针对cd19的全人源抗体或抗体片段、嵌合抗原受体及应用
阅读说明：本技术 针对cd19的全人源抗体或抗体片段、嵌合抗原受体及应用 (Fully human antibody or antibody fragment aiming at CD19, chimeric antigen receptor and application ) 是由 杨光 于 2019-12-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了针对CD19的全人源抗体或抗体片段、嵌合抗原受体及应用。该抗体或抗体片段或编码该抗体或抗体片段的核酸能够用于制备宿主细胞、慢病毒质粒和诊断肿瘤以及靶向性抗肿瘤药物等。本发明的抗体或抗体片段能够高特异性的与人源CD19蛋白结合。(The invention discloses a fully human antibody or antibody fragment aiming at CD19, a chimeric antigen receptor and application. The antibody or antibody fragment or the nucleic acid encoding the antibody or antibody fragment can be used for preparing host cells, lentiviral plasmids, tumor diagnosis, targeting antitumor drugs and the like. The antibody or antibody fragment of the invention can be combined with human CD19 protein with high specificity.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及针对CD19的全人源抗体或抗体片段及应用。
背景技术
B细胞恶性肿瘤是常见的恶性血液肿瘤，一线临床治疗虽然具有一定疗效，但复发率高、预后差，而CD19作为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点受到极大的关注。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因此CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。
靶向CD19的各种免疫治疗策略正在实验室和临床展开，包括Fc段修饰抗体、抗体-药物偶联物、双特异性抗体、嵌合抗原受体修饰T细胞等，在白血病和淋巴瘤中取得了令人鼓舞的治疗效果，有力地推动了靶向免疫治疗的发展。
CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy)。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效的新型细胞疗法，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T技术经历一个漫长的演化过程，该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。
这种新的治疗策略的关键之处在于识别靶细胞的被称作嵌合抗原受体(chimericantigen receptor,CAR)的人工受体，而且在经过基因修饰后，病人T细胞能够表达这种CAR。在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞，然后在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，T细胞就能够表达这种新的受体。这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。这些T细胞利用它们表达的CAR受体结合到靶细胞表面上的分子，而这种结合触发一种内部信号产生，接着这种内部信号如此强效地激活这些T细胞以至于它们快速地摧毁靶细胞。
发明内容
本发明的目的是提供针对CD19的全人源抗体或抗体片段、嵌合抗原受体及应用。该抗体或抗体片段靶向性高，能够特异性的与人源CD19蛋白结合，能够用于治疗与CD19表达相关的血液学癌症。
为了达到上述目的，本发明提供了针对CD19的全人源抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区包括三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述的轻链可变区包括三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：3、4、5、6、7、8所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：11、12、13、14、15、16所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：19、20、21、22、23、24所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：27、28、29、30、31、32所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：35、36、37、38、39、40所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：43、44、45、46、47、48所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：51、52、53、54、55、56所示；或者
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：59、60、61、62、63、64所示。
较佳地，该抗体或抗体片段的抗CD19结合结构域是scFv，抗CD19结合结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58中任意一项所示的序列，或与这些序列具有95-99％同一性的同功能序列。
较佳地，所述scFv的氨基酸序列包括对序列SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58进行修饰而获得的序列，被修饰的氨基酸至少为一个、两个或三个但不超过30个。
较佳地，该抗体或抗体片段的抗CD19结合结构域是scFv，所述scFv的核酸序列包括SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57中任意一项所示的序列，或与这些序列具有95-99％同一性的同功能序列。
较佳地，所述的scFv包括对序列SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57进行修饰而获得的序列，被修饰的核酸至少为一个、两个或三个但不超过30个。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体含有上述的针对CD19的全人源抗体或抗体片段。
较佳地，该嵌合抗原受体包含依次连接的：信号肽序列、CD19结合结构域、检测标签、铰链区和跨膜结构域，以及功能性信号传导结构域：
所述的信号肽序列包含CSF2RA；
所述的检测标签包含C-myc；所述的CD19结合结构域包含scFv，该scFv包括所述的针对CD19的全人源抗体或抗体片段；
所述的铰链区和跨膜结构域包含：铰链区Hinge TM和跨膜结构CD8，
所述的功能性信号传导结构域包含：依次连接的CD28、4-1BB和CD3 Zeta。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含上述的嵌合抗原受体。
