aldrich Chemistry)2.5％和triisopropylsilane(TIS,Sigma-Aldrich Chemistry)1％。切割时间：120min。

14、对于单体肽-PEG修饰的类似肽，当按照上述方法合成的无侧链单体肽并切割多肽C末端为酰胺时，选择Fmoc-PAL-PEG-PS树脂进行二者的化学固相合成。合成结束后，将得到的侧链保护基的多肽树脂进行裂解，获得PEG修饰单体肽，PEG分子量为0.5-30KD。

15、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用***洗六次，然后常温挥干。

16、用如下方法HPLC纯化多肽、鉴定和置于-20℃避光保存。

二、单体肽的基因重组-化学修饰方法制备:本文保护的一些单体肽可以按上述固相合成，也可以按基因重组结合化学修饰方法合成，以G3和G9序列为例：基因重组：将有基因编码能力的变构G3单体肽或其类似一或两个拷贝(G9肽)的DNA序列***pMD-18质粒中，用KPN I和EcoRI双酶切后回收，将pET32a质粒同样双酶切后回收大片段。在T4连接酶作用下，将目的肽基因片段和pET32a片段连接，获得融合表达载体pET32a/Trx-EK-G3，用CaCl₂法将构建的质粒载体转化表达宿主菌BL21中。经0.5mM IPTG诱导表达产生TRX-EK-G3单体肽融合蛋白，融合蛋白经Ni-Sepharose层析纯化后，用肠激酶酶切除去TRX-EK(硫还氧蛋白-EK)，重组单体肽用C18反相柱纯化和冻干成干粉。侧链赖氨酸化学修饰：将单体肽(仅有单²⁶Lys结构)冻干粉(0.01mmol)溶于4℃水(5ml)中，用氢氧化钠溶液调至pH 12.5，2min后加入NMP(5ml)和三乙胺(20μl)，控温15℃加1M乙酸溶液至pH 10.5。加入N-棕榈酰基(或油酰基)-L-谷氨酸-5-琥珀酰亚胺酯-1-甲酯(0.012mmol)。反应完全2.5h后用氢氧化钠溶液调至pH12.8，15℃水解脱去甲氧基，反应2h后用1M乙酸溶液调至pH 6.8。将上述混合物冲洗到C4柱，用5％乙腈-水溶液洗去NMP后再用50％乙腈-水溶液洗脱，减压旋转浓缩后用RP-HPLC纯化，纯度大于95％，样品冻干得棕榈或油酰化GLP 1类似肽单体固体。

检验方法如下：

1、用HPLC纯化多肽：将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：高效液相色谱仪(分析型；软件Class-VP.Sevial System；厂商日本SHIMADZU)和Venusi MRC-ODS C18色谱柱(30×250mm，天津Bonna-Agela Technologies)。流动相A液：0.1％三氟醋酸水溶液，流动相B液：0.1％三氟乙酸-99.9％乙腈溶液(乙腈Fisher Scientific公司购买)。流速：1.0ml/min，上样体积30μl，检测波长220nm。洗脱程序：0～5min：90％A液+10％B液；5～30min：90％A液/10％B液→20％A液/80％B液。

2、最后将纯化后的有效溶液上冻干机冻干(冻干机Freezone Plus 6型号，LABCONCO厂商)，既得到成品。

3、鉴定：分别取少量的成品多肽，做HPLC分析其纯度：色谱柱(4.6x150mm)。流动相A液：0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B液：99.9％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液，流速：1.0ml/min，上样体积10μl，检测波长220nm。洗脱程序：0～5min：100％A液；5～30min：100％A液→20％A液/80％B液。要求测定纯度大于95％。具体方法参见我们授权专利(中国专利ZL201410612382.3)。

MS法鉴定多肽分子量:取纯度合格的多肽加入水溶解，加入5％乙酸+8％乙腈+87水溶解测试电喷雾离子化质谱测定分子量，具体方法参见我们授权专利(中国专利ZL201410612382.3)。

