具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明涉及到的培养基成分组成及配制方法如下所示：

木霉完全培养基的成分为：20mL/L木霉盐溶液，10mL/L维生素溶液，1.5g/L酪蛋白氨基酸，10g/L葡萄糖，3g/L YEP，其余为970mL ddH₂O。所述木霉盐溶液的成分为：26g/LKCl，26g/L MgSO₄·7H₂O，76g/L KH₂PO₄，50mL/L木霉微量元素溶液；所述木霉微量元素溶液的成分为：40mg/L Na₂B₄O₇·10H₂O，400mg/L CuSO₄·5H₂O，800mg/L Fe₂(SO₄)₃·2H₂O，800mg/L MnSO₄·2H₂O，8mg/L ZnSO₄·7H₂O。所述维生素溶液(100mL)依次称量以下试剂：维生素B1 5mg、生物素1mg、烟酸10mg、D-泛酸钙20mg、吡哆醇HCl 5mg、核黄素10mg、对氨基苯甲酸50mg，余量为水。

木霉琼脂培养基成分如下：10g/L葡萄糖，2g/L玉米浆，2.8g/L KH₂PO₄，3.92g/L(NH₄)₂SO₄，0.84g/L MgSO₄·7H₂O，0.84g/L尿素，2g/L吐温-80，0.014g/L FeSO₄·7H₂O，0.00436g/L MnSO₄·H₂O，0.00392g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0056g/L CoCl₂，20g/L琼脂；配制好之后，用2M的NaOH溶液调节pH至4.8。之后于高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃，25min)；待温度冷却至45-50℃(以不烫手为宜)，于超净工作台中加入氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)，后倒塑料培养皿冷却待用。

木霉种子培养基成分如下：12g/L葡萄糖，0.7g/L玉米浆，1.96g/L KH₂PO₄，1.372g/L(NH₄)₂SO₄，0.294g/L MgSO₄·7H₂O，0.294g/L尿素，0.0049g/L FeSO₄·7H₂O，0.0015g/LMnSO₄·H₂O，0.0014g/L ZnSO₄·7H₂O，0.002g/L CoCl₂。配制好之后于高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃，25min)。

本发明涉及到的试剂成分组成及配制方法如下所示：

MW试剂的成分为：147.9g/L MgSO₄·7H₂O。

OM试剂的成分为：295.8g/L MgSO₄·7H₂O，10mL 1M的磷酸缓冲液(pH 6.5)，调节pH至5.8；其中1M的磷酸缓冲液(pH 6.5)的成分为：268.1g/L Na₂HPO₄·7H₂O，120g/L NaH₂PO₄，调节pH至6.5。

STC试剂的成分为：218.64g/L山梨糖醇，10mL 1M的CaCl₂，10ml 1M的Tris(pH7.5)，微调pH至7.5；其中1M的CaCl₂的成分为：111g/L无水CaCl₂；1M的Tris(pH 7.5)的成分为：121g/L Tris-base，调节pH至7.5。

本发明使用的线性PEG及多臂PEG均购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司，具体配制方法如下：