本发明还提供了一种慢病毒质粒，该质粒包含能够编码上述的针对CD19的全人源抗体或抗体片段的核苷酸序列。
本发明还提供了上述的针对CD19的全人源抗体或抗体片段的应用，所述的针对CD19的全人源抗体或抗体片段用于制备诊断肿瘤以及靶向性抗肿瘤药物。
有益效果：
(1)本发明的抗体或抗体片段能够高特异性的与人源CD19蛋白结合，利用嵌合抗原受体技术(CAR-T技术)在T细胞中工程化表达整合在CAR中的、结合CD19的人源抗体片段，得到的嵌合抗原受体T细胞能够用于治疗与CD19表达相关的血液学癌症。
(2)本发明的嵌合抗原受体能够靶向恶性B细胞肿瘤疾病细胞表面标识分子CD19。
附图说明
图1为慢病毒亚库质粒图谱。
图2为慢病毒亚库包装绿色荧光信号结果。
图3为慢病毒感染宿主细胞jurkat荧光信号结果。
图4a为以空白宿主细胞jurkat为对照，通过细胞分选获得表达绿色荧光报告基因的细胞，即右图中Q2\Q3中的细胞群。
图4b为将分选获得表达CAR基因的宿主细胞jurkat与阴性细胞K562、阳性细胞Raji共孵育，以阴性细胞为对照，通过细胞分选获得表现APC荧光信号的细胞，即右图中右侧的细胞群。
图5a为以高表达CD19的Raji细胞作为空白对照，FMC63为阳性对照，流式结果显示纯化抗体3-F11、4-H3、1-B11、3-H5都可以很好地识别Raji细胞表面的CD19抗原.
图5b为以高表达CD19的Raji细胞作为空白对照，FMC63为阳性对照，流式结果显示纯化抗体C135、C13、C20、C25都可以很好地识别Raji细胞表面的CD19抗原。
图6为与靶细胞孵育的效应宿主细胞jurkat的激活(anti-CD69-APC/anti-CD69-PE荧光抗体的检测)说明抗CD19的全人源抗体C13、C20、C25、C135、3-F11、4-H3、1-B11、3-H5都能够较好地识别Raji细胞表面的CD19。
具体实施方式
术语定义
“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。抗体包括单链抗体。
“重链”由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。
“轻链”由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。
“scFv”：单链抗体(single—chain antibody fragment)，由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。
“重链可变区”和“轻链可变区”可进一步再分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，CDR散布在被称为“构架区”(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FRI、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4，重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。本发明中，重链可变区的CDRl、、CDR2、、CDR3分别表示为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区的CDRl、、CDR2、、CDR3分别表示为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
“恒定区”可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
“抗原结合结构域”是指保留与抗原(如CD19)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。
“单克隆抗体”是指由单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位(被抗原受体特异性识别的抗原部分)的特异性结合和亲和性。
“嵌合抗原受体”由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链和重链组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体、跨膜区域和胞内信号转导区组成。
“CAR-T技术”指嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞。
“95-99％同一性”是指95％以上(最佳地98％以上)的同源性。
“修饰”是氨基酸或核苷酸的变异形式，包括一个或多个(通常为1～50个，较佳地1～30个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)的氨基酸或核苷酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳为10个以内，更佳为5个以内)氨基酸或核苷酸，但不会改变蛋白质或核酸的功能。
本发明提供了一种针对CD19的全人源抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段的抗CD19结合结构域为scFv，所述scFv的氨基酸序列具体如表1所示。
scFv的氨基酸序列
本发明提供的编码scFv的核酸序列包括SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57所示的序列，根据各条序列中碱基所对应的密码子，翻译为氨基酸序列后，对应的scFv的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2、10、18、26、34、42、50、58所示的序列。
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
部分材料来源说明如下：
CD19蛋白：Human CD19(购自Acrobiosysterms，货号为CD9-H8259。
人单链抗体的噬菌体抗体库：由常州费洛斯药业科技有限公司构建。
链霉亲和素磁珠：购自Invitrogen公司。
酶联免疫微孔板：96半孔低透平底微孔板(购自Corning公司)。
Anti-M13 HRP抗体：购自Thermo Fisher公司。
M13辅助噬菌体：购自Invitrogen公司。
SOC培养基：购自上海生工。
pCGMT噬菌体载体：购自Addgene公司。
XL1-blue细菌：购自安捷伦公司，货号为200228。
LB固体培养基平板：将5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，10g琼脂粉溶于1L的双蒸水中，在121℃高温下高压灭菌，然后倒在平板上。
显影液ABTS溶液：购自Thermo Fisher公司，货号为002024。
Gelred核酸染料：购自Thermo Fisher公司。
pFUSE表达载体：购自Invitrogen公司。
质粒抽提试剂盒：购自QIAGEN公司。
限制性内切酶：购自Takara公司。
重组酶：购自Novoprotein公司。
lipo3000试剂：购自Thermo Fisher公司。
Polybrene试剂：购自Thermo Fisher公司。
RMPI 1640培养基：购自gibco公司。
DMEM培养基：购自gibco公司。
Myc-Tag(9B11)Mouse mAb(PE Conjugate)：购自cell signaling公司。
293Fectin转染试剂：购自Invitrogen公司，货号12347500。
293Freestyle悬浮细胞：购自Thermo Fisher公司。
免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段：购自南京金斯瑞公司。
BCA法蛋白定量试剂盒：购自Pierce，货号为23252。
