一种赤瓟花叶病毒的多克隆抗体制备及elisa检测方法
阅读说明：本技术 一种赤瓟花叶病毒的多克隆抗体制备及elisa检测方法 (Preparation and ELISA detection method of polyclonal antibody of Thladiantha dubia mosaic virus ) 是由 赵娜 赵敏 崔岱宗 苗艳梅 王宁 王珏玉 杨悦 韦庆慧 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：一种赤瓟花叶病毒的多克隆抗体制备及ELISA检测方法,所述制备方法包括如下步骤：以赤瓟花叶病毒核酸基因组RNA为模板,基于赤瓟花叶病毒保守CP蛋白核苷酸序列,采用引物ThDMV-CP1和ThDMV-CP2进行RT-PCR扩增,扩增产物经纯化后连接于pET-30a(+)表达载体上,并对CP蛋白进行表达和纯化,将纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔子,采集兔子血液,经亲和层析纯化获得赤瓟花叶病毒多克隆抗体。本发明利用ThDMV病毒制备出相应的特异性多克隆抗体,并建立了具有高特异性和灵敏性的相应的间接ELISA检测病毒方法,具有操作方便、灵敏度高、特异性强、成本低等优势,同时适于大批量样品检测。(A method for preparing polyclonal antibody of Thladiantha dubia mosaic virus and ELISA detection comprises the following steps: the Thladiantha dubia mosaic virus polyclonal antibody is obtained by taking the RNA of the Thladiantha dubia mosaic virus nucleic acid genome as a template, carrying out RT-PCR amplification by adopting primers ThDMV-CP1 and ThDMV-CP2 based on the conserved CP protein nucleotide sequence of the Thladiantha dubia mosaic virus, purifying and connecting an amplification product to a pET-30a (+) expression vector, expressing and purifying the CP protein, mixing the purified protein with Freund's adjuvant to immunize rabbits, collecting rabbit blood, and purifying by affinity chromatography. The invention utilizes ThDMV virus to prepare corresponding specific polyclonal antibody, establishes a corresponding indirect ELISA virus detection method with high specificity and sensitivity, has the advantages of convenient operation, high sensitivity, strong specificity, low cost and the like, and is suitable for detecting large-batch samples.)
技术领域
本发明属于赤瓟花叶病毒检测领域，涉及一种赤瓟花叶病毒多克隆抗体的制备方法与间接ELISA检测方法。
背景技术
赤瓟(Thladiantha dubia Bunge，Cucurbitaceae)是一种生长迅速的多年生蔓性草本植物，分布于东亚(从中国到南朝鲜半岛)以及欧洲，是我国东北地区仅有的三种野生葫芦科植物之一。该植物雌雄异株，雄花的花梗短而细，雌花的花梗长而粗，瓟果长卵形或广椭圆形，有块茎。花期7～8月，果期8～9月。该植物主要生长在灌木丛、路边、河岸边以及庄稼地或果园的边缘。赤瓟抗逆性较强，具有强大的竞争力，常蔓延成片生长，分布面积约20～100m2。
赤瓟的根、果实因其含有特殊的化学物质而具有独特的药理作用，是广受青睐的名贵中药。赤瓟的根可以用于治疗乳腺增生症，具有抗炎症作用，同时，根的分泌物还可以促进人***CaSKI细胞凋亡。赤瓟果实可以治疗各种类型的疼痛，如风湿病和腰腿痛、痛经等。赤瓟的研究主要集中在其栽培和药用活性方面。到目前为止，还没有关于赤瓟病毒感染的报道，可能是因为人们认为来自野生植物的病毒不会引起栽培植物的疾病。