4、将粉末状的多肽，密封包装，-20℃避光保存。

二聚体的形成：将浓度为1mg/ml的上述最终制备的C端或肽链内部带有唯一半胱氨酸的单体肽，在pH＝9.5水溶液中溶解，37℃保温4小时，形成100％同源二聚体肽，二聚体肽通过Sephadex G-25层析分离获得和鉴定(在2×60cm G-25层析柱和自然流速下，二聚体组份为第一峰，残余杂质组份为第二峰)。二聚体肽可以通过无巯基还原剂-巯基乙醇的肽PAGE电泳或质谱，加以鉴定，具体方法参见我们授权专利(中国专利ZL201410612382.3)。

GLP-1类似肽单体以及二聚体由本研究室和部分肽委托商业公司合成，发明人通过HPLC纯度、ESI或激光飞行质谱和半胱氨酸氧化确认其结构。本发明合成的GLP-1类似肽单体和同源二聚体肽的氨基酸序列如表1和2所示。

实施例2本发明的GLP-1单体以及同源二聚体(G2～9和2G2～9系列)降糖效果的持久性：

1、实验方法：在广东省动物中心购买正常KM小鼠用于糖耐量测定(OGTT)用于筛选药物的降血糖活性和持久性。根据无差别的空腹血糖，雄性昆明小鼠(5周龄)被分成多组(NaCl-PB组,Liraglutide组,单体G2-G9系列和二聚体2G2～2G9系列组)(n＝6)。在经过两轮14小时进食-10小时禁食的适应期后，KM小鼠在每次10小时的禁食后立即进行糖耐量测定。背部皮下注射相同剂量单体或二聚体肽后30min，小鼠灌胃口服5％葡萄糖溶液，准确在35min测定鼠尾血糖值。血糖仪和血糖试纸为Bayer HeathCare LLC公司产品。以各组平均血糖值为判断标准：当各组OGTT平均血糖值连续两次高过同时间空白对照组平均血糖值时，测定停止，期间低于空白组血糖持续时间为药效持续时间。

2、实验结果

2.1口服葡萄糖耐受性试验：单次给药后，单次口服葡萄糖，小鼠尾部取血测定在0、10、20、40、60、120min血糖。单次OGTT结果显示，2G2或2G3组在10min内出现其葡萄糖峰值，而NaCl-PB、Liraglutide、G2和G3组没有高峰值，表明二聚体明显延迟吸收。随着时间的延长，2G2或2G3的降血糖作用较单体G2或G3强，但无显着性差异(图1)。

在单次相同剂量(1.126nmol)给药后，持续多天多次OGTT试验，单体G2～9和二聚体2G2～9的降糖持续时间结果如表1和2所示。以血糖平均值为判断标准，Liraglutide阳性药活性持续时间3天、2G2系列维持3-13天、2G3系列维持14-17天，2G4维持12-18天，2G5系列仅3-8天，2G6维持16-19天，2G7系列2-7天，2G8系列2-8天，2G9系列4-5天，各单体组约为其对应二聚体组的1/2-1/4持续时间。在这个测试中，G9和2G9系列因为C末端延长，降糖比活性大幅度降低，相同剂量引起较短持续时间。与NaCl-PB组和Liraglutide组相比，2G4、2G5、2G7和2G8系列组小鼠体重明显增加(P<0.05或0.01，0.001)(图2)。比较发现，2G3和2G6系列的二聚体肽持续时间较长，最长达19天。在2G3系列中的2G3肽不仅显示了14天持续降糖活性，而且体重持续减低最明显，加上选择Liraglutide为阳性对照药，它们的序列一致性最高，因此选择2G3肽进行体内II型糖尿病(T2D)的治疗以及后续的实验。

表1本发明合成的新型GLP-1单体肽的氨基酸序列和其相同剂量(1.126nmol)单次注射持续降糖时间(天)

表2新型GLP-1二聚体序列和其相同剂量(1.126nmol)单次皮下注射降糖活性持续时间

注：表中²⁶Lys[N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl)]和²⁶Lys[N-ε-(N-α-oleoyl-L-γ-glutamyl)]表示侧链ε氨基上烷酸谷氨酰【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰的赖氨酸；³⁴Lys[N-ε-(N-α-Palmitoyl)]和³⁴Lys[N-ε-(N-α-oleoyl)]表示侧链ε氨基上烷酸基修饰的赖氨酸；Palmitoyl和Oleoyl分别表示16和18碳的烷酸；PEG修饰单体肽C末端酰胺基；“|”表示二聚体中两个半胱氨酸之间形成的二硫键；表1、2中的“(G1肽)、(G9肽)、(G2肽)、(G3肽)、(2G1肽)、(2G2肽)、(2G3肽)、(2G4肽)、(2G5肽)、(2G6肽)、(2G7肽)、(2G8肽)”表示选取该序列肽作为该系列中的代表进行其他实验，这些实验以及附图中的名称与之相同对应。