CBS抗原固定溶液：将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶于1L水中，调整pH值为9.6。
Anti-Human Fc HRP二抗：购自Thermo Fisher公司。
96孔底透板：购自Corning公司。
Biacore仪器：购自GE公司，T200。
Protein A芯片：购自GE公司。
实施例
一、定向抗CD19全人源抗体亚库构建
1.1利用噬菌体展示技术，基于费洛斯公司自主构建的全人源天然抗体库筛选获得抗人CD19特异性抗体亚库。
(1)建立全人源单链抗体的噬菌体抗体库：
设计引物扩增抗体的重链可变区和轻链可变区，通过重叠延伸PCR的方式用Linker将重链可变区和轻链可变区连接起来，得到全长的PCR产物，用SfiI酶切PCR产物和pCGMT3噬菌粒载体，将连接转化产物电转化入XL1-blue感受态细胞，然后向感受态细胞中加入3mL的SOC培养基，30℃培养1h后，加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，10μg/mL的四环素溶液20mL，37℃振荡培养2h。
然后加入浓度为1013/mL的VCSM13辅助噬菌体50μL，室温孵育1h，中间每隔10min轻摇一次。37℃振荡培养2h，再加入终浓度为70μg/mL的卡纳霉素，30℃过夜培养。离心收集上清，加入浓度为10％的PEG-8000/氯化钠溶液(PEG即聚乙二醇)，置于冰浴1h，8000rpm，4℃离心，弃上清液，用2mL浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液(磷酸缓冲液)充分溶解沉淀，离心收集上清液，即为全人单链抗体的噬菌体抗体库。
(2)抗体库筛选：
取200μL(含有噬菌体1×1012/mL)表达全人源单链抗体的噬菌体抗体库与5μgCD19抗原混合，室温孵育2小时后加入50μL的链霉亲和素磁珠，与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素磁珠捕获，未结合的噬菌体经0.5％Tween-20的PBS溶液(磷酸缓冲液)漂洗后被去除，用盐酸甘氨酸溶液(pH 2.2)将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。
接种XL1-Blue细菌20mL，待OD600(600nm波长处的吸光值，光密度)达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体，与XL1-Blue细菌在37℃静置30min，菌液涂布在氨苄青霉素抗性平板上，第二天洗脱收集氨苄抗性平板上的菌体，在侵染1×1012pfu/mL(pfu，plaque formingunit，噬菌斑形成单位)的M13辅助噬菌体后，扩增后进行下一轮筛选，共进行1-2轮筛选。
将侵染噬菌体的XL1-Blue菌液涂布于直径为15cm抗性为氨苄青霉素的LB固体培养基平板，培养后收集氨苄抗性平板上的菌液，用天根质粒小提中量试剂盒(DP106)提取质粒，即为抗人CD19特异性抗体亚库。
1.2慢病毒载体亚库构建:
慢病毒亚库的质粒图谱可参阅图1。质粒图谱包括信号肽序列、CD19结合结构域、检测标签、铰链区和跨膜结构域、功能性信号传导结构域、调节肽以及荧光报告基因：所述的信号肽序列包含CSF2RA；所述的检测标签包含C-myc；所述的CD19结合结构域包含scFv，该scFv包括所述的抗CD19的全人源抗体或抗体片段；所述的铰链区和跨膜结构域包含：铰链区Hinge TM和跨膜结构CD8，所述的功能性信号传导结构域包含：依次连接的CD28、4-1BB和CD3 Zeta。T2A为调节肽，EGFP为荧光信号。
(1)取抗人CD19抗体亚库质粒10μg和慢病毒载体质粒2μg，加入5μLSfiI进行酶切，50℃水浴酶切2h后胶回收酶切产物；
(2)将抗人CD19抗体亚库质粒sfiI酶切产物和慢病毒载体质粒酶切产物，16℃连接5h，用takara片段纯化试剂盒浓缩连接产物至20μL；
(3)取连接产物每4μL电穿孔转入100μL大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中，具体流程为：
a.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；
b.取4μL纯化后的质粒于1.5mL的离心管中，将其和0.1cm的电极杯一起置于冰上预冷；
c.将100μL解冻的感受态细胞转移至上述1.5mL的离心管中，小心混匀，冰上放置10min；
d.打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV，将混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部，将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μL的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到5mL的离心管中，再用两次500μL SOC清洗电击杯，都转移至5mL离心管中；
e.37℃，220-250rpm复苏1小时，取转化产物涂布抗性LB平板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。
(4)收集LB抗性平板的菌液，用天根质粒小提中量试剂盒(DP106)提取质粒，即为抗人CD19特异性抗体慢病毒亚库。
(5)随机挑选20个单克隆到含有3mL LB培养基及100ng/μL氨苄青霉素的14mL培养管中，37℃过夜培养，Sanger测序法验证序列的正确性。
实验结果：
Sanger测序结果分析慢病毒载体质粒中***完整的scFv抗体序列。
二、基于活细胞表面抗原-抗体的识别作用筛选特异结合CD19抗体及其CAR序列
2.1慢病毒亚库感染宿主细胞
将1.2中构建的抗人CD19特异性抗体慢病毒亚库通过脂质体或者电转的细胞转染方法导入宿主细胞中，得到含有特定配体基因的重组宿主细胞：
2.1.1慢病毒包装
转染前1天将6×106 293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，并加入10ml不含抗生素的完全培养基；准备复合物
(1)将10μg DNA和84μL P3000稀释于1.75ml Opti-MEM培养液中轻轻混匀。
(2)将70ul lipo3000稀释于1.75ml Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。
(3)5分钟后将它们混合，并轻轻混匀，室温孵育20分；吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次；加入6.5ml DMEM+10％FBS，将复合物(总体积3.6ml)加入培养孔，八字摇动培养板使其分布均匀；将细胞放入培养箱孵育4～6h后，更换含血清培养液去除复合物(也可不用)；24～72h后可以观察转入基因表达情况。
(4)72小时后收集病毒，用0.45um的滤器过滤并检测病毒滴度。
实验结果：
如图2所示，24小时后通过荧光显微镜可以观察到明显的绿色荧光信号，未浓缩的病毒滴度＞107IFU/ml。
2.1.2慢病毒感染
将收集的慢病毒根据MOI梯度感染宿主细胞jurkat。
将宿主细胞300g离心5min，重悬细胞，加入一定体积包装好的病毒溶液，1640+10％FBS补至1ml，加入感染增强剂polybrene至终浓度为8ug/ml混匀，800g离心1-2小时，放入培养箱子中培养，48-72小时用荧光显微镜初步观察荧光信号，并用流式细胞术确定感染效率，同时分选表现绿色荧光的宿主细胞。
实验结果：
如图3所示，48小时后通过荧光显微镜能观察到明显的绿色荧光，FACS检测感染效率为22.3％。
图4a为以空白宿主细胞jurkat为对照，通过细胞分选获得表达绿色荧光报告基因的细胞，即右图中Q2\Q3中的细胞群。
2.2利用流式细胞术筛选被靶细胞激活的宿主细胞
