阅读说明：本技术 一种抗错配修复蛋白mlh1单克隆抗体及其免疫检测应用 (Anti-mismatch repair protein MLH1 monoclonal antibody and immunodetection application thereof ) 是由 张乾坤 叶露 任琪 张冉冉 王成林 钮倩 付伟 何为无 于 2019-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,公开了一种杂交瘤细胞株OTI4H4(保藏编号为CGMCC No.18199)分泌的抗错配修复蛋白MLH1的单克隆抗体。本发明还涉及OTI4H4分泌的单克隆抗体在制备用于检测错配修复蛋白MLH1的免疫检测工具中的应用,包含免疫组织化学检测试剂盒与标记肿瘤试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与错配修复蛋白MLH1特异性结合,显著提高了错配修复蛋白MLH1免疫检测的特异性和可靠性。(The invention relates to the technical field of biology, and discloses a monoclonal antibody of an anti-mismatch repair protein MLH1 secreted by a hybridoma cell strain OTI4H4 (with the preservation number of CGMCC No. 18199). The invention also relates to application of the monoclonal antibody secreted by the OTI4H4 in preparing an immunodetection tool for detecting the mismatch repair protein MLH1, and application of the monoclonal antibody in an immunohistochemical detection kit and a tumor labeling kit. The monoclonal antibody can be specifically combined with the mismatch repair protein MLH1, and the specificity and reliability of immunodetection of the mismatch repair protein MLH1 are obviously improved.)

一种抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体及其免疫检测应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株OTI4H4分泌的单克隆抗体与错配修复蛋白MLH1特异性结合用于免疫检测的方法和应用。

背景技术

错配修复系统(mismatch repair，MMR)是细胞内基因组准确复制和稳定的基本保证。MMR蛋白在修复机制中发挥着重要作用,可识别DNA复制过程中出现的错配碱基,并进行水解和修复,从而维持遗传物质的稳定性。但是，MMR基因突变或启动子甲基化使机体细胞错配修复功能缺失，引起基因组的不稳定可导致肿瘤的发生。

MutL同系物1(mutL homolog1，MLHl)是错配修复基因家族中的重要成员之一，其在保持遗传信息的完整性，避免遗传突变的产生具有重要的作用。MLHl基因定位于3p21.3，是DNA错配修复的高密度分布区，启动区甲基化引起MLHl基因表达的沉默，从而导致了错配修复功能的失活。研究显示，MLHl在多种肿瘤组织中均有表达，其的功能缺陷被认为是肿瘤发病的重要机制，已成为近年来研究的热点。MLHl基因启动子发生高甲基化时，其表达水平降低并使DNA碱基错配修复功能下降，导致在DNA复制过程中发生错误，最终诱发肿瘤。MLHl蛋白缺失导致肿瘤细胞难以应对DNA损伤时对肿瘤细胞自身的影响，由于MMR系统功能缺失导致的肿瘤往往恶性程度较低。

目前临床上主要通过免疫组织化学(简称免疫组化，Immunohistochemistry，IHC)病理实验检测肿瘤组织中错配修复蛋白MLH1的表达状况，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对错配修复蛋白MLH1的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与错配修复蛋白MLH1特异性结合的单克隆抗体，及其在制备用于检测错配修复蛋白MLH1的免疫检测工具中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种能分泌抗GPA33蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株OTI4H4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2019年7月11日，保藏编号为CGMCC No.18199。

本发明还提供了一种特异性结合错配修复蛋白MLH1的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株OTI4H4分泌。

本发明所述单克隆抗体制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：基因合成MLH1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，ORF长度为660bp，相对应的错配修复蛋白MLH1包括第339-558氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示，氨基酸长度为220aa。将合成的错配修复蛋白MLH1的ORF***表达载体pET23a-His(购于Origene公司)，构建错配修复蛋白MLH1的重组表达质粒pET23a-His-rMLH1。

(2)重组错配修复蛋白MLH1的表达与纯化：将构建的错配修复蛋白MLH1重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的重组错配修复蛋白MLH1。

(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组错配修复蛋白MLH1免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗错配修复蛋白MLH1的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体。通过免疫检测方法，如蛋白印记(Western-blot，WB)、免疫组织化学实验(IHC)，验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够分泌抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为OTI4H4，亚型鉴定为IgG2a，并于2019年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18199。

本发明还提供了由杂交瘤细胞株OTI4H4分泌的单克隆抗体在制备用于检测错配修复蛋白MLH1的免疫检测工具中的应用。

作为优选，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

本发明还提供一种免疫组织化学检测试剂盒，包括由杂交瘤细胞株OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体，可检测组织细胞中错配修复蛋白MLH1的表达状况。

此外，本发明还提供了杂交瘤细胞株OTI4H4分泌产生的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。