在2015年7月的中药植物病害调查中，发现赤瓟的叶子具有严重的花叶症状，病理学尚未确定。赵娜等人利用分子生物学手段获得了一种新的Potyvirus病毒，命名为赤瓟花叶病毒(Thladiantha dubia mosaic virus,ThDMV)。该病毒属于马铃薯Y病毒属病毒，病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长680～900nm，直径11～13nm，螺旋对称结构。病毒基因组为单分子线形正义ssRNA，长度为10,112nt，不包括末端poly(A)，病毒具有一个大的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，编码一个大小约为35kDa多聚蛋白。编码的多聚蛋白可切割产生10个蛋白。该病毒目前与海南报道的番木瓜叶畸形花叶病毒(Papaya leaf distortionmosaic virus，PLDMV)最为相似，在核苷酸和氨基酸水平上相似度分别为74％和79％。由于该病毒发现于野生植物中，并且该赤瓟植物具有很好的广泛性和抗寒冷能力，赤瓟可能作为一个转主寄主，来帮助病毒越冬。因此，关于ThDMV的田间植物调查显得十分重要。
由于ThDMV是新发现的一种植物病毒，因此，急需灵敏度高、特异性强、成本低的快速检测方法的建立。
发明内容
本发明的目的是提供一种赤瓟花叶病毒多克隆抗体的制备与检测方法，利用ThDMV病毒制备出相应的特异性多克隆抗体，并建立了具有高特异性和灵敏性的相应的间接ELISA检测病毒方法，具有操作方便、灵敏度高、特异性强、成本低等优势，同时适于大批量样品检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种赤瓟花叶病毒多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、赤瓟花叶病毒核酸的提取和病毒外壳蛋白的扩增
以赤瓟花叶病毒核酸基因组RNA为模板，基于赤瓟花叶病毒保守CP蛋白核苷酸序列(如SEQ ID NO:1所示)，采用引物ThDMV-CP1(ThDMV-CP1：5’-TCTAACCTCGATGCAGGCAAAACCA-3’)和ThDMV-CP2(ThDMV-CP2：5’-TTAATAAAATCGAGCGCCTGCAAAT-3’)进行RT-PCR扩增；
步骤二、ThDMV-CP重组表达菌株的构建和蛋白表达纯化
扩增产物经纯化后连接于pET-30a(+)表达载体上，并对CP蛋白进行表达和纯化；
步骤三、纯化蛋白免疫动物以及抗体纯化
将纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得赤瓟花叶病毒多克隆抗体，该赤瓟花叶病毒多克隆抗体对ThDMV有特异性反应，而与其它植物病毒没有特异性反应。
一种上述赤瓟花叶病毒的ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)向研钵中加入包被液2mL，称取样品0.5g放入研钵中，用力研磨，直到样品完全研磨碎；
(2)吸取研磨液1.5mL，加入到2mL的灭菌离心管中，12000r/min、4℃离心15min；
(3)吸取上清100μL加入到酶标板中，37℃温浴2h；
(4)洗涤：倒掉抗原后，向板孔内加入200μL PBST溶液，每次静置3min后用力甩掉，重复三次；
(5)封闭：每个样品孔中加满封闭液，37℃恒温孵育2h；
(6)洗涤：用PBST溶液洗涤3次；
(7)孵育一抗：用兔抗的赤瓟花叶病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体作为一抗，每孔100μL，37℃孵育2h；
(8)洗涤：用PBST洗涤3次；
(9)孵育二抗：加入100μL碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h；
(10)洗涤：PBST洗涤3次；
(11)显示：每孔加入显色液，100μL/孔，显色20min；
(12)终止显色：每孔加入2M H2SO4 50μL终止显色；
(13)测定OD405值：酶标仪波长设置为405nm，测量每孔的OD值。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1、本发明利用原核表达系统获得分泌ThDMV的特异性抗体的表达菌，并建立了间接抗原ELISA检测方法，该检测体系具有较高的灵敏度，能特异性检测ThDMV病毒分离物，而不能与其它植物病毒发生反应。
2、本发明根据赤瓟花叶病毒的多克隆抗体作为一抗，建立间接ELISA检测方法来对赤瓟花叶病毒进行检测。
3、本发明用间接抗原ELISA方法具有特异性和较高的灵敏性，操作步骤简单、方便，受人们青睐。
4、本发明ELISA检测方法的建立，完全满足ThDMV病毒的灵敏、特异、快速检测需要，为进一步了解该病毒的发生流行进而预防控制打下基础。