(1)准备Raji和K562细胞：细胞1000rpm离心5分钟，弃上清，重悬至1*106/ml；分选后的CAR-jurkat细胞计数2.5*105/ml，共5ml；准备12孔板，每孔加入1.5*105的jurkat细胞+3*105的Raji细胞，共8个孔；阴性对照孔中加入2.5*104的jurkat细胞+5*105的K562细胞；加入1640+10％FBS至培养体积为2ml，放入培养箱中培养；
(2)将孔板中细胞转移到离心管中，1000rpm离心5分钟；弃上清，用FACS buffer重悬至1*106/ml的密度；避光加入20μl/106cell的anti-CD69-APC荧光抗体，4℃孵育1小时，注意避光；FACS buffer洗两遍细胞，1000rpm离心5分钟；FACS buffer重悬，用滤网过滤至FACS专用试管中，放置冰上准备分选；分选后获得的细胞裂解获取DNA用于后续的PCR实验。
通过检测jurkat表面CD69分子的表达说明效应细胞jurkat被激活，即该效应细胞jurkat可以识别靶细胞表面的CD19抗原，其中CD69是T淋巴细胞激活后最早表达的表面抗原，图4b为将分选获得表达CAR基因的宿主细胞jurkat分别与阴性细胞K562、阳性细胞Raji共孵育，以阴性细胞为对照，通过细胞分选获得表现APC荧光信号的细胞，即右图中右侧的细胞群。
三、PCR及测序分析
3.1效应宿主细胞裂解
收集细胞分选获得的效应宿主细胞，3000rpm离心5分钟，弃净培养基上清，加入细胞裂解液20μl，混匀15s，65℃金属浴孵育6min；再次混匀15s，转移至98℃金属浴孵育2-5min，裂解后的DNA可以储存在-20℃，长期保存可以储存在-70℃，取5μl或者更少的量直接用来PCR扩增序列。
3.2 PCR及测序分析
(1)取1μl细胞裂解获得的DNA作为PCR模板，PCR反应体系为：5×PrimeSTAR GXLPCR buffer 10μL，dNTPs Mixture 4μL(2.5mM)，DNA模板2μL，上下游引物各1.5μL，GXL DNA聚合酶1μL，加超纯水至50μL。
(2)PCR反应条件：94℃变性5min；98℃10s，55℃/60℃15s，68℃1kb/min，共30个循环；72℃延伸10min。
(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证大小正确后，用胶回收试剂盒进行切胶回收。
(4)取回收的PCR产物10μl，加入5μl SfiI进行酶切，50℃水浴酶切2h后胶回收酶切产物；将PCR的sfiI酶切回收产物和慢病毒载体质粒酶切产物，16℃连接5h，取连接产物转入100μl大肠杆菌stbl3感受态细胞中，37℃活化1h，涂布氨苄LB平板，37℃过夜培养后挑取100个单克隆，进行sanger测序。
实验结果：挑取单克隆菌落，提取质粒经sanger测序获得8条富集程度较高的抗体序列C13、C20、C25、C135、1-B11、4-H3、3-F11、3-H5。
四、抗CD19全人源抗体特异性结合CD19抗原的能力验证
4.1纯化抗体与CD19抗原结合能力检测
(1)将步骤三中获得的8个测序单克隆质粒，经限制性内切酶SfiⅠ酶切后连接后通过重组的方法将片段接入pFUSE-mFc和pFUSE-hFc表达载体(pFUSE表达载体通过限制性内切酶SfiⅠ作用于酶切位点)中，其中C13、C20、C25、C135构建到pFUSE-mFc中，其中该质粒载体mFc是mouse Fc标签，4-H3、3-F11、3-H5、1-B11构建到pFUSE-hFc中，其中该质粒载体hFc是human Fc标签，由此获得本发明的抗体的pFUSE表达载体。C13、C20、C25、C135、1-B11、4-H3、3-F11、3-H5的具体核苷酸序列分别为：SEQ ID NO：1、9、17、25、33、41、49、57所示的序列。
(2)将293Fectin转染试剂与上述获得的真核抗体表达载体按照体积质量比为30μL：30μg的比例混合，加入30ml的293Freestyle悬浮细胞，在125rpm转速下37℃摇床培养48-72小时，离心后收集上清，采用HiTrap Protein A HP columns在
(3)将表达纯化的抗体稀释至200μM，与CD19抗原表达阳性的人源Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji孵育，4℃翻转孵育1h，用FACS buffer洗两遍细胞，分别加入1:1000稀释的羊抗人-APC抗体(图5a)和1:100稀释的羊抗鼠IgGmFc-PE抗体(图5b)，4℃孵育1h，用FACSbuffer洗两遍细胞，重悬于100μL FACS buffer中，流式细胞仪检测荧光信号。
实验结果：
如图5a、5b所示。图5a以高表达CD19的Raji细胞作为空白对照，FMC63为阳性对照，流式结果显示纯化抗体3-F11、4-H3、1-B11、3-H5都可以很好地识别Raji细胞表面的CD19抗原。图5b以高表达CD19的Raji细胞作为空白对照，FMC63为阳性对照，流式结果显示纯化抗体C135、C13、C20、C25都可以很好地识别Raji细胞表面的CD19抗原。
4.2anti-CD19-CAR特异识别CD19能力的验证
(1)将***正确anti-CD19-CAR序列的质粒通过慢病毒转染宿主细胞jurkat，通过荧光信号检测CAR的正确表达；
(2)将表达特定CAR的效应宿主细胞与抗原过表达的Raji细胞共同孵育24h，另外同时将表达特定CAR的效应宿主细胞与抗原无表达的K562细胞共同孵育24h；通过检测jurkat表面CD69分子的表达说明效应细胞jurkat被激活，即该效应细胞jurkat可以识别靶细胞表面的CD19抗原，其中CD69是T淋巴细胞激活后最早表达的表面抗原；
(3)离心后用FACS buffer重悬细胞，anti-CD69-APC抗体加入共同孵育的宿主细胞与Raji细胞/宿主细胞与K562细胞(C135、3-F11、3-H5、4-H3、1-B11)，anti-CD69-PE抗体加入共同孵育的宿主细胞与Raji细胞/宿主细胞与K562细胞中(C13、C20、C25)，4μL/sample重悬细胞，4度孵育1h，用流式缓冲液冲洗2次，0.1mL流式缓冲液重悬，以宿主细胞/不表达CD19的K562为阴性对照设门，宿主细胞/Raji细胞为空白对照，FMC63为阳性对照，以APC或PE(Jurkat表达的激活信号CD69)的荧光信号检测宿主细胞的激活比例，即anti-CD19-CAR特异性识别CD19抗原的能力。
实验结果：
如图6所示，与靶细胞孵育的效应宿主细胞jurkat的激活(anti-CD69-APC或anti-CD69-PE荧光抗体的检测)实验说明抗CD19的全人源抗体C13、C20、C25、C135、3-F11、4-H3、1-B11、3-H5都能够较好地识别Raji细胞表面的CD19。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 常州费洛斯药业科技有限公司
<120> 针对 CD19 的全人源抗体或抗体片段、嵌合抗原受体及应用
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcacagg tgcagctgca ggagtccggg ggaggcgtgg tccaggttgg gaggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtcatt atggcatgca ctgggtccgc 120
caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcacttattt catatgatgg aaccaataaa 180
ttttatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatcc cgagaacaca 240
ctgtttctgc aaatgaacag cctgagacct gaggacacgg ctgtctatta ctgtgcgaaa 300