作为优选，所述肿瘤细胞包括结肠癌细胞系(LoVo)，MLH1缺失结肠癌细胞系(HCT116)，肾癌细胞系(TK-10)，乳腺癌细胞系(MCF-7)，***癌细胞系(Lncap)和***细胞系(Hela)；肿瘤组织包括结肠癌，MLH1缺失结肠癌，乳腺癌，***癌，甲状腺癌，淋巴瘤和胰腺癌。

本发明提供了由杂交瘤细胞株OTI4H4可稳定分泌的单克隆抗体，且与错配修复蛋白MLH1特异性结合，显著提高了错配修复蛋白MLH1免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤中错配修复蛋白MLH1的标记。

生物保藏信息说明

用于保藏分泌抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体的杂交瘤细胞株OTI4H4的分类命名为：鼠抗人错配修复蛋白MLH1单克隆杂交瘤细胞株

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏日期：2019年7月11日

保藏编号：CGMCC No.18199

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1所示为实施例1中MLH1的ORF克隆位点设计图。

图2所示为实施例2中WB检测重组错配修复蛋白MLH1的结果图，以anti-His检测重组错配修复蛋白MLH1在E.coli细胞中的表达。其中泳道L为转染空载体的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果；泳道R为转染pET23a-His-rMLH1质粒的E.coli细胞裂解液抗原的检测结果。

图3所示为实施例2中SDS-PAGE电泳检测重组错配修复蛋白MLH1的结果图，用镍亲和层析柱纯化重组错配修复蛋白MLH1，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色。

图4所示为实施例4中OTI4H4分泌的单克隆抗体WB检测各种癌细胞系蛋白裂解液中的错配修复蛋白MLH1表达的结果图。其中1-6泳道分别为人的结肠癌细胞系(LoVo)，MLH1缺失结肠癌细胞系(HCT 116)，肾癌细胞系(TK-10)，乳腺癌细胞系(MCF-7)，***癌细胞系(Lncap)和***细胞系(Hela)的裂解液为抗原的检测结果。

图5所示为实施例5中OTI4H4分泌的单克隆抗体IHC检测肠癌组织中的错配修复蛋白MLH1表达分布的结果图，箭头指示为错配修复蛋白MLH1阳性表达的肠癌细胞(一抗为OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体，1μg/ml)。

图6所示为实施例5中OTI4H4分泌的单克隆抗体IHC检测MLH1缺失肠癌组织中的错配修复蛋白MLH1表达分布的结果图，箭头指示为MLH缺失的肠癌细胞(一抗为OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体，1μg/ml)。

图7所示为实施例6中OTI4H4分泌的单克隆抗体与ES05抗体IHC检测乳腺癌，***癌，甲状腺癌，淋巴瘤和胰腺癌组织中错配修复蛋白MLH1表达灵敏性对比图(一抗分别为OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体，1μg/ml；ES05抗体，226μg/ml)。

具体实施方式

本发明公开了由杂交瘤细胞株OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体用于免疫检测的方法和应用。下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，相关人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：错配修复蛋白MLH1重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司购得的质粒RC201607(含MLH1的ORF 660bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆ORF第1018bp至1674bp到表达载体pET23a-His，建立错配修复蛋白MLH1片段(339-558aa)的重组表达质粒pET23a-His-rMLH1。MLH1的ORF克隆位点设计如图1所示。

实施例2：重组错配修复蛋白MLH1的表达与纯化

1.实验方法

(1)转化E.coli细胞：将100μl感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀，冰浴30min后42℃热激90sec，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500μl新鲜无抗LB培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

(2)裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至OD值达到0.4～0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7hrs。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定，见图2。

(3)镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后，将符合要求的洗脱蛋白合并后加入10％甘油，纯化后的重组错配修复蛋白MLH1用SDS-PAGE电泳鉴定，见图3。

2.实验结果

(1)由图2结果可见，转染pET23a-His-rMLH1质粒的E.coli细胞裂解液中WB检测后大约在35kD处有明显的特异条带(R)，分子量与预期分子量大小一致，而转化空载体的对照裂解液(L)中则没有相应大小的条带。表明细胞中重组错配修复蛋白MLH1蛋白特异表达。

(2)由图3结果可见，纯化的蛋白在SDS-PAGE电泳胶上35kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的重组错配修复蛋白MLH1。

实施例3：OTI4H4分泌抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用纯化的重组错配修复蛋白MLH1(以下简称MLH1抗原)用于对BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1.动物免疫：经过纯化的MLH1抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2.细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(pH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3.筛选和克隆：融合7-10天内挑选杂交瘤细胞克隆，使用纯化的重组错配修复蛋白MLH1进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD₂₈₀阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为OTI4H4。

4.细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株OTI4H4用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个细胞时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，据抗体亚型选择相应柱料进行纯化(亚型为IgG2a，采用protein G柱料进行纯化)。对纯化后的单抗浓度测定，冻干和分装(100ug/管)，最后保存在-20℃。

实施例4：OTI4H4分泌抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体的WB检测

分别以结肠癌细胞系(LoVo)，MLH1缺失结肠癌细胞系(HCT 116)，肾癌细胞系(TK-10)，乳腺癌细胞系(MCF-7)，***癌细胞系(Lncap)和***细胞系(Hela)的裂解液为抗原，以实施例3制备的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体作为一抗，进行WB检测，结果见图4。

