阅读说明：本技术 一种脂肪酶高产菌株及其应用 (Lipase high-yield strain and application thereof ) 是由 宋清清 李�瑞 黄亦钧 张金祥 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物工程改造技术领域,提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉突变菌株及其应用。所述突变菌株是通过紫外诱变筛选获得的,保藏编号为CCTCC NO：M2019944。所述菌株可广泛应用于脂肪酶的生产,从而有利于降低脂肪酶的生产成本,促进其在水产饲料添加剂、油脂加工、精细化学品、医药中间体等领域中的推广与应用。(The invention belongs to the technical field of microbial engineering modification, and provides a Trichoderma reesei mutant strain with high lipase yield and application thereof. The mutant strain is obtained by ultraviolet mutagenesis screening, and the preservation number is CCTCC NO: m2019944. The strain can be widely applied to the production of lipase, thereby being beneficial to reducing the production cost of the lipase and promoting the popularization and application of the strain in the fields of aquatic feed additives, grease processing, fine chemicals, medical intermediates and the like.)

一种脂肪酶高产菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物改造技术领域，具体涉及一种稳定高效脂肪酶的里氏木霉及其在脂肪酶生产中的应用。

背景技术

脂肪酶（EC3.1.l.3）又称为三酰基甘油酯水解酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外，还表现出如磷脂酶、溶血磷脂酶和胆固醇酯酶活性等。

脂肪酶的催化特性与其他水解酶不同，其水解反应是一种非均相体系，只有在底物(水不溶性)和水的界面溶于水的酶才会催化底物反应，而水溶性的底物则不会被催化，即脂肪酶在油水界面上的催化活力最大。脂肪酶催化反应具有立体选择性、底物专一性、副反应少、反应条件温和、不需辅酶及可用于有机溶剂等特点，在食品、皮革、生物柴油、医疗医药和洗涤剂等多个生产领域都有应用，如用于合成食品调味料，作为添加剂应用于洗涤剂中，手性药物拆分和精细化学产品的合成等。

早在100多年前，就有人开始从事脂肪酶的研究。随着兔胰脂肪酶、胃脂肪酶和植物种子脂肪酶的相继报道，微生物脂肪酶在20纪初也被发现。微生物脂肪酶的研究虽然起步较晚，但脂肪酶在微生物中有广泛的分布，因而近30年来，深入研究的微生物脂肪酶不断增加，并应用到了工业生产中，其中曲霉、根霉、毛霉、假单胞菌、地细菌、芽孢杆菌等是主要生产菌。根据初步估计，自然界中的微生物大约有65个属可产脂肪酶，其中放线菌4个属，细菌28个属，酵母10个属，其他真菌23个属，但事实上，脂肪酶在微生物群落的分布已远远超过了这个数字。由于微生物种类繁多，易于培养，可通过育种手段提高产酶量，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，因而，从微生物代谢产物中寻求脂肪酶成为科研工作者的研究热点。

近年来，我国在微生物产脂肪酶的菌种筛选、工业发酵条件优化、基因工程方面均有深入研究。和国外相比，我国对脂肪酶的研究和开发起步较晚，而且工业化的微生物脂肪酶酶制剂种类有限，因此，筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，运用高端的基因工程技术改善野生菌产酶量低的特性及开发脂肪酶新品种等仍需深入研究，以拓宽其应用领域，满足各个相关工业领域的需求。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种稳定、高产脂肪酶的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株。申请人首先将来源于南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶基因转化入里氏木霉宿主细胞中，构建得到重组表达脂肪酶的里氏木霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株脂肪酶产量得到显著提高的突变菌株，可应用于脂肪酶的生产，有助于降低生产成本，推动脂肪酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有脂肪酶基因。

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌株，其携带上述重组质粒。

本发明还提供了一种突变菌株里氏木霉UE-CALB（Trichoderma reesei UE-CALB），已于2019年11月18日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2019944。

本发明还提供了所述里氏木霉突变菌株在生产脂肪酶中的应用。

本发明所述突变菌株里氏木霉UE-CALB 20L罐发酵160h 后，其发酵上清液中脂肪酶酶活达到7500 LU/ml，总蛋白量达到11g/L，比出发菌株分别提高了150%和80.3%。所述里氏木霉突变菌株重组表达的脂肪酶最适作用pH为8.0，最适作用温度为45℃。所述菌株可广泛应用于脂肪酶的生产，从而有利于降低脂肪酶的生产成本，促进其在水产饲料添加剂、油脂加工、精细化学品、医药中间体等领域中的推广与应用。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