gaatatagca gcagttggtt cttctttgac tcctggggcc cggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctcaggcg gcggcggctc tggcggaggt ggcagcggcg gtggcggatc cgacatcgtg 420
atgacccagt ctccatcatc cctgtcagca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 480
cgggcaagtc agacgattaa gaacttttta aattggtatc aacagaagcc aggagaagcc 540
cctaaactcc tgatctattc tgcatccact ttgcacagtg gggtcgcatc acgcttcagt 600
ggcagtggat ctgggacaga ttacactctc accatcaaca gtctgcaacc tgaagatttt 660
gcaacttact actgtcaaca gagctacaat atggtcactt tcggcggagg gaccaaggtg 720
gaaatcaaac gt 732
<210> 2
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Val
1 5 10 15
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
His Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Phe Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Glu Asn Thr
65 70 75 80
Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Glu Tyr Ser Ser Ser Trp Phe Phe Phe Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Thr Ile Lys Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu His
180 185 190
Ser Gly Val Ala Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Met Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Gly
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys
1 5
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Lys Glu Tyr Ser Ser Ser Trp Phe Phe Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Thr Ile Lys Asn Phe
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Ala Ser
1
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Gln Ser Tyr Asn Met Val Thr
1 5
<210> 9
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggcacagg tgcagctggt ggagtctgga ggaggcctga tccagcctgg ggggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggattcagc gtcagtagca accacatgag ctgggtccgc 120
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagttattt atggcgctgg taccacatac 180
tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacactg 240
tatcttcaaa taaacagcct gagagccgag gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
gcccagatcg gtaggagctt agcatacttc cagcactggg gccagggcac cctggtcacc 360
gtctcctcag gcggcggcgg cggcggatcc gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 420
ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc atcgcttgcc gggcgagtca gggtattagc 480
agttatttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat 540
gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat 600
ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtcaacag 660
agttacagta caccgtggac gttcggccaa gggaccaaag tggatatcaa acgt 714
<210> 10
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser
20 25 30
Ser Asn His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Val Ile Tyr Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ala Gln Ile Gly Arg Ser Leu Ala Tyr Phe Gln His
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
165 170 175
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
210 215 220
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
225 230 235
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Phe Ser Val Ser Ser Asn His
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ile Tyr Gly Ala Gly Thr Thr
1 5
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Arg Asp Ala Gln Ile Gly Arg Ser Leu Ala Tyr Phe Gln His
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<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggcacagg tgcagctaca gcagtggggc gcaggactgt tgaagccttc ggagaccctg 60