实施例3二聚体对II型糖尿病模型治疗效果

一、构建II型糖尿病(T2D)小鼠模型

将C57Bl6/J小鼠放置于标准饮食的SPF级别环境中，自由饮水。所有的实验操作按照实验动物伦理与使用制度指导原则。按照标准饮食饲养天后，将5周龄的C57B16/J雄性小鼠分为6组：NaCl-PB、T2D模型对照组、Liraglutiade、低中高二聚体肽2G3或2G1组。NaCl-PB组为空白对照和T2D模型对照组为T2D模型对照，它们注射NaCl-PB溶液。T2D模型组喂60kcal％的高脂饮食(D12492,常州鼠一鼠二生物技术有限公司)，直到实验结束，空白对照组保持标准饮食直到实验结束。糖尿病模型的建立方法：高脂喂养小鼠4周后，腹腔注射75mg/kg链脲佐菌素(STZ，美国西格玛化学公司)，3天后用50mg/kg剂量的STZ重新腹腔注射，3周后血糖等于或大于11mM的小鼠视为糖尿病小鼠。这些组在高脂饮食的基础上，再进行35天的治疗研究。

二、对II型糖尿病治疗效果

1、肽的溶解度：不含Aib氨基酸组成的单体肽在水中显示悬浮状态，而其构成的所有同源二聚体肽在水中完全溶解；含有Aib氨基酸组成的单体肽在水中显示完全溶解，而其构成的同源二聚体肽在水中溶解略差。在这些肽中，C端酰胺化结构的肽较C端COOH结构肽有更大不溶性。所有二聚体肽分别用NaCl-PB(pH8.0)溶解可达高溶解性，不同剂量(低、中、高剂量)的2G3或2G1肽分别溶于Na₂HPO₄(pH8.0)缓冲的生理盐水溶液(NaCl-PB)中进行动物注射。单体肽溶解在生理盐水溶液注射(pH6.5)。

2、给药浓度设置：我们预实验显示，1.126nmol的利拉鲁肽可诱导T2D糖尿病模型(血糖达20mM)的餐后血糖值达到9-11mM。在该临界值下，阳性药利拉鲁肽与GLP 1二聚体的效应-剂量关系很容易被观察到。在糖耐量实验中，正常昆明小鼠臀部皮下注射单次剂量为1.126nmol的利拉鲁肽或单体肽或二聚体肽，每天早上9点剪尾采血测量血糖并称重。因为2G3二聚体的结构与利拉鲁肽相似，而当时国内能买到的阳性药是利拉鲁肽，所以选择利拉鲁肽为阳性对照，同时选择利拉鲁肽的给药方式(每天一次)。在T2D治疗研究中，在30min内，按每只100μl剂量臀部皮下注射所有T2D模型鼠，每五天测量实验鼠血糖，整个测定在40min内完成。二聚体2G3或2G1肽高中低剂量分别为3.378,1.126,0.375nmol/100μL，阳性药物利拉鲁肽剂量为1.126nmol/100μL(4.225μg/100μL，保存于-20℃，产品批号：No.8-9695-03-201-1，诺和诺德公司，瑞士)，每天注射一次直至35天实验结束。

3、T2D治疗后的体重变化：给药前，T2D模型体重至少比NaCl-PB组高2g，T2D模型组间体重无显著性差异。与模型对照组相比，Liraglutide组第5、20、25、30、35天体重均有快速下降(P<0.05)。各2G3肽组体重呈剂量依赖性下降，H-2G3(高剂量)组与Liraglutide组相似(图3)。2G1作为U型二聚体对模型小鼠体重无明显影响，与2G3作为H型二聚体有明显差异。