实施例1 脂肪酶基因的合成及扩增

根据NCBI公布的脂肪酶CALB的基因序列（GeneBank Z30645.1），在其起始密码子ATG前增加8个碱基TCTAGAGC (下划线所示为XbaI酶切位点)，在其终止密码子TGA后增加8个碱基CGACGCGT(下划线所示为MluI酶切位点)，然后将此序列根据里氏木霉密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

用限制性内切酶XbaI和MluI(Fermentas)对脂肪酶基因进行酶切；同时用限制性内切酶XbaI和MluI对质粒pTG进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。

使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒为pTG-calb。

实施例2 里氏木霉工程菌株的构建

1、原生质体制备：

接种里氏木霉宿主细胞于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％）培养基中，30℃培养16h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 0.7 M氯化钠溶液重悬； 加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层200目涤纶网过滤，3000rpm 离心10min获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、转化：

将上述获得的里氏木霉原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pTG-calb，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。

3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基（葡萄糖1％；乳糖2％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.9％；硫酸镁0.15％；柠檬酸0.073％；氯化钙0.1125％；微量元素0.1％）中发酵，30℃培养2d后降温至25℃继续培养3d。培养结束后，离心菌体获得上清液，分别进行SDS-PAGE蛋白电泳检测和脂肪酶酶活力检测。

电泳结果显示，本发明构建得到的里氏木霉重组菌株发酵上清液在33kD处都有目的蛋白条带，与本发明所述脂肪酶CALB的理论分子量一致，从而表明，本发明构建得到的重组菌株都能有效表达脂肪酶CALB。申请人从将发酵上清液中脂肪酶酶活最高的一株重组菌株，命名为里氏木霉UE-calb（Trichoderma reesei UE-calb），其发酵上清液中脂肪酶酶活为85 LU/mL。

脂肪酶酶活力测定方法

根据《GB/T 23535 脂肪酶制剂》所述方法检测里氏木霉发酵液酶活，酶活力定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），在30℃，pH8.0的条件下，1min水解三丁酸甘油酯产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以 LU/g（LU/ml）表示。

实施例3 诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以里氏木霉UE-calb为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其脂肪酶的产量。

1、确定致死率：

将里氏木霉UE-calb接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷个/mL），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布220块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出40-60个菌落，先通过菌落形态，筛选出短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共85个，分别接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，30℃培养2d后降温至25℃继续培养3d。培养结束后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行脂肪酶活力检测，同时以出发菌株里氏木霉工程菌UE-calb作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的85株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中脂肪酶的酶活高于出发菌；其中，80株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余5株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了8-10%。

申请人按照上述方法继续进行了13轮诱变筛选，最终获得1株脂肪酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为里氏木霉UE-CALB。里氏木霉UE-CALB摇瓶发酵上清液中脂肪酶的酶活最高，达225 LU/ml，比出发菌提高了165%。

进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉UE-calb和上述突变菌株里氏木霉UE-CALB分别在20L罐中进行发酵。发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行脂肪酶活力检测。

结果显示，出发菌株里氏木霉UE-calb发酵上清液中脂肪酶酶活为3000 LU/ml，蛋白量6.1g/L，而突变菌株里氏木霉UE-CALB的发酵上清液中脂肪酶酶活高达7500 LU/ml，蛋白量11g/L，比出发菌株分别提高了150%和80.3%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年11月18日将该突变菌株里氏木霉UE-CALB（Trichoderma reesei UE-CALB）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2019944。

实施例4 酶学性质分析

1、最适作用pH

分别配制pH 5.0、6.5、7.0、8.0、9.0的磷酸盐缓冲液，将突变菌里氏木霉UE-CALB的发酵上清液分别用上述缓冲液稀释至合适的浓度，然后按照GB/T 23535所述方法测定发酵上清液中脂肪酶的酶活力。以原始酶活为100%，计算脂肪酶的相对酶活。结果显示，里氏木霉UE-CALB重组表达的脂肪酶最适作用pH为8.0。

2、最适作用温度

将突变菌里氏木霉UE-CALB的发酵上清液用上述pH7.0的缓冲液稀释至合适的浓度，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下，按照GB/T 23535所述方法测定发酵上清液中脂肪酶的酶活力。以原始酶活为100%，计算不同温度条件下脂肪酶的相对酶活。结果显示，里氏木霉UE-CALB重组表达的脂肪酶最适作用温度为45℃。

所述脂肪酶可广泛应用于水产饲料添加剂、油脂加工、精细化学品、医药中间体等领域。