tccctcacct gcgctgtcta tggtgggtcc ttcagtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt ggggaaatca atcatagtgg aagcaccaac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgcg gacacggctg tgtattactg tgcgaggcgc 300
tcgagagtcc tcaaggggag tcaggactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcaggcggcg gcggctctgg cggaggtggc agcggcggtg gcggatccga catccagatg 420
acccagtctc catcctccct gtctgcgtct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 480
gcacctcaga gcattaagac ctatttaaat tggtatcagc acaaaccagg gaaagcccct 540
aagctcctga tctatggtgc atccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagtggc 600
agtggatctg ggacagactt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 660
acttactatt gtcaacagag ttacagtttg ttcactttcg gcggagggac caaggtggaa 720
atcaaacgt 729
<210> 18
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ser Arg Val Leu Lys Gly Ser Gln Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Pro Gln Ser Ile Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln His Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Ser Tyr Ser Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Asn His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Arg Arg Ser Arg Val Leu Lys Gly Ser Gln Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Ser Ile Lys Thr Tyr
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Ala Ser
1
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Gln Ser Tyr Ser Leu Phe Thr
1 5
<210> 25
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atggcacagg ttcagctggt ggagtctggg gggggcgtgg tccagcctgg gagggccctg 60
agactctcct gtgtagcctc tggattcacc ttcagtggtc atggcatgca ctgggtccgc 120
caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagtgatat cgtatgatgg aagcactgat 180
gactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagagcacg 240
ctgtatctgc atatgaacag tctgagagtt gaagacacgg ctgtgtatta ctgtgcgagt 300
cccggcaggg aagctatgga cgacccgcta ttctactacc acgctatgga cgtctggggc 360
caaggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggc ggcggcggct ctggcggagg tggcagcggc 420
ggtggcggat cccagtctgt gttgacgcag ccgccctcag tgtctggggc cccaggccag 480
agggtcacca tctcctgcac tgggagcagt tccaatatcg gggccgatta tgatgtacac 540
tggtaccagc acgtcccagg aaaagccccc aaattcctca tctttggtaa caacaatcgg 600
ccctcagggg tccctgaccg cttctctggc tccaagtctg gcacctcagc ctccctggcc 660
atcactgggc tccaggctga ggatgaaggt gattattact gtcagtccta tgacagtacc 720
ctgaatggat tgattttcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggt 768
<210> 26
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Arg Ala Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Gly His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Asp Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ser Pro Gly Arg Glu Ala Met Asp Asp Pro Leu Phe Tyr
100 105 110
Tyr His Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp
165 170 175
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe
180 185 190
Leu Ile Phe Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
210 215 220
Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Thr
225 230 235 240
Leu Asn Gly Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
245 250 255
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gly Phe Thr Phe Ser Gly His Gly
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Asp
1 5
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ala Ser Pro Gly Arg Glu Ala Met Asp Asp Pro Leu Phe Tyr Tyr His
1 5 10 15
Ala Met Asp Val
20
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp
1 5
<210> 31
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gly Asn Asn