25％线性PEG4000溶液的成分为：250g/L PEG4000，50mL 1M的CaCl₂，10mL 1M的Tris(pH 7.5)，微调pH至7.5。

25％线性PEG6000溶液的成分为：250g/L PEG6000，50mL 1M的CaCl₂，10mL 1M的Tris(pH 7.5)，微调pH至7.5。

25％双臂PEG4000溶液的成分为：250g/L双臂PEG4000，50mL 1M的CaCl₂，10mL 1M的Tris(pH 7.5)，微调pH至7.5。

25％双臂PEG6000溶液的成分为：250g/L双臂PEG6000，50mL 1M的CaCl₂，10mL 1M的Tris(pH 7.5)，微调pH至7.5。

25％三臂PEG4000溶液的成分为：250g/L三臂PEG4000，50mL 1M的CaCl₂，10mL 1M的Tris(pH 7.5)，微调pH至7.5。

25％三臂PEG6000溶液的成分为：250g/L三臂PEG6000，50mL 1M的CaCl₂，10mL 1M的Tris(pH 7.5)，微调pH至7.5。

实施例1里氏木霉RUT-C30原生质体遗传转化方法

(1)里氏木霉RUT-C30原生质体提取

S1:在灭菌后的250mL木霉完全培养基中接入孢子悬浮液，过夜培养15h获得菌丝；

S2：将S1培养的菌丝过滤掉培养基，取25mL MW试剂洗涤菌丝，称取3g菌丝放置于50mL离心管中，向上述装有菌丝的离心管中加入OM试剂至15mL刻度线，摇动离心管使菌丝分散均匀；

S3：称取0.225g裂解酶(Sigma L1412)溶于5mL OM试剂中，用0.22μm滤膜过滤除菌后转移至步骤S2中装有菌丝、OM试剂的离心管中，并继续用OM试剂定容至22.5mL刻度线，混匀；将上述混合物转移至250mL的玻璃烧杯中，用锡箔纸包住，于30℃培养箱中静置酶解2.5h；取1μL酶解2.5h的酶解液，稀释10倍后于显微镜下计数，得到浓度为8.9×10⁶个/mL的原生质体；

S4：向上述酶解2.5h的酶解液中加入等量STC试剂，轻轻晃动混匀后通过G2砂芯玻璃漏斗过滤至50mL圆底离心管中，离心8min沉淀原生质体，将上清液倒掉，离心管置于冰上，加入10mL STC试剂，转动离心管，溶解原生质体；再离心8min，沉淀原生质体，原生质体沉淀聚集物如图2A所示；

S5：将上清液倒掉，离心管置于冰上，加入500μL STC试剂，转动离心管，溶解原生质体；取1μL上述原生质体，稀释10倍后于显微镜下计数，获得终浓度为2.56×10⁸个/mL的原生质体，显微镜下原生质体状态如图2B所示。

(2)里氏木霉RUT-C30原生质体转化

S6：将上述提取的原生质体分装到50mL离心管中，每个离心管中200μL原生质体，置于冰上，向离心管中各加入5μg外源质粒(PAN7-1质粒，图谱如图1所示)，50μL 25％的线性PEG 6000溶液，混匀，将离心管置于冰上反应20min；

S7：倾斜离心管，向其中缓慢贴壁加入2mL 25％的线性PEG6000溶液，室温培养5min，再向其中加入8mL STC试剂，离心8min，沉淀原生质体，将上清液倒掉，加入100μL STC试剂，转动离心管，溶解原生质体；

S8：用无菌吸管将转化后的原生质体(转化株)转移到木霉筛选培养基上，涂匀，于30℃霉菌培养箱中培养约5-7天后挑取22株转化株，再转移至木霉琼脂培养基中扩繁，之后刮取孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至木霉种子培养基过夜培养获得菌丝。

本实施例所述的木霉筛选培养基成分为：1M山梨糖醇，20g/L葡萄糖，15g/LKH₂PO₄，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.6g/L CaCl₂，0.005g/L FeSO₄·7H₂O，0.0016g/L MnSO₄·H₂O，0.0014g/L ZnSO₄·7H₂O，0.002g/L CoCl₂，20g/L琼脂粉。配制完成后于高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃，25min)，待温度冷却至45-50℃，于超净工作台中加入潮霉素B(终浓度175μg/mL)和氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)，冷却待用。

(3)阳性转化株检测

将22个过夜培养的转化株菌丝以及RUT-C30菌株使用天根生化科技有限公司的快捷型植物基因组DNA提取系统(DP-321)提取DNA，操作步骤和试剂成分见DP-321说明书。将提取的DNA作为模板DNA，使用pAN7-F、pAN7-R引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，验证上述转化株是否转化成功。