5、本发明ELISA检测方法在植物病毒检测、诊断等鉴定中具有广泛的应用前景，不仅适用于实验室少量样品的检测，也适用于田间大规模样品的快速检测，因而具有很高的应用价值。
附图说明
图1为重组表达载体pET-CP构建图谱；
图2为Western blot分析ThDMV蛋白抗血清的特异性图片，1和2：所加样品为重组蛋白(1.5μg、3μg)，3和4：所加样品为赤瓟花叶病毒(10μL)；
图3为ELISA样品检测结果对比图，1～3：东北林业大学赤瓟样品，4、5：园艺分院赤瓟样品，6～8：绥化赤瓟样品，9～11：庄河赤瓟样品12～13：磐石赤瓟样品，阳性对照为ThDMV，阴性对照为PLDMV、PVY、PBS；
图4为用建立的间接ELISA方法对田间样品检测结果照片，1：赤瓟，2：辣椒，3：番茄，4：黄瓜，5：大豆，6：菜豆，7：茄子，8为PBS(阴性对照)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：ThDMV多克隆抗体的制备
(1)重组表达载体的构建
提取ThDMV病毒的基因组RNA(GenBank accession no.MF420353)，以基因组RNA为模板，进行反转录，采用引物ThDMV-CP1和ThDMV-CP2进行RT-PCR扩增，扩增产物经纯化后连接于pMD18-T克隆载体，得到重组载体pMD18T-CP，并测序验证基因序列。
将载体pMD18T-CP和表达载体pET-30a(+)分别经NdeI和HindIII双酶切，将含有粘性末端的酶切片段CP和pET-30a(+)通过T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pET-CP，转入大肠杆菌Top10感受态细胞，通过氨苄抗生素筛选获得阳性转化子并测序验证，将测序成功的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，通过含氨苄抗生素的LB固体培养基筛选阳性表达菌株，命名为pET-CP01。
(2)外源蛋白的诱导表达与纯化
将重组表达菌株pET-CP01甘油菌接入含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、180rpm/min条件下过夜培养12～14h，获得菌液；按照1％接种量接种至含50mg/L氨苄青霉素的新鲜LB培养基，在30℃、180rpm/min条件下培养至OD600为0.8，加入0.1mM IPTG，置于25℃条件下过夜培养，收获菌体、超声破碎菌体，利用镍柱纯化蛋白免疫兔子并获得抗血清。并用Western blot鉴定方法来检测血清的特异性(图2)。
(3)抗血清的制备
免疫前从兔子耳缘静脉取血0.5～1mL，分离抗血清，作为免疫前的背景，备用。用纯化的CP蛋白免疫新西兰大耳白兔，共免疫4次(第1与第2次免疫间隔3周，第2～4次免疫间隔均为2周)，每次的蛋白量为1mg。第1次与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后分别在兔子的背部皮内多点注射，第2～4次与等体积的弗氏不完全佐剂混合，注射皮下4点。第4次免疫10d后耳缘静脉取血，37℃静置1h，4℃静置过夜，6000rpm/min离心20min，分离抗血清。然后利用间接ELISA检测效价，若效价达标，则在效价测定的第2d以心脏穿刺的方法采血，并分离抗血清，保存于-80℃。
实施例2：ThDMV间接抗原ELISA检测方法的建立
(1)向研钵中加入包被液2mL，称取样品0.5g放入研钵中，用力研磨，直到样品完全研磨碎。
(2)吸取研磨液1.5mL，加入到2mL的灭菌离心管中，12000r/min、4℃离心15min。
(3)吸取上清100μL加入到酶标板中，37℃温浴2h。
(4)洗涤：倒掉抗原后，向板孔内加入200μL PBST溶液，每次静置3min后用力甩掉，重复三次(下面洗涤方法与此相同)。
(5)封闭：每个样品孔中加满封闭液，约300μL/孔，37℃恒温孵育2h。
(6)洗涤：用PBST溶液洗涤3次。
(7)孵育一抗：用兔抗的赤瓟花叶病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体作为一抗，每孔100μL/孔，37℃孵育2h。
(8)洗涤：用PBST洗涤3次。
(9)孵育二抗：加入100μL碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG(羊抗兔IgG：PBST为1：5000)，37℃孵育1h。
(10)洗涤：PBST洗涤3次。
(11)显示：每孔加入显色液(NBT/BCIP碱性磷酸酯酶显色剂)，100μL/孔，显色20min。
(12)终止显色：每孔加入2M H2SO4 50μL终止显色。
(13)测定OD405值：酶标仪波长设置为405nm，测量每孔的OD值。