1
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Leu Asn Gly Leu Ile
1 5 10
<210> 33
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atggcacagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atgacatgca ctgggtccgc 120
caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatct catatgatgg aagtaataaa 180
tactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240
cagtatctgc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaaa 300
gagtcctact acgaccccta ttactactac ggtatggacg tctggggcca aggaaccctg 360
gtcaccgtct cctcaggcgg cggcggctct ggcggaggtg gcagcggcgg tggcggatcc 420
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggttaccatc 480
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc aacaattatg tgcagtggta ccaacagcgc 540
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gacgatagcc aaagaccctc tggggtccct 600
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ctgaaaactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcgg cactgtgata 720
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta ggt 753
<210> 34
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Gln Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Lys Glu Ser Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu
130 135 140
Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Asn Asn Tyr Val Gln Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Asp Asp
180 185 190
Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp
195 200 205
Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Thr Val Ile
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
245 250
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ala Lys Glu Ser Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Ser Gly Ser Ile Ala Asn Asn Tyr
1 5
<210> 39
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Asp Asp Ser
1
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Thr Val Ile
1 5
<210> 41
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atggcacagg ttcagctggt acagtctggg gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg 60
aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct atgctatcag ctgggtgcga 120
caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggagggatca tccctatctt tggtacagca 180
aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca 240
gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300
gagctgggga tgggtggcta ctactactac ggtatggacg tctggggcca ggggaccacg 360
gtcaccgtct cctcaggcgg cggcggctct ggcggaggtg gcagcggcgg tggcggatcc 420
gacatcgtga tgacccagtc tccactctcc ctggccgtca cccctggaga gccggcctcc 480
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catactaatg catacaacta tttggattgg 540
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 600
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 660
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtcg acaaactccg 720
tacacttttg gccaagggac caaagtggat atcaaacgt 759
<210> 42
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Gly Met Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser
145 150 155 160
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Asn Ala Tyr Asn
165 170 175
Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
210 215 220
Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Arg Gln Thr Pro
225 230 235 240
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
245 250
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Ala Arg Glu Leu Gly Met Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gln Ser Leu Leu His Thr Asn Ala Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Leu Gly Ser