其中，PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳程序、流程如下：

(1)PCR扩增

PCR反应体系(20μL)如下：

PCR扩增程序如下：

(2)琼脂糖凝胶电泳

用电泳缓冲液TAE(1×)配制1％的琼脂糖凝胶，微波炉加热至完全溶解。取出摇匀，待冷却至不烫手时加入核酸染料(Genegreen，天根生化科技有限公司)，后轻轻倒入插好样品梳的电泳槽水平板上。待琼脂糖凝胶凝固后，小心拔出梳子，将带有凝胶的电泳槽水平板放入电泳槽中，加好电泳缓冲液TAE(1×)。

将适宜大小的Marker和PCR样品点在样品槽中，点样量5-10μL，并记录样品点样次序。调节电压100-150V，电泳20-30min，之后取出凝胶，置于G-box中蓝光照射，用GeneSys软件查看及分析电泳条带，其中5个产物存在目的条带，条带如图3。将这5个PCR产物送测序，测序结果能与质粒上的目的片段完全比对，如图4，证明这5个转化株均为阳性转化株(阳性率为23％)。

实施例2里氏木霉RUT-C30原生质体提取条件优化

(1)菌丝培养时间和酶解时间的筛选

菌丝的培养时间直接影响到原生质体的产量和状态，这是因为不同年龄阶段的菌丝由于细胞壁厚度、组分等存在差异，导致其对于酶的敏感度不同。幼嫩的菌丝细胞壁更薄、组分更简单，故相对于年老的菌丝更易被酶解，但过于幼嫩的菌丝不能正常产生数量大、质量好的原生质体。因此需要对菌丝的培养时间进行探索，以便于取得量大质优的原生质体。其次，菌丝的酶解时间也对原生质体产量、质量有很大影响。酶解时间过短，菌丝不能得到充分酶解，便无法获得原生质体；酶解时间过长，酶液也对原生质体造成破坏，原生质体产量、活性反而也会下降，影响转化及再生效果。

为了确定最佳的菌丝培养时间和酶解时间，在5mg/mL酶浓度、30℃、100rpm的酶解条件下，分别将培养时间(13h、15h)和酶解时间(1h，1.5h、2h、2.5h、3h)组合起来作为变量。本发明做了十组对比实验，每组实验设置三次重复，并对每组实验原生质体在特定时间下的产量取平均值。结果如图5，在5mg/mL酶浓度、30℃、100rpm的酶解条件下，培养13h的菌丝且酶解1.5h所获得的原生质体产量最高，为6.1×10⁴个/mL；培养15h的菌丝且酶解2.5h获得的原生质体产量最高，为3.1×10⁵个/mL。此外，通过镜检发现培养15h的菌丝，酶解2.5h后得到的原生质体的整体状态更饱满圆润、且大小均一。

因此，可知菌丝最佳培养时间为15h，最佳酶解时间为2.5h。在此参数下，所获得的原生质体产量最高，且状态良好。

(2)酶浓度的筛选

丝状真菌细胞壁组分主要是几丁质、蛋白质、脂类和葡聚糖等。本发明使用的裂解酶为Sigma L1412(来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的裂解酶)，主要具有β-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性。原生质体细胞膜主要由脂类、蛋白质和葡聚糖等组成。所以，酶解液不仅对细胞壁会造成裂解破坏，对原生质体的细胞膜也会起到一定的酶解作用。因此，酶解液中的酶浓度应该维持在一个适当的水平，既要保证细胞壁的去除，又要避免原生质体受到过度破坏。

为了确定最佳的酶浓度，在30℃、100rpm的酶解条件下酶解培养15h的菌丝2.5h，并将酶浓度作为单一变量，设置2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和20mg/mL四个酶浓度梯度。本发明做了四组对比实验，每组实验设置三次重复，并对每组实验原生质体在特定酶浓度下的产量取平均值。结果如图6所示，在2.5、5、10、15、20mg/mL的酶浓度下，分别能够获得浓度为0.81×10⁵、3.1×10⁵、9.5×10⁵、11×10⁵、9.82×10⁵个/mL的原生质体。

虽然在15mg/mL的酶浓度下，获得的原生质体产量最高，但是镜检显示，在15、20mg/mL酶浓度下，原生质体形态开始变形、变差；在10mg/mL酶浓度下获得的原生质体产量虽然稍低于在15mg/mL酶浓度下获得的产量，但是产量差距不大，同时原生质体状态圆润、饱满，更加适宜转化、再生。