4、对T2D模型治疗中器官重量的影响：在T2D治疗实验中，利拉鲁肽导致体重减少，包括心、肾、肝、脂肪组织，证实了利拉鲁肽更强调节饮食的机理。实验组2G3显示体重呈剂量依赖式下降，2G3高剂量组和利拉鲁肽组相似，但是某些器官的重量是上升的，比如左肾，右睾丸以及脂肪组织。2G3使肝脏和脾脏重量增加(表3)。与Liraglutide或/和NaCl-PB或T2D模型对照组比较，各2G1组显示显著性肝、脾、脂肪组织重量的增加，或者右睾丸和胰腺重量降低(P<0.05,0.01或0.001)(见表3)。

表3：T2D模型器官重量的比较(均数±标准差，n＝10)

注：P<0.05*，0.0 1*，0.001；a，b，c，d，e分别表示与NaCl-PB、模型对照组、Liraglutide、L-、M-剂量组进行比较。

5、T2D治疗中的降血糖作用：与NaCl-PB组相比，T2D模型组有显著性低的糖化血红蛋白(HbA1c)(P<0.0 1或0.001)和FPG(P<0.0 1)，说明T2D模型制备成功。与T2D模型对照组相比，Liraglutide组空腹HbA1c降低(-29％)(P＜0.01)或FPG降低(-50.2％)(P<0.01)显著降低，2G3组HbA1c降低(-8，-23，-32％vs L-，M-，H-剂量)(P<0.05或0.01)或FPG值降低(-26.3，-46.9，-47.3％)(P<0.01)呈剂量依赖性下降。根据动态PPG变化结果(图4)，T2D组在用药前PPG没有明显差异。注射Liraglutide或2G3肽后，Liraglutide组的PPG水平明显下降，维持持续降低血糖作用，随给药次数越多，效果越好。2G3组PPG值呈剂量依赖性下降，M-2G3组的血糖变化与Liraglutide组相似。在35天的T2D治疗试验中，与Liraglutide组相比，H-2G3组在第5天和第25天的PPG水平较低(P<0.001)，L-2G3组在第10～35天的PPG水平显著高于Liraglutide组(P<0.05、0.01或0.001)。第10、20、25天的M-2G3组和第15、20天的H-2G3组的PPG水平均低于L-2G3组(P<0.05或0.01)。PPG或FPG、HbA1c在T2D治疗中产生类似的变化。2G1对T2DM模型无降血糖作用。

6、T2D治疗中的血液生化指标检测：在T2D治疗实验中，血生化指标有明显变化(表4)，空腹胰岛素水平在模型对照组(0.625±0.23ng/ml)和Liraglutide组(0.595±0.21ng/ml)远低于NaCl-PB组(1.411±3.01ng/ml)。2G3组空腹胰岛素呈剂量依赖性增加(0.626±0.23，1.141±0.66，1.568±1.79ng/ml)，且M-或H-2G3组胰岛素含量增加2.38倍，明显高于模型对照组、Liraglutide组和L-2G3组(P<0.05)。L-或H-2G3组血小板明显多于NaCl-PB组或/和模型对照组、Liraglutide组(P<0.05或0.01)。H-2G3组Hb值低于NaCl-PB组(P<0.05)，但对RBC和WBC无影响。2G3组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)或碱性磷酸酶(ALP)呈剂量依赖性下降，但ALP明显高于Liraglutide组(P<0.01或0.001)。M-或H-2G3组ALP或/和ALT水平均低于NaCl-PB组(P<0.05或0.01)，H-2D3组AST或ALT低于模型对照组(P<0.05)。与NaCl-PB组比较，T2D组白蛋白显著降低(P<0.001)，但是随2G3剂量依赖性增加。T2D模型组总胆固醇、高密度脂蛋白或低密度脂蛋白胆固醇较NaCl-PB组显著升高(P<0.001)。与Liraglutide组相比，各2G3组总胆固醇(P<0.001或0.05)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均显著升高(P<0.05)。Liraglutide组和H-2G3组总胆固醇或甘油三酯均显著低于模型对照组(P<0.05)。与NaCl-PB组相比，模型对照组、M-2G3组和H-2G3组淀粉酶显著升高(P<0.05或0.01)。