赤瓟花叶病毒的多克隆抗体间接ELISA检测方法中，也可以用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(羊抗兔IgG：PBST为1：5000)作为二抗，以TMB作为显色剂，来对赤瓟花叶病毒进行检测。
实施例3：间接ELISA方法对田间样品的检测应用实例
用建立的间接ELISA方法对不同地区的赤瓟病叶样品进行检测。ELISA样品检测结果如图3所示，1～3：东北林业大学赤瓟样品，4、5：园艺分院赤瓟样品，6～8：绥化赤瓟样品，9～11：庄河赤瓟样品12～13：磐石赤瓟样品，阳性对照为ThDMV，阴性对照为PLDMV、PVY、PBS。
用建立的间接ELISA方法对田间赤瓟、辣椒、番茄、黄瓜、大豆、菜豆、茄子作物病叶样品进行检测。图4所示的测定结果表明：ThDMV在赤瓟中被检测出病毒存在。
检测步骤为：
(1)向研钵中加入包被液2mL，称取样品0.5g放入研钵中，用力研磨，直到样品完全研磨碎。
(2)吸取研磨液1.5mL，加入到2mL的灭菌离心管中，12000r/min、4℃离心15min。
(3)吸取上清100μL加入到酶标板中，37℃温浴2h。
(4)洗涤：倒掉抗原后，向板孔内加入200μLPBST溶液，每次静置3min后用力甩掉，重复三次(下面洗涤方法与此相同)。
(5)封闭：每个样品孔中加满封闭液，约300μL/孔，37℃恒温孵育2h。
(6)洗涤：用PBST溶液洗涤3次。
(7)孵育一抗：用兔抗的赤瓟花叶病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体作为一抗，每孔100μL/孔，37℃孵育2h。
(8)洗涤：用PBST洗涤3次。
(9)孵育二抗：加入100μL碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG(羊抗兔IgG：PBST为1：5000)，37℃孵育1h。
(10)洗涤：PBST洗涤3次。
(11)显示：每孔加入显色液(NBT/BCIP碱性磷酸酯酶显色剂)，100μL/孔，显色20min。
(12)终止显色：每孔加入2M H2SO4 50μL终止显色。
(13)测定OD405值：酶标仪波长设置为405nm，测量每孔的OD值。
表1 间接ELISA检测ThDMV-CP抗血清效价
<110> 东北林业大学
<120>一种赤瓟花叶病毒的多克隆抗体制备及ELISA检测方法
<160> 1
<210> 1
<211> 898
<212> DNA
<213> 赤瓟花叶病毒的CP序列
<400> 1
catatgtcta acctcgatgc aggcaaaacc aatgatgaga tcaagaagga aaaggaggaa 60
aatgagcgga aagagagaga acgtaatgaa aagaaagaaa aagacaaaaa taaagaagtt 120
gtgaaggaac ctgagacgac ttcggacggt acccatggta ctgtggttcc aactagtaag 180
gacaaagatg ttgacgtagg ctcgagtgga tcatttgcta taccacgcat taagtcaata 240
tcagataaac tagcaatgcc aaagatcaaa ggggaaggaa ttttgaattt gggatttctg 300
ttgcaataca atccaaatca agttgatatc tccaacacaa gagcaagcgc ttcacaattc 360
caaacatggt acgaagcggt gaaggaatca tacggagtaa ctgatgacga gatgggaatc 420
attctgaatg gtttcatggt ttggtgtatt gagaatggaa tttctccaaa cattaatggc 480
atgtggttta tgatgcaagg ggacgatcag attgagtatc cccttcaacc tattgtagaa 540
aacgcaaaac ccactttgcg tcaaattatg gctcacttca gcaatgttgc tgaggcttac 600
attgaaaaga gaaattatga gaagccatat atgccgaggt acggtatcca acggaacctc 660
accgacatga gtttggcgcg atttgctttt gatttctacg aaatgacatc aaggacgcca 720
gctcgggccc gggaagccca catccaaatg aaagcagcag ctctcaggaa ttcaaacacg 780
agaatgtttg gtttggatgg aaaagtcgga aatgcgactg aggacacgga gcgccacaca 840
gcagatgatg ttaacagaaa cacacacgga tttgcaggcg ctcgatttta ttaagctt 898