因此，可知菌丝酶解的最佳酶浓度为10mg/mL，在此参数下，所获得的原生质体产量最高，且状态良好。

(3)酶解条件的筛选

酶解条件也是会影响到原生质体生成的关键所在，考虑到木霉生长的最适温度为30℃，本发明将酶解温度定为30℃。为了确定菌丝最佳的酶解条件，以10mg/mL的酶浓度，对培养15h的菌丝酶解2.5h，并将酶解条件作为单一变量，设置30℃和0rpm、30℃和50rpm、30℃和100rpm，各取酶解液于显微镜下观察计数。本发明做了三组对比实验，每组实验设置三次重复，并对每组实验原生质体在特定酶解条件下的产量取平均值。结果如图7所示，在30℃和0rpm的酶解条件下，显微镜下计数得到的原生质体产量为8.9×10⁶个/mL；在30℃和50rpm的酶解条件下，原生质体产量为2.92×10⁶个/mL；在30℃和100rpm的酶解条件下，原生质体产量为9.5×10⁵个/mL。

因此，可知菌丝的最佳酶解条件为30℃和0rpm，在此参数下，所获得的原生质体产量最高，且状态良好。

(4)原生质体收集方法的筛选

为了确定最佳的原生质体收集方法，在30℃和0rpm的酶解条件、10mg/mL的酶浓度下，对培养15h的菌丝酶解2.5h，并将原生质体收集方式作为单一变量，设置buffer(0.6M山梨糖醇，0.1M Tris-HCl，pH 7.0)抽提法、G2砂芯漏斗(孔径30-50μm，鹿头牌)过滤后离心法、400目细胞过滤筛(孔径37.5μm，Solarbio/索莱宝)过滤后离心法、Miracloth神奇滤布(孔径22-25μm，Merck Millipore/默克密理博)过滤后离心法，以此四种方法对酶解结束的原生质体进行收集。

结果如图8所示，利用抽提法收集到的原生质体，产量非常低，而且状态差，并混有大量菌丝；利用400目细胞过滤筛、Miracloth神奇滤布过滤收集的原生质体产量也非常低，离心后几乎肉眼看不到原生质体沉淀物存在。

而经G2砂芯漏斗过滤、洗涤并经过离心后能够收集到明显肉眼可见的原生质体聚集沉淀(图2A)。将沉淀用500μL STC试剂轻柔溶解，收集到浓度为2.56×10⁸个/mL且状态良好的原生质体(图2B)(前期酶解体系为20mL，原酶解液中原生质体浓度为8.9×10⁶个/mL，原生质体回收率为72％)。

因此，可知原生质体最佳的收集方式为G2砂芯漏斗过滤、洗涤、离心法，在此方法下，所获得的原生质体产量最高，且状态良好。

实施例3里氏木霉RUT-C30原生质体转化条件优化

在原生质体转化过程中需要加入聚乙二醇(PEG)溶液，原理是：PEG能在原生质体与外源DNA之间形成分子桥，促进两者相互粘连形成沉淀，同时还造成原生质体细胞膜表面电荷紊乱，从而改变细胞膜的通透性，促进原生质体吸收外源DNA。基于此，发明人在转化过程中试图通过加入不同分子结构的PEG溶液来促使外源DNA与原生质体融合，提高原生质体的阳性转化率。

A：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式同实施例1，在原生质体转化中，将PEG6000替换为PEG4000，浓度不变，其余操作同实施例1。

B：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式同实施例1，在原生质体转化中，将PEG6000替换为双臂PEG(分子量4000)，其余操作同实施例1。

C：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式同实施例1，在原生质体转化中，将PEG6000替换为双臂PEG(分子量6000)，其余操作同实施例1。

D：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式同实施例1，在原生质体转化中，将PEG6000替换为三臂PEG(分子量4000)，其余操作同实施例1。