2G1组胰岛素呈剂量依赖性下降(P>0.05)。L-2G1组ALT水平高于NaCl-PB组和Liraglutide组，M-2G1组ALT低于模型对照组和L-2G1组(P<0.05或0.01)。M-2G1组AST明显低于L-2G1组(P<0.05)，H-2G1组AST明显高于M-2G1组(P<0.05)。与NaCl-PB或L-2G1组相比，M-2G1组ALP水平较低(P<0.05)。2G1组白蛋白呈剂量依赖性下降(P<0.0 5、0.0 1或0.001)，模型对照组白蛋白明显低于NaCl-PB组(P<0.0 5)。2G1组血肌酐较NaCl-PB或Liraglutide组低，呈剂量依赖性下降(P<0.0 5、0.0 1或0.001)。2G1组总胆固醇(T-CHO)或HDL-CHO呈剂量依赖性下降，而Liraglutide或2G1组T-CHO或/和HDL-CHO、LDL-CHO水平明显高于NaCl-PB组(P<0.0 1或0.001)。L-和M-2G1组T-CHO和HDL-C-CHO水平明显高于Liraglutide组(P<0.05或0.0 1)，和2G3一样，2G1明显促进HDL合成。H-2G1组HDL-CHO明显低于模型对照组(P<0.05)。各组间甘油三酯(TG)无显着性差异。有趣的是，与NaCl-PB组相比，2G1组淀粉酶呈剂量依赖性下降(P<0.05或0.01)，显示明显对胰腺外分泌部细胞的保护作用(见表4)。

表4：T2D模型血液生化指标(平均值±标准差，n＝10)

注：P<0.05*，0.01*，0.001；a，b，c，d，e分别与模型对照组，Liraglutide，L-，M-，H-剂量组进行比较。

实施例4二聚体对T2D模型治疗的病理检测：

1、H-E染色：T2D模型胰腺腺泡稀疏，核固缩明显，病理性空泡多。模型对照组胰岛细胞发生变形、萎缩和核固缩。Liraglutide组腺泡细胞呈强嗜酸性染色，细胞间隙变大。2G3或2G1肽组的腺泡细胞致密，与NaCl-PB组相比，腺泡细胞中无病理性空炮出现(图5)。

2、Ki 67蛋白荧光染色：用抗Ki 67抗体染色，观察Ki 67蛋白在T2D模型胰腺组织中的分布和定位。NaCl-PB组在胰岛周围或导管上皮及靠近导管的腺泡细胞中可见散在的阳性腺泡细胞。模型对照组在胰岛周围和外分泌细胞中有许多阳性腺泡细胞，如导管和腺泡细胞。在Liraglutide组中，小叶腺泡细胞呈分散的阳性分布，胰岛内阳性细胞较少，未见导管上皮细胞染色阳性。Liraglutide组Ki 67蛋白显著高于NaCl-PB组或模型对照组(P<0.05)。2G3组Ki 67呈剂量依赖性增加。与NaCl-PB组比较，L-或H-2G3组显着性增加(P<0.05)，L-2G3组与Liraglutide组比较有显着性差异(P<0.001)，显示2G3明显促进胰腺或胰岛细胞增殖(图6)。

模型对照组、Liraglutide组、H-2G1组明显高于NaCl-PB组(P<0.05或0.01)。Liraglutide组、H-2G1组与模型对照组或M-2G1组比较，有显着性差异(P<0.05)，M-2G1组Ki67表达低于Liraglutide组(P<0.01)。这些显示2G1明显促进胰腺细胞增殖(图7)。

3、TUNEL染色：模型对照组在小叶腺泡和导管上皮中可见大量阳性细胞，胰腺组织中可见散在的胰岛和部分胰岛阳性细胞。Liraglutide组小叶腺泡内有明显的阳性细胞，胰岛中有散在的阳性细胞，而未见或较少的阳性导管细胞。2G1组阳性小叶细胞较少或散在，导管细胞较少或无阳性。2G1组TUNEL阳性率呈剂量依赖性下降。Liraglutide组、M-2G1组和H-2G1组均显著低于NaCl-PB和模型对照组(P<0.05、0.01或0.001)。H-2G1组TUNEL阳性率低于Liraglutide组和M-2G1组(P<0.01)(图8)。显示，2G1肽明显保护胰腺细胞凋亡。各2G3组没有显示TUNEL阳性改变。

实施例5胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)分析

1、免疫组化(IHC)染色：2G3组GLP-1R呈剂量依赖性增加。与模型对照组相比，Liraglutide组和2G3组均显著升高(P<0.05和0.01)。H-2G3组GLP-1R表达明显高于Liraglutide组，模型对照组GLP-1R表达低于NaCl-PB组(P<0.0 5)(图9)。