由图4结果可见，错配修复蛋白MLH1在LoVo，TK-10，MCF-7，Lncap和Hela中均有表达，表明实施例3制备的由OTI4H4分泌的单克隆抗体可特异地识别LoVo，TK-10，MCF-7，Lncap和Hela细胞中内源的错配修复蛋白MLH1蛋白。而在MLH1缺失结肠癌细胞系(HCT 116)中，检测不到错配修复蛋白MLH1。最终结果表明所述OTI4H4分泌抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体能特异地WB检测错配修复蛋白MLH1蛋白。

实施例5：OTI4H4分泌抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体的IHC检测

1.实验方法：

(1).取***固定的肠癌与MLH1缺失肠癌组织块进行石蜡包埋，使用Leica组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

(2).脱蜡与水化：分析纯二甲苯10min×3次，无水乙醇10min×3次，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

(3).加入抗原修复液[1mM EDTA,10mM Tris buffer(pH8.0)]高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

(4).使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

(5).加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

(6).去除封闭液，勿冲洗，加入OTI4H4分泌的单克隆抗体(1μg/ml)，置于湿盒中，37℃孵育60min。用PBST(0.1％Tween-20)洗涤5min×2次。PBST(0.02％Tween-20)洗涤5min。

(7).滴加Polink-试剂盒2(Catalog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤5min×3次。滴加Polink-2试剂盒试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤5min×3次。

(8).应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3-10min。蒸馏水洗涤。

(9).苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

(10).脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min×3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇5min×3次；二甲苯5min×3次，中性树胶封片。

(11).镜检，见图5和图6。

2.实验结果：

(1).由图5结果可见，杂交瘤细胞OTI4H4分泌的单克隆抗体IHC检测出肠癌组织癌细胞中错配修复蛋白MLH1呈特异性细胞核表达，箭头指示为错配修复蛋白MLH1阳性表达的肠癌细胞。

(2).由图6结果可见，杂交瘤细胞OTI4H4分泌的单克隆抗体IHC检测MLH1基因缺失的肠癌组织癌细胞中错配修复蛋白MLH1无表达，仅在淋巴细胞与***中呈特异性细胞核表达，箭头指示为MLH缺失的肠癌细胞。

结果表明本发明所述的杂交瘤细胞OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体能够特异性识别肠癌癌细胞中的错配修复蛋白MLH1，不识别MLH1缺失肠癌癌细胞中的MLH1蛋白。

实施例6、OTI4H4分泌的单克隆抗体与通用ES05抗体的灵敏度比较

通过与目前临床中应用的抗体进行对比实验，发掘OTI4H4分泌的单克隆抗体的创新价值。DAKO公司开发的ES05抗体是目前临床IHC检测错配修复蛋白MLH1的“金标准”抗体，利用IHC方法分别以实施例3制备的由OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体(1μg/ml)和DAKO公司的ES05抗体(226μg/ml)为一抗，按照实施例5所述的方法对乳腺癌，***癌，甲状腺癌，淋巴瘤和胰腺癌组织进行染色，比较两种抗体的灵敏度。

结果如图7所示，OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体和ES05抗体在乳腺癌，***癌，甲状腺癌，淋巴瘤和胰腺癌组织中的染色模式一致，OTI4H4分泌的单克隆抗体(1μg/ml)浓度是ES05抗体(226μg/ml)的1/200以下，但OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体在各组织中染色强度高于ES05抗体，说明OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体灵敏度更高。

综合以上结果说明本发明所述OTI4H4分泌的抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体要优于临床应用的ES05抗体。

序列表

<110> 无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120> 一种抗错配修复蛋白MLH1单克隆抗体及其免疫检测应用<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 660

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tcctccagga tgtacttcac ccagactttg ctaccaggac ttgctggccc ctctggggag 60

atggttaaat ccacaacaag tctgacctcg tcttctactt ctggaagtag tgataaggtc 120

tatgcccacc agatggttcg tacagattcc cgggaacaga agcttgatgc atttctgcag 180

cctctgagca aacccctgtc cagtcagccc caggccattg tcacagagga taagacagat 240

atttctagtg gcagggctag gcagcaagat gaggagatgc ttgaactccc agcccctgct 300

gaagtggctg ccaaaaatca gagcttggag ggggatacaa caaaggggac ttcagaaatg 360

tcagagaaga gaggacctac ttccagcaac cccagaaaga gacatcggga agattctgat 420

gtggaaatgg tggaagatga ttcccgaaag gaaatgactg cagcttgtac cccccggaga 480

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gaggttctcc gggagatgtt gcataaccac tccttcgtgg gctgtgtgaa tcctcagtgg 600

gccttggcac agcatcaaac caagttatac cttctcaaca ccaccaagct tagtgaagaa 660

<210> 2

<211> 145

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

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