E：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式同实施例1，在原生质体转化中，将PEG6000替换为三臂PEG(分子量6000)，其余操作同实施例1。

按照如实施例1所述的方法在木霉筛选培养基上挑取22株转化株进行扩繁培养，最终获得22个转化株菌丝。以菌丝DNA作为模板DNA，使用pAN7-F、pAN7-R引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，验证上述转化株是否转化成功。检测结果如下表所示：

表1

根据上表给出的数据可以看出，PEG作为原生质体与外源DNA的桥梁对外源DNA是否融入原生质体中具有重要的影响作用。同时，发明人还发现，PEG的分子量对转化株的阳性转化率没有影响，而PEG的臂数对阳性转化率有实质的影响，随着PEG臂数的增加，转化株的阳性转化株数量也在增加。这是因为当PEG为双臂或者三臂时，与线性PEG相比，对原生质体与外源DNA的连接作用更好，使外源DNA更好融入原生质体中。

实施例4木霉筛选培养基优化

本发明技术人员在试验中预料不到的发现，在常规木霉筛选培养基的基础上添加0.5-1.5g/L甜菜碱，10-15mL/L蒲公英浸出液，本发明命名为增强筛选培养基，最终筛选得到的里氏木霉转化株的阳性率更高。为了优选最佳添加比例，本发明分别设置如下3种浓度的增强筛选培养基。

木霉筛选培养基成分为：1M山梨糖醇，20g/L葡萄糖，15g/L KH₂PO₄，5g/L(NH₄)₂SO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，0.6g/L CaCl₂，0.005g/L FeSO₄·7H₂O，0.0016g/L MnSO₄·H₂O，0.0014g/L ZnSO₄·7H₂O，0.002g/L CoCl₂，20g/L琼脂粉。配制完成后于高压蒸汽灭菌锅中灭菌(121℃，25min)，待温度冷却至45-50℃，于超净工作台中加入潮霉素B(终浓度175μg/mL)和氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)，冷却待用。

A：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式和转化方法同实施例1，将转化后的原生质体(转化株)转移到增强筛选培养基Ⅰ上，涂匀，于30℃霉菌培养箱中培养约5-7天后挑取22株转化株，再转移至木霉琼脂培养基中扩繁，之后刮取孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至木霉种子培养基过夜培养获得菌丝。

B：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式和转化方法同实施例1，将转化后的原生质体(转化株)转移到增强筛选培养基Ⅱ上，涂匀，于30℃霉菌培养箱中培养约5-7天后挑取22株转化株，再转移至木霉琼脂培养基中扩繁，之后刮取孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至木霉种子培养基过夜培养获得菌丝。

C：里氏木霉RUT-C30原生质体提取方式和转化方法同实施例1，将转化后的原生质体(转化株)转移到增强筛选培养基Ⅲ上，涂匀，于30℃霉菌培养箱中培养约5-7天后挑取22株转化株，再转移至木霉琼脂培养基中扩繁，之后刮取孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种至木霉种子培养基过夜培养获得菌丝。

以获得的菌丝的DNA作为模板DNA，使用与实施例1相同的方法检测阳性转化率，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳发现目的条带，将条带上的PCR产物送测序，结果送检的产物序列均能与质粒上的目的片段完全比对，目标条带对应的转化株均为阳性转化株，数量如下表所示。

表2

从上表数据可以看到，与原始的筛选培养基相比，当筛选培养基中添加不同浓度的甜菜碱和蒲公英浸出液后阳性转化率均有所上升，主要是因为随着甜菜碱和蒲公英的加入量增大，甜菜碱和蒲公英起到的杀菌作用会将一部分假阳性抗潮霉素菌种消除，使挑取到的转化株中含有抗潮霉素基因的菌株更多，致使检测得到的阳性转化率更高。其中，当甜菜碱浓度为1.5g/L，蒲公英浸出液浓度为15mL/L时，里氏木霉原生质体阳性转化率最高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

上海汉禾生物新材料科技有限公司

<120> 一种里氏木霉RUT-C30原生质体遗传转化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttcagtgg actcgagtac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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