2、Western blot分析：与模型对照组相比，Liraglutide组、L-2G2组或H-2G3组均显著增加(P<0.05)。模型对照组GLP-1R表达低于NaCl-PB组(P<0.05)(图10)。

实施例6胰岛素免疫组化分析

应用抗胰岛素抗体，观察胰岛素在T2D胰岛中的分布和位置(图11)。模型对照组和2G3组胰岛的胰岛素表达均低于NaCl-PB组(P<0.05)。2G3组胰岛素染色强度和胰岛数均呈剂量依赖性增加(P<0.05或0.01)。

总结：从上述实施例中，可以得出以下结论：基于药效持续时间的分类，清楚地将长和短效作用分子特征区分开来。显然，我们发展的同源二聚体2G3和2G6系列属于最长作用分子，以2G3肽为代表的二聚体肽通过与GLP-1R结合诱导胰岛素合成，在T2D模型产生降低血糖作用，在各种试验中评价了高活性GLP-1同源二聚体的生物学效应。这些研究表明，二聚体序列对啮齿类动物模型中的T2D表现出最有希望应用前景，如持续时间最长的降血糖效应和在减轻体重和器官毒性方面的副作用。

结构-活性关系表明，不含氨基异丁酸Aib的二聚体在水中有最好溶解性，具有Aib氨基酸结构二聚体，甚至带有C末端酰胺化结构，在水中溶解性较差，它们个别可以维持较长的活性。这些性质表明，在2G3肽中，包含⁸Ala序列的N-末端结构部分可能被二聚体中对称²⁶K-谷氨酰脂肪酸链包裹，形成疏水性基团核心，其外又被亲水性多肽链包围，不容易被DPP 4水解，维持较长效应。包含Aib氨基酸的序列，甚至C末端带有酰胺化结构，其Aib和酰胺化可能是外露的，在水中形成较低溶解性，因Aib不是DDP 4的底物，所以可以维持较长活性。氨基异丁酸(Aib)和β-Ala类似于L-α-Ala或Gly,β-Aib和β-Ala又是人体嘧啶核苷酸正常代谢产物，在人体中高度耐受，这些化合物的毒性反应应该很低，所以本发明用这些氨基酸进行取代显著延长降糖活性。

正常小鼠降血糖作用中，单次OGTT实验结果显示，二聚体通过在血液中缓慢吸收而产生较长的降血糖作用。多次OGTT实验结果表明，较长的持续时间效应涉及多肽第8位氨基酸、二聚体中二硫键位置、对称²⁶Lys脂肪酸修饰和C端酰胺化，与同一分子多个位点的Lys修饰无关。表2显示，长活性结构中含有⁸Aib、¹⁸Cys-Cys二硫键、对称油酰基-L-γ-谷氨酰基-²⁶Lys和C末端酰胺化。这些修饰特点特点如下：(1)α或β-Aib或β-Ala→⁸Ala代换产生更长活性，其中α-Aib代换产生最好效果；(2)与其他脂肪酸修饰比较，单油酰基-L-γ-谷氨酰基-²⁶Lys达到最好结果；(3)C末端酰胺化明显延长活性；(4)二聚体分子中第18位二硫键结构显示最好活性；(5)PEG修饰在延长半衰期同时，明显缩短比活性(每毫克降糖持续时间)；(6)单体肽活性仅是对应二聚体的1/2-1/4。

在T2D治疗实验中，2G3组HbA1c降低(-8，-23，-32％)或FPG值降低(-26.3，-46.9，-47.3％)和Liraglutide空腹HbA1c降低(-29％)或FPG降低(-50.2％)均有明显的降血糖作用，表明相同摩尔浓度的2G3肽和Liraglutide对PPG或FPG、HbA1c有相似的降低作用。