1
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Met Gln Gly Arg Gln Thr Pro Tyr Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atggcacagg ttcagctggt acagtctggg tctgaattga aggagcctgg ggcctcagtg 60
agggtttcct gcaaggcttc tggatacacc ttccctaggt atgctatgaa ttgggtgcga 120
caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggatggatcg acaccaacac tgggaaccca 180
acgtatgccc agggcttcac aggacggttt gtcttctcct tggacacctc tgtcagcacg 240
gcatatctgc agatcagcag cctaaaggct gaggacactg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300
ggcctgtctt actactacta catggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tcaggcggtg gcggatccga aattgtgctg actcagtctc caggcaccct gtctttgtct 420
ccaggggatg tagtcaccct ttcctgcagg gccagtcaga gtgttatcag cagctactta 480
gcctggtacc agcagaaacc tggccaggct cccaggctcc tcatctatgg tgcgtccagc 540
agggccactg gcatcccaga caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga cttcactctc 600
accatcagca gactggagcc tgaagatttt gcagtgtatt actgtcagca gtatggtagc 660
tcacctccct ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaga tcaaacgt 708
<210> 50
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Glu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro
20 25 30
Arg Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Trp Ile Asp Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln
50 55 60
Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
115 120 125
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Val
130 135 140
Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Ser Ser Tyr Leu
145 150 155 160
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
165 170 175
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
195 200 205
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Trp
210 215 220
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gly Tyr Thr Phe Pro Arg Tyr Ala
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ile Asp Thr Asn Thr Gly Asn Pro
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Ala Arg Gly Leu Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Ser Val Ile Ser Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Ala Ser
1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atggcacagg tacagctgca gcagtcagga actgaagtgg taaagcctgg ggcttcagtg 60
aagttgtcct gcaaggcttc tggctacatc ttcacaagtt atgatataga ctgggtgagg 120
cagacgcctg aacagggact tgagtggatt ggatggattt ttcctggaga ggggagtact 180
gaatacaatg agaagttcaa gggcagggcc acactgagtg tagacaagtc ctccagcaca 240
gcctatatgg agctcactag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgctaga 300
ggggactact ataggcgcta ctttgacttg tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tcaggcggcg gctctggcgg aggtggcagc ggcggtggcg gatccgaaat tgtgttgacg 420
cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc 480
agtcagagtg ttagcagcag ctacttagcc tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc 540
aggctcctca tctatggtgc atccagcagg gccactggca tcccagacag gttcagtggc 600
agtgggtctg ggacagactt cactctcacc atcagcagac tggagcctga agattttgca 660
gtgtattact gtcagcaata tggtacctca cccctcacct tcggcggggg gaccaaggtg 720
gagatcaaac gt 732
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<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
180 185 190
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
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<400> 63
Gly Ala Ser
1
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Leu Thr
1 5
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