2G3组体重呈剂量依赖性下降，H-2G3组与Liraglutide组在体重或脂肪组织的重量曲线相似，提示其对饮食和脂肪代谢的影响较Liraglutide少。在制备T2D动物时，饮用水或食物中的统计数据也证实了这一点，但是某些器官的重量是上升的，比如左肾，右睾丸以及脂肪组织，显示该二聚体与利拉鲁肽相比，更少地影响饮食和脂肪代谢。2G3致使肝脏变重，谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及碱性磷酸酶呈剂量依赖式降低，显示药物对肝脏和心脏有着很强的保护作用，但是2G3导致比利拉鲁肽更高的碱性磷酸酶水平，显示更强的肝脏刺激。血小板数量和脾脏重量的增加显示2G3能够增强止血效果以保护T2D模型血管壁的完整性。2G3组中白蛋白呈剂量依赖式增加，显示可能与利拉鲁肽一样，通过结合白蛋白被转运。但是,与正常NaCl-PB组比较,所有T2D模型组的白蛋白显著减少，显示血糖过高引起的三高症状以及STZ导致白蛋白相对减少。2G3可诱导更多的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇显示其可增加胆固醇的合成。与利拉鲁肽组相比，2G3低剂量和中剂量组总胆固醇更高以及中剂量和高剂量组高密度脂蛋白更高，显示2G3通过增加高密度脂蛋白促进胆固醇的逆行运输。2G3中剂量和高剂量组显著性的胰腺肿大和淀粉酶增加说明了2G3对胰腺外分泌功能有一定的促进作用。2G3对肾、肺功能以及白细胞，红细胞，血红蛋白，肌酐，甘油三酯无影响。

2G1组表现为肝脏、脾脏的重量明显增重，谷丙转氨酶及谷草转氨酶升高，碱性磷酸酶及白蛋白水平降低，显示其较明显影响肝和脾功能。

在2G3对T2D治疗实验中，正常小鼠(HbA1c 7.3±2.45mM和FPG 5.171±4.24mM)诱导正常胰岛素水平(1.411±3.01ng/ml)和T2D对照鼠(HbA1c 20±5.03mM和FPG 14.149±5.95mM)诱导胰岛素值(0.625±0.23ng/ml)，但Liraglutide组(HbA1c 14.2±2.20mM和FPG7.042±1.63mM)诱导胰岛素(0.595±0.21ng/ml)，显示T2D诱导胰岛素耐受性明显升高，同时因为Liraglutide对饮食的抑制，诱导了较低的胰岛素水平。2G3组胰岛素含量(0.626±0.23，1.141±0.66，1.568±1.79ng/ml)呈剂量依赖性增加，这些胰岛素值对应Liraglutide组的百分比增量(+5.2，+91.8，+163.5％)，表明2G3比Liraglutide有更强诱导胰岛素水平，因而2G3具有更好的降糖作用。如果降糖效果根据胰岛素分泌量来评价，L-2G3组应该与Liraglutide组具有生物等效性关系，M-和H-2G3组的降糖效果应该加倍或更高，但M-2G3组实际上与Liraglutide组具有类似的降血糖作用，这反映了2G3在血糖水平降低到正常值时，即使使用更高剂量，也不会进一步诱导更大降糖效应，甚至诱发低血糖血症。本实验中，使用8和68倍的低剂量2G3也没有使13小时饥饿昆明小鼠(n＝6)在给药后3小时内中任何一个诱发低血糖效应，显示这类二聚体肽不会诱发低血糖。

H-E染色结果显示，与NaCl-PB组相比，2G3或2G1可引起较多胰腺腺泡细胞，无病理性空泡，可营救T2D模型引起的腺泡稀疏、多病理性空泡、胰岛细胞变形、萎缩或核固缩等病理损伤。2G3诱导Ki 67呈剂量依赖性增加，提示2G3促进胰腺细胞增殖。2G1组Ki 67蛋白表达明显高于Liraglutide组，而M-2G1组Ki 67表达低于Liraglutide组，说明2G1组对胰腺细胞的增殖能力弱于Liraglutide组。TUNEL染色显示，2G1组TUNEL阳性率呈剂量依赖性下降，H-2G1组TUNEL阳性率低于Liraglutide组和M-2G1组，说明2G1明显保护腺泡、导管等胰腺细胞免受STZ毒性或病理损伤。2G3明显诱导GLP-1R表达增加，胰岛素染色强度和胰岛数均呈剂量依赖性增加，提示2G3的降血糖作用是GLP-1R介导的，胰岛素释放增多，胰岛数增多。

我们的结论是，本发明保护的单体或二聚体肽通过与GLP-1R结合诱导更多的胰岛素释放，从而产生不同的降血糖或胰腺